細(xì)胞培養(yǎng)工藝的放大及規(guī)?？s小模型的建立

摘要：本文以表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，采用產(chǎn)物表達(dá)和產(chǎn)品質(zhì)量均有一定保證的細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝在2 L反應(yīng)器和200 L反應(yīng)器進(jìn)行了放大和縮小的實(shí)施，建立了放大和縮小模型及策略，為穩(wěn)定、可靠的生產(chǎn)單克隆抗體藥物提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；放大和縮小

引言：抗體藥物的大規(guī)模生產(chǎn)都是在大規(guī)模反應(yīng)器上進(jìn)行的，當(dāng)前國(guó)內(nèi)的反應(yīng)器規(guī)模一般為200 L、500 L的中試規(guī)模，1000 L和5000 L的生產(chǎn)規(guī)模，而國(guó)外大規(guī)模生產(chǎn)的反應(yīng)器達(dá)到了15000 L規(guī)模。培養(yǎng)工藝的反應(yīng)器放大，一直以來(lái)都是工業(yè)界具有挑戰(zhàn)性的工作。一方面，如何從小反應(yīng)器放大至大型反應(yīng)器在當(dāng)今工業(yè)界仍是較為復(fù)雜和困難的。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大型反應(yīng)器由于混合和傳質(zhì)效果下降會(huì)引起二氧化碳排除變差[1-3]、混合時(shí)間變長(zhǎng)等現(xiàn)象[4]，進(jìn)而導(dǎo)致小規(guī)模反應(yīng)器建立的培養(yǎng)工藝放大至生產(chǎn)規(guī)模時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞密度降低[5]、培養(yǎng)周期縮短、產(chǎn)量大幅下降[3]或者產(chǎn)物質(zhì)量難以控制等一系列問(wèn)題[6]。對(duì)反應(yīng)器工藝的放大提出了較大的挑戰(zhàn)。另一方面，近年來(lái)隨著質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Quality by Design，QbD）的理念[7]在生物制藥領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用[8]，越來(lái)越多的企業(yè)開(kāi)始在工藝的開(kāi)發(fā)階段應(yīng)用QbD的理念。因此如何穩(wěn)定可靠的進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，這就使得需要建立合適的規(guī)?？s小模型，并在規(guī)?？s小模型上對(duì)過(guò)程工藝參數(shù)進(jìn)行研究，確定參數(shù)對(duì)CQA的影響，從而明確工藝參數(shù)的控制范圍，對(duì)于大型反應(yīng)器的穩(wěn)定可靠的生產(chǎn)有著十分重要的意義。

1流加培養(yǎng)工藝的規(guī)模放大與縮小

1.1操作參數(shù)的放大與縮小

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)可以分為兩類(lèi)：與體積相關(guān)的參數(shù)和與體積無(wú)關(guān)的參數(shù)。其中pH、DO和溫度不隨反應(yīng)器尺寸發(fā)生變化，因此這些參數(shù)的在放大和縮小過(guò)程中保持一致即可。而通氣速率和攪拌轉(zhuǎn)速則在放大過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化。

隨著反應(yīng)器體積的變大，通氣速率也一般呈直線上升的趨勢(shì)?？諝饬魉俚姆糯笠话悴捎脝挝惑w積單位時(shí)間的通氣量（vvm）恒定的方法。O2和CO2流速的放大方法和空氣流速的放大方法相似，但是在實(shí)際的操作過(guò)程中還要根據(jù)反應(yīng)器中O2和pH控制器的類(lèi)型以及控制策略做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。更為重要的一點(diǎn)是，在通氣過(guò)程中要保持O2和CO2線路的壓力大于空氣線路的壓力，確保O2和CO2能夠進(jìn)入到鼓泡器中。

反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速的放大和縮小通常是十分困難的[5]。大型反應(yīng)器的攪拌速度一方面能夠?yàn)榉磻?yīng)器提供足夠的混合能力，另一方面還要避免引入由于高轉(zhuǎn)速和高通氣速率條件下所引起的細(xì)胞損傷。此外，在放大和縮小過(guò)程中轉(zhuǎn)速對(duì)體積氧傳遞系數(shù)（kLa）的影響也要做一定的評(píng)估。

1.2流加參數(shù)的放大與縮小

在流加培養(yǎng)過(guò)程中，流加培養(yǎng)基補(bǔ)入的時(shí)間通常是和小規(guī)模反應(yīng)器保持一致，是與體積無(wú)關(guān)的參數(shù)。由于反應(yīng)器規(guī)模的不同，流加體積和流加速率等參數(shù)則需要根據(jù)培養(yǎng)體積放大倍數(shù)需要做一定的調(diào)整。此外，在大規(guī)模反應(yīng)器的流加培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)體積會(huì)隨著流加培養(yǎng)基的補(bǔ)入而不斷的增大，導(dǎo)致培養(yǎng)基的濃度會(huì)出現(xiàn)一定程度的稀釋?zhuān)虼藢?duì)流加培養(yǎng)基的濃度也應(yīng)當(dāng)做一定的考慮。

1.3取樣參數(shù)的放大與縮小

不同培養(yǎng)規(guī)模下的取樣時(shí)間和取樣體積也應(yīng)當(dāng)在放大的過(guò)程中予以考慮。特別是在小規(guī)模的反應(yīng)器中，每次取樣都會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)體積的減少，如果沒(méi)有考慮到體積的下降，在流加過(guò)程中勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)入的流加培養(yǎng)基的濃度變大。因此，在制定放大策略時(shí)，由于取樣所造成的小規(guī)模反應(yīng)器體積減少量也應(yīng)當(dāng)仔細(xì)的計(jì)算在內(nèi)。

1.4規(guī)模放大和縮小過(guò)程中存在的問(wèn)題

對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)而言，從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大到生產(chǎn)規(guī)模仍然是一個(gè)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)[9，10]。在反應(yīng)器規(guī)模放大過(guò)程中，當(dāng)前研究主要集中在流體的剪切力、氧傳遞[11]、溶解二氧化碳的移除[1-3]以及反應(yīng)器的混合特性[4]四個(gè)方面，這些問(wèn)題已經(jīng)成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞在放大過(guò)程中公認(rèn)的技術(shù)難題，是規(guī)模放大過(guò)中導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降的主要原因[6]。

2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1反應(yīng)器放大和縮小策略

反應(yīng)器放大和規(guī)?？s小模型的建立采用以下策略：

1.非體積相關(guān)的參數(shù)保持不變，如pH、DO等

2.體積相關(guān)的參數(shù)（線性），如培養(yǎng)體積、流加量等

3.體積相關(guān)的參數(shù)（非線性），如轉(zhuǎn)速、通氣量等

2.3實(shí)驗(yàn)方法

流加培養(yǎng)方法不變，培養(yǎng)至第3、5、7、9、11天時(shí)，每次流加初始培養(yǎng)體積5% 的FeedCPlus，以及1 g/L的Yeast水解物（總量為5 g/L）；每天根據(jù)葡萄糖濃度檢測(cè)結(jié)果，在葡萄糖低于2.5 g/L時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖濃縮液至濃度4 g/L。培養(yǎng)收獲時(shí)間設(shè)定為14天。

200 L反應(yīng)器培養(yǎng)四批，2 L反應(yīng)器培養(yǎng)7批，對(duì)200 L和2 L反應(yīng)器的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

2.4大型反應(yīng)器與小型反應(yīng)器培養(yǎng)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比

對(duì)大型反應(yīng)和小型反應(yīng)器的結(jié)果進(jìn)行等效性檢驗(yàn)。傳統(tǒng)的t檢驗(yàn)適用于檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的不同，并不適用于檢驗(yàn)數(shù)等效。對(duì)于t檢驗(yàn)而言，假設(shè)二者數(shù)據(jù)相同，通過(guò)拒絕原假設(shè)來(lái)證明二者是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，如果是接受原假設(shè)只是表明沒(méi)有足夠的數(shù)據(jù)來(lái)證明而這時(shí)有差異的，并不能表明而這是相等的。等效性檢驗(yàn)使用了兩個(gè)方向的單側(cè)檢驗(yàn)，因此也稱(chēng)為雙向單側(cè)檢驗(yàn)（TOST）。公式定義為 -θ <μS-μL<θ，μS和μL分別表示小規(guī)模和大規(guī)模反應(yīng)器的過(guò)程參數(shù)。如果二者之間的差異落在[-θ，θ]之間表明二者之間是等效的，通產(chǎn)差異在3σ之間人為是可接受的，因此本文的可接受范圍設(shè)置為[-3σ，3σ].

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1反應(yīng)器規(guī)模放大與縮小

3.1.1細(xì)胞生長(zhǎng)

圖1.1所示為流加培養(yǎng)工藝在2 L和200 L反應(yīng)器的細(xì)胞生長(zhǎng)和活率對(duì)比。在細(xì)胞生長(zhǎng)方面，除第四天200 L反應(yīng)器的細(xì)胞密度高于2 L反應(yīng)器外，2 L規(guī)?？s小系統(tǒng)與200 L反應(yīng)器基本一致。在細(xì)胞活率方面，與200 L反應(yīng)器相比2 L反應(yīng)器的細(xì)胞活率略低，但一直維持在95%以上。

3.1.2細(xì)胞代謝

圖1.2所示為流加培養(yǎng)工藝在2 L和200 L反應(yīng)器的代謝副產(chǎn)物乳酸生成情況對(duì)比。由圖可知，2 L和200 L反應(yīng)器的乳酸代謝情況基本一致，從第0天到第4天為乳酸生成階段，此階段乳酸快速生成，第四天達(dá)到最高為1.7 g/L左右，之后進(jìn)入乳酸消耗階段，到第10天左右乳酸完全耗光。

圖1.3所示為流加培養(yǎng)工藝在2 L和200 L反應(yīng)器的代謝副產(chǎn)物氨生成情況對(duì)比。由圖可知，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中氨都是持續(xù)生成的，且從第6天開(kāi)始，2 L反應(yīng)器的氨的累積要高于200 L反應(yīng)器。到最終培養(yǎng)結(jié)束時(shí)2 L反應(yīng)器的氨達(dá)到14.5 mmol/L，是200 L反應(yīng)器的1.25倍。2 L反應(yīng)器的氨的代謝情況與200 L反應(yīng)器不一致，表明不同反應(yīng)器規(guī)模下對(duì)細(xì)胞的代謝情況有一定的影響。

3.2蛋白表達(dá)

圖1.4所示為流加培養(yǎng)工藝在2 L和200 L反應(yīng)器的蛋白表達(dá)情況對(duì)比。由圖可知，2 L和200 L反應(yīng)器的蛋白表達(dá)情況基本一致，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)量均在2.7 g/L左右。

3.3蛋白質(zhì)量

圖1.5所示為2 L和200 L反應(yīng)器上的抗體SEC純度對(duì)比，由圖可知，不同規(guī)模反應(yīng)器的抗體SEC純度與搖瓶相比無(wú)顯著差異，最終蛋白純度均在98%左右。

圖1.6所示為2 L和200 L反應(yīng)器上的抗體電荷異質(zhì)性對(duì)比，由圖可知，2 L反應(yīng)器的抗體的酸峰、堿峰和主成分與搖瓶相比無(wú)顯著差異，酸峰比例在12%左右，堿峰比例在16%左右，主成分比例在70%左右。

綜上所述，從2 L和200 L反應(yīng)器，細(xì)胞在生長(zhǎng)、活率、乳酸代謝、蛋白表達(dá)和蛋白質(zhì)量方面基本一致，在氨代謝方面2 L反應(yīng)器的氨的累積要高于200 L反應(yīng)器。表明該流加培養(yǎng)工藝能夠穩(wěn)定的放大至實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中。

3.4等效性檢驗(yàn)

對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)進(jìn)行等效性檢驗(yàn)。由表1.5可知2 L和200 L反應(yīng)器的關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)是等效的，表明反應(yīng)器的規(guī)模放大和縮小是一致。

4小結(jié)

本文首先對(duì)2 L反應(yīng)器和200 L反應(yīng)器進(jìn)行分析建立了規(guī)模放大和縮小的策略，并在2 L和200 L反應(yīng)器上進(jìn)行了實(shí)施，進(jìn)一步對(duì)關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)進(jìn)行了等效性檢驗(yàn)，結(jié)果表明2 L反應(yīng)器和200 L反應(yīng)器是等效的。

首先，對(duì)2 L反應(yīng)器和200 L反應(yīng)器進(jìn)行分析建立了規(guī)模放大和縮小的策略，將放大參數(shù)分為非體積相關(guān)的參數(shù)和體積相關(guān)的參數(shù)兩大類(lèi)。非體積相關(guān)的參數(shù)在放大和縮小的過(guò)程中保持不變。體積相關(guān)的參數(shù)又分為線性相關(guān)和非線性相關(guān)的參數(shù)，對(duì)于非線性相關(guān)的參數(shù)采用合適的放大準(zhǔn)則。

其次，在2 L反應(yīng)器和200 L反應(yīng)器進(jìn)行了放大和縮小的實(shí)施，結(jié)果表明細(xì)胞在生長(zhǎng)、代謝、蛋白表達(dá)和蛋白質(zhì)量方面基本一致。

最終，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法證明了200 L反應(yīng)器和2 L反應(yīng)器是等效一致的。

參考文獻(xiàn)：

[1].Kirdar，A.O.，et al.，Application of Multivariate Analysis toward Biotech Processes：Case Study of a Cell‐Culture Unit Operation. Biotechnology progress，2007. 23（1）：p. 61-67.

[2].Mostafa，S.S. and X.S. Gu，Strategies for Improved dCO2 Removal in Large‐Scale Fed‐Batch Cultures. Biotechnology progress，2003. 19（1）：p. 45-51.

[3].Zhu，M.M.，et al.，Effects of Elevated pCO2 and Osmolality on Growth of CHO Cells and Production of Antibody‐Fusion Protein B1：A Case Study. Biotechnology progress，2005. 21（1）：p. 70-77.

[4].Serrato，J.A.，et al.，Heterogeneous conditions in dissolved oxygen affect N‐glycosylation but not productivity of a monoclonal antibody in hybridoma cultures. Biotechnology and bioengineering，2004. 88（2）：p. 176-188.

[5].Yang，J.D.，et al.，F(xiàn)ed-batch bioreactor process scale-up from 3-L to 2，500-L scale for monoclonal antibody production from cell culture. Biotechnol Bioeng，2007. 98（1）：p. 141-54.

[6].Xing，Z.，et al.，Scale-up analysis for a CHO cell culture process in large-scale bioreactors. Biotechnol Bioeng，2009. 103（4）：p. 733-46.

[7].Rouiller，Y.，et al.，Application of Quality by Design to the characterization of the cell culture process of an Fc-Fusion protein. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2012. 81（2）：p. 426-437.

[8].Food and D. Administration，Guidance for industry PAT—a framework for innovative pharmaceutical development，manufacturing，and quality assurance. DHHS，Rockville，MD，2004.

[9].Humphrey，A.，Shake flask to fermentor：what have we learned？ Biotechnology Progress，1998. 14（1）：p. 3-7.

[10].Schmidt，F(xiàn).，Optimization and scale up of industrial fermentation processes. Applied microbiology and biotechnology，2005. 68（4）：p. 425-435.

[11].Lilly，M.，Problems in process scale-up. Special Publications of the Society for General Microbiology[SPEC. PUBL. SOC. GEN. MICROBIOL.]. 1983.，1983.