不同生長因子對脂肪干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

摘要：目的：觀察不同生長因子對脂肪干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法：通過將兔腹股溝白色脂肪組織通過酶消化培養(yǎng)為脂肪干細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中取第三代細(xì)胞分別給予不同生長因子干預(yù)，而后觀察脂肪干細(xì)胞遷移能力、黏附能力以及增殖能力。結(jié)果：Transwell小室法檢測顯示第四組遷移細(xì)胞數(shù)最多，第4組黏附細(xì)胞數(shù)量最多，CCK-8結(jié)果顯示隨著時間的推移各因子組合吸光度值均明顯上升，其中第四組吸光值遞增幅度最大，各組之間數(shù)據(jù)差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.O5）。結(jié)論：對于不同生長因子對脂肪干細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響不同。

關(guān)鍵詞：不同生長因子；脂肪干細(xì)胞；生物學(xué)行為

相關(guān)研究報道顯示從脂肪組織中提取的脂肪干細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外擴(kuò)增、更新、分化能力，由此為內(nèi)源性骨再生提供了新興種子細(xì)胞。而生長因子屬于機(jī)體內(nèi)具有生物活性的細(xì)胞外信號分子，可作用與靶細(xì)胞表面受體，從而介導(dǎo)靶細(xì)胞參與和進(jìn)行損傷修復(fù)[1，2]。目前臨床實驗中與脂肪干細(xì)胞生物學(xué)行為研究相關(guān)的生長因子有血小板源性生長因子AB、轉(zhuǎn)化生長因子β1以及血管內(nèi)皮生長因子，既往的臨床研究中顯示以上三種生長因子均有對脂肪干細(xì)胞生物學(xué)行為干預(yù)的最佳質(zhì)量濃度，其中血小板源性生長因子AB 的最佳濃度值為10ug/L，轉(zhuǎn)化生長因子β1的最佳濃度值為2ug/L，血管內(nèi)皮生長因子最佳質(zhì)量濃度為10ug/L[3，4]。本次實驗通過觀察不同生長因子組合對兔脂肪干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從而觀察不同生長因子對脂肪干細(xì)胞生理學(xué)行為的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

本次實驗選取5只3月齡新西蘭大白兔，所有大白兔均為雌性，體重在2.0～2.5kg，平均體重在（2.2±1.2）kg，5只新西蘭大白兔均生命體征平穩(wěn)，一般資料上數(shù)據(jù)不存在明顯差異性（P>0.05）

1.2方法

1.2.1脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)

嚴(yán)格按照無菌操作切取新西蘭大白兔腹股溝白色脂肪組織，將收集的脂肪組織置于雙抗D-Hank's溶液中，剝離脂肪組織中筋膜以及毛細(xì)血管而后將脂肪組織剪碎置于15 mL離心管中，在離心管中加入2倍體積濃度0.2%的I型膠原酶，在恒溫?fù)u床上持續(xù)消化振蕩半小時，恒溫床保持37攝氏度，最后加入等體積a-MEM培養(yǎng)基中和消化。用200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾脂離心試管中的消化液，而后按照1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除試管中懸液再次加入等體積a-MEM培養(yǎng)基，充分混合后接種在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將其置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，此后每3天更換1次待細(xì)胞長滿瓶底80%左右時用濃度為0.25%的胰酶消化按照1：3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代脂肪干細(xì)胞用于實驗。

1.2.2成骨誘導(dǎo)

將收集的生長狀態(tài)良好的第3代脂肪干細(xì)胞以3x107 L-1的濃度接種于經(jīng)0.1%明膠涂料處理的6孔板中，每孔加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后每孔中加入2 mL成骨誘導(dǎo)液，每3天換以此誘導(dǎo)液，連續(xù)誘導(dǎo)21天后用PBS清洗后采用40 g/L多聚甲醛固定，茜素紅染色，將成骨細(xì)胞置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3成脂誘導(dǎo)

將收集的生長狀態(tài)良好的第3代脂肪干細(xì)胞以2.1 x107 L-1的濃度接種于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)且常規(guī)換液，待細(xì)胞長滿瓶底后將細(xì)胞培養(yǎng)基換成脂誘導(dǎo)液A，誘導(dǎo)液A中含有雙抗α-MEM培養(yǎng)液，濃度為200umol/L的吲哚美辛、濃度為1umol/L的地塞米松，濃度為10mg/L的胰島素、濃度為0.5mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤持續(xù)誘導(dǎo)3天后換保持液B，保持液B中含雙抗的a-ME M培養(yǎng)液、濃度為10mg/L胰島素持續(xù)培養(yǎng)1天后再換用誘導(dǎo)液A誘導(dǎo)，如此重復(fù)4此后用成脂誘導(dǎo)液A誘導(dǎo)5天，用油紅O染色觀察拍照。

1.2.3不同生長因子實驗研究

將生長良好的第三代脂肪干細(xì)胞用濃度為0.25%胰蛋白酶消化吸收后收集貼壁細(xì)胞，將其置于濾膜孔徑為8um的24孔Transwell小室進(jìn)行兔脂肪干細(xì)胞遷移性研究，在將每孔密度利用不含有胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液制成1X105個細(xì)胞懸液，每孔越600uL，在此基礎(chǔ)上第一組給予最佳濃度轉(zhuǎn)化生長因子β1以及最佳濃度血小板源性生長因子AB，第二組給予最佳濃度血小板源性生長因子AB以及最佳濃度血管內(nèi)皮生長因子，第三組給予最佳濃度轉(zhuǎn)化生長因子β1以及最佳濃度血管內(nèi)皮生長因子。第四組給予最佳濃度轉(zhuǎn)化生長因子β1、最佳濃度血小板源性生長因子AB以及最佳濃度血管內(nèi)皮生長因子，并設(shè)置空白對照組，對照組未給予血清培養(yǎng)液，將其進(jìn)行組織培養(yǎng)，而后倒置熒光顯微鏡觀察五組不同生長因子兔脂肪干細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)，黏附細(xì)胞數(shù)以及酶聯(lián)免疫檢測中各組吸光值的變化情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0系統(tǒng)軟件統(tǒng)計分析資料；其中計量資料用（x±s）表示，并用t檢驗；P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 成骨誘導(dǎo)結(jié)果

在倒置顯微鏡下觀察可見兔脂肪干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)第4天左右出現(xiàn)形態(tài)變化，逐漸由長梭形變?yōu)榱⒎叫位虬鶢?，誘導(dǎo)1周兔脂肪干細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)晶體狀沉淀，且隨著誘導(dǎo)時間的延長晶體狀沉淀物逐漸增多，持續(xù)成骨誘導(dǎo)21天后茜素紅染色發(fā)現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)形成（如圖A）

2.2成脂誘導(dǎo)結(jié)果

兔脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)第4天左右出現(xiàn)形態(tài)變化，由長梭形漸變?yōu)槎噙呅位蝾悎A形，隨著成脂誘導(dǎo)時間的延長兔脂肪干細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂脂滴類似物逐漸增多，成脂誘導(dǎo)21天后油紅O染色發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大脂滴（圖 B）。

圖A兔脂肪干細(xì)胞成骨細(xì)胞誘導(dǎo) 圖B兔脂肪干細(xì)胞成脂細(xì)胞誘導(dǎo)

2.3不同組合生長因子脂肪干細(xì)胞體外遷移情況

Transwell小室脂肪干細(xì)胞體外遷移實驗，具體情況（見表1），第四組遷移細(xì)胞數(shù)最多。

2.4不同組合生長因子脂肪干細(xì)胞黏附情況

不同組合生長因子脂肪干細(xì)胞黏附情況，具體情況（見表2），第4組黏附細(xì)胞數(shù)量最多。

3討論

近些年口腔種植修復(fù)技術(shù)不斷發(fā)展，臨床研究發(fā)現(xiàn)需要進(jìn)行口腔種植修復(fù)的患者骨量不足可稱為影響個體口腔種植修復(fù)效果的制約因素，針對個體骨量不足如何有效促進(jìn)內(nèi)源性骨再生已經(jīng)成為臨床研究的熱點問題之一，其中種子細(xì)胞、生長因子以及纖維支架是影響骨再生重塑的關(guān)機(jī)鍵要素。內(nèi)源性骨細(xì)胞再生依賴于種子細(xì)胞在生長因子的誘導(dǎo)下發(fā)生分化、遷移、黏附和增殖，從而達(dá)到促進(jìn)骨組織再生修復(fù)的目的[5]。近些年臨床研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在遷移、分化、繁殖前需降解細(xì)胞外基質(zhì)以及基地膜，而基質(zhì)金屬蛋白酶可有效降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而調(diào)節(jié)干細(xì)胞基質(zhì)，促使干細(xì)胞基質(zhì)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。生長因子可通調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，從而達(dá)到提高干細(xì)胞遷移能力的目的[6]。本實驗通過體外觀察不同生長因子組合對兔脂肪干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從而篩選出最佳因子組合。本次實驗結(jié)果顯示給予最佳濃度轉(zhuǎn)化生長因子β1、最佳濃度血小板源性生長因子AB以及最佳濃度血管內(nèi)皮生長因子的生長因子組合其遷移細(xì)胞數(shù)最多，黏附細(xì)胞數(shù)量最多，CCK-8結(jié)果顯示隨著時間的推移其因子組合吸光度值遞增幅度最高。

綜上所述，本次實驗研究初步認(rèn)為聯(lián)合10ug/L血小板源性生長因子AB，2ug/L轉(zhuǎn)化生長因子β1以及10ug/L血管內(nèi)皮生長因子最佳質(zhì)量濃度可有效促進(jìn)脂肪干細(xì)胞遷移、黏附和增殖。

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