基于磁珠富集法開發(fā)并篩選西川紅景天的微衛(wèi)星標(biāo)記

摘要： 利用FIASCO磁珠富集法，開發(fā)和篩選青藏高原特有珍貴植物西川紅景天（Rhodiola alsia）多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。結(jié)果表明：用（AG）15和（AC）15兩種微衛(wèi)星標(biāo)記探針構(gòu)建富集文庫，共獲得陽性克隆約2 500個(gè)；從中隨機(jī)挑取1200檢測，發(fā)現(xiàn)具有多態(tài)性的陽性克隆達(dá)400個(gè)；隨機(jī)挑取200多態(tài)性的陽性克隆進(jìn)行測序，從中獲得105個(gè)SSR位點(diǎn)，用在線軟件primer32.3.4成功設(shè)計(jì)得SSR引物105對；其中45對可以成功擴(kuò)增，而13對所擴(kuò)增的片段在相距較遠(yuǎn)的4個(gè)自然居群的24個(gè)個(gè)體中顯示較高的遺傳多態(tài)性。用4個(gè)居群的80個(gè)個(gè)體檢測這13對引物發(fā)現(xiàn)，平均等位基因數(shù)（A）約為9.192，觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）均值分別約為0.712和0.734，如此高的多態(tài)性已經(jīng)滿足后期研究的需要；數(shù)個(gè)位點(diǎn)在某些居群中顯著偏離哈迪溫伯格平衡（P<0.01），這可能是實(shí)際研究的居群并不能達(dá)到哈迪—溫伯格定律所假設(shè)的無限大等理想狀態(tài)所致。結(jié)合此前基于表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tag，EST）序列開發(fā)的SSR多態(tài)性位點(diǎn)，該研究結(jié)果為今后利用SSR位點(diǎn)開展西川紅景天的居群遺傳結(jié)構(gòu)分析和其他研究提供了一組有效工具。

關(guān)鍵詞： 西川紅景天， 微衛(wèi)星， 引物， 磁珠富集法， 開發(fā)

中圖分類號： Q941，Q948

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）03034206

Abstract： FIASCO magnetic beads method was utilized to develop polymophic SSR markers of Rhodiola alsia， a precious species endemic to the QinghaiXizang Plateau. Two SSR marker probes， （AG）15 and （AC）15， were used to construct enriched SSR library and 2 500 positive clones were obtained. Then 1 200 positive clones were randomly selected to check and within which 400 clones were found with polymorphism. Half of the polymorphic clones were randomly chosen for sequencing and 105 SSR loci were achieved. Subsequently， 105 pairs of

primers were designed by online software， primer 32.3.4， for amplifying the SSR sequences. Among which， a total of 45 pairs of primers were positive for amplification and the sequences amplified by thirteen pairs showed high genetic polymorphism when detected in four far apart natural populations with 24 individuals. Afterwards， the whole of 80 individuals in the four populations were employed to check the thirteen SSR loci. The average number of alleles per locus （A） was around 9.192， the mean of observed heterozygosity （Ho） and the expected heterozygosity （He） were around 0.712 and around 0.734， respectively. Such an extraordinary polymorphism was enough to meet the needs of future research. However， several loci were significantly deviated from WeinbergHardy equilibrium （P<0.01） in some populations， which may be due to the fact that the population of the actual study could not reach the ideal state of WeinbergHardy’s law. Combining SSR polymorphic loci developed previously based on EST （Expressed Sequence Tag） sequences， this study provides a set of serviceable tools for population genetic structure analysis on R. alsia and other researches based on SSR markers.

Key words： Rhodiola alsia， SSR， primers， megnetic beads method， development

西川紅景天（Rhodiola alsia）是景天科（Crassulaceae）的青藏高原特有種，主要分布于青海南部、西藏東南部、四川西北部和云南西北部，海拔3 400～4 800 m的河漫灘、山坡石隙及流石坡地（Fu Ohba， 2001）。西川紅景天的獨(dú)特生境使其附近伴生植物非常稀少，因此其在高海拔的生態(tài)環(huán)境中占據(jù)舉足輕重的地位。而包括西川紅景天在內(nèi)的多種紅景天屬（Rhodiola）植物是一類重要的民族藥材。傳統(tǒng)醫(yī)藥典籍記載，紅景天具有清熱、治肺病、滋補(bǔ)元?dú)?、抗高原反?yīng)等功效；藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紅景天對衰老、疲勞、缺氧、不良刺激、病毒乃至腫瘤等具有抵抗功能，并且有雙向調(diào)節(jié)機(jī)體、影響學(xué)習(xí)記憶、保護(hù)骨骼系統(tǒng)等御病保健作用（顧艷麗等， 2003； 王強(qiáng)等， 2007）。然而，紅景天在醫(yī)藥、保健領(lǐng)域的廣泛使用導(dǎo)致了大量市場需求，也在一定程度上使作為紅景天基原植物的西川紅景天等植物處于瀕危之境（姜愛玲和張巖， 2015）。

微衛(wèi)星（microsatellite，SSR）發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，而SSR分子標(biāo)記由Litt創(chuàng)建于1989年，在此后的近三十年里，SSR分子標(biāo)記的研究與應(yīng)用得到了長足發(fā)展。SSR因其優(yōu)于RAPD、ISSR和AFLP等分子標(biāo)記的共顯性和高重復(fù)性（Wang Szmidt， 2001）而廣泛應(yīng)用于遺傳變異分析、物種起源進(jìn)化、基因定型、指紋鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、法醫(yī)科學(xué)、微生物分型和動植物遺傳育種等諸多研究領(lǐng)域（何平， 1998； Doerge， 2002； Liu et al， 2005； Gao et al， 2005； Yoshimoto et al， 2011； 陶星辰等， 2014），而西川紅景天的微衛(wèi)星引物的開發(fā)與篩選將為如此眾多領(lǐng)域的研究提供重要的基礎(chǔ)。我們曾利用基于高通量測序獲得的唐古紅景天（R. tangutica）EST序列開發(fā)西川紅景天的8條相對理想SSR位點(diǎn)及其引物（Zhang et al， 2015）?？赡苡捎谖鞔t景天與唐古紅景天之間的物種差異，我們并沒有高效地獲得理想的西川紅景天SSR位點(diǎn)及其引物，這不能滿足后續(xù)研究的多樣性的需求。因此，我們嘗試使用磁珠富集法FIASCO（Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats）（Zane et al， 2002）開發(fā)西川紅景天的微衛(wèi)星引物，并進(jìn)行篩選。

1材料與方法

1.1 材料

本研究中，用于微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性篩選的西川紅景天分別采自青海省、四川省及西藏自治區(qū)等地，各個(gè)居群的海拔、經(jīng)緯度在采集地中心使用GPS全球定位系統(tǒng)Etres GIS采集器記錄（Garmin，中國臺灣）（表1）。憑證標(biāo)本保存于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA酶切與接頭連接本研究所用的DNA為此前的研究中所獲得的基因組DNA（Zhang et al， 2015）。按照試劑Mse I說明書中所給的參考比例配置25 μL的酶切反應(yīng)體系液，即0.5 μg左右的基因組DNA與加入0.5 μL的內(nèi)切酶Mse I（10 U·μL1，New England Biolabs，USA）在37 ℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)1 h，然后于65 ℃滅活10 min。酶切反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，彌散帶分布于100～1 000 bp間為佳。

在酶切產(chǎn)物中連接上MseI的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）接頭AdapterA（5′gATgAgTCCTgACTACN3′，N代表堿基A、G、C、T）和AdapterB（5′gACgATgAgTCCTgAg3′），于16 ℃在10 μL反應(yīng)體系液中連接過夜，反應(yīng)體系如下：酶切反應(yīng)產(chǎn)物 10 μL，AdapterA 1.5 μL，AdapterB 1.5 μL，10×T4 DNA ligase buffer 2.0 μL，50% PEG4000 2.0 μL，T4 DNA ligase （1 000 U·μL1） 0.2 μL，ddH2O 2.8 μL。然后65 ℃滅活10 min。

以接頭連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR以檢測接頭連接是否成，反應(yīng)體系為連接產(chǎn)物2.0 μL，ddH2O 15.7 μL， 10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL， dNTP（2.5 mol·

L1） 1.6 μL，MseIN（10 mol·L1） 3.0 μL，Taq polymerase（5 U·μL1；TaKaRa，大連） 0.2 μL；PCR程序?yàn)?5 ℃，5 min；（94 ℃，30 s；53 ℃，60 s；72 ℃，60 s） × 25；72 ℃，7 min；16 ℃，∞。然后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測該P(yáng)CR產(chǎn)物，并用AxyPrep（AXYGEN，美國）DNA凝膠純化試劑盒嚴(yán)格按照該產(chǎn)品的說明書來回收、純化PCR產(chǎn)物。

1.2.2 生物素標(biāo)記探針雜交與富集用5′生物素標(biāo)記過的探針（AG）15和（AC）15與上一步純化后的PCR產(chǎn)物在雜交體系中48 ℃反應(yīng)2 h。雜交體系為純化后的PCR產(chǎn)物40 μL、探針（AG）15和（AC）15各15 μL（10 mmol·L1），4 × SSC（with 1%SDS） 65 μL。

取1 mg磁珠于1.5 mL離心管中，用300 μL TEN100緩慢沖洗，磁力架（New England Biolabs，美國）吸附約1 min，棄漂洗液，重復(fù)漂洗2次后，將磁珠懸浮于40 μL TEN100中。

將上一步獲得的雜交產(chǎn)物加入已準(zhǔn)備好的磁珠懸浮液中，28 ℃，110 r·min1恒溫振蕩溫育30 min，然后用磁力架吸附磁珠，以使磁珠和混合液分離，棄掉混合液后進(jìn)行如下洗脫：向所吸附的磁珠中加400 μL TEN1000，室溫漂洗5 min，然后用磁力架吸附磁珠，棄洗脫液；重復(fù)2次，保留末次洗脫液記為①。向磁珠中加400 μL含0.1%SDS的0.2 × SSC，室溫漂洗5 min，然后磁力架吸附，棄洗脫液；重復(fù)2次，保留末次洗脫液記為②。向磁珠中加50 μL TE并混勻，轉(zhuǎn)移到PCR管中，95 ℃變性5 min，然后用磁力架吸附，保留上清液記為③。

分別用上述所得的3份洗脫液（①、②、③）為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同1.2.1所述，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收并純化200～700 bp大小的PCR產(chǎn)物，用分光光度計(jì)NanoDrop 2000c檢測回收到的產(chǎn)物濃度。

1.2.3 微衛(wèi)星富集文庫構(gòu)建與篩選按照產(chǎn)品使用說明，使用pMDTM19T Vector Cloning Kit（TaKaRa，大連）將上一步獲得的純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行T載體連接。然后按照產(chǎn)品使用說明將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌（E. coli DH5α）超感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa，大連）；37 ℃恒溫?fù)u床搖菌1 h；然后超凈工作臺中涂板接種，37 ℃倒置培養(yǎng)。

挑選陽性單克隆于500 μL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床搖菌3～5 h，接著以此菌液為模板做菌落PCR，反應(yīng)體系為DNA template 0.8 μL，ddH2O 17.5 μL，10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL，dNTP（2.5 mol·L1） 0.2 μL，MseIN（10 mol·L1） 3.0 μL，Primer（（AG）15或（AC）15，5 mol·L1） 0.8 μL Taq polymerase（5 U·μL1） 0.2 μL，PCR程序同1.2.1；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；根據(jù)電泳結(jié)果，挑選PCR產(chǎn)物多于一條帶的單克隆進(jìn)行測序。

通過Chromas（Chromas Technelysim， 澳大利亞）軟件查看測序所得的DNA序列，使用在線軟件VecScreen（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去掉合格序列中的載體序列；使用ClustalX 2.0.12（Larkin et al， 2007）比對序列，去掉相同的單克隆序列，運(yùn)用SSRHunter軟件（李強(qiáng)和萬建民， 2005）進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索；在所獲得的SSR序列中，隨機(jī)選擇100條序列，通過軟件primer32.3.4（http：//primer3.sourceforge.net/）設(shè)計(jì)其引物。

1.2.4 微衛(wèi)星的多態(tài)性篩選利用4個(gè)野外居群（表1）80個(gè)個(gè)體，檢測SSR引物多態(tài)性。用分光光度計(jì)NanoDrop 2000c檢測每個(gè)個(gè)體DNA樣品的質(zhì)量和濃度，并根據(jù)所測濃度將其逐一稀釋到約10 ng·μL1，以便批量進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為DNAtemplate 2 μL，ddH2O 14.2 μL，10×Buffer（Mg2+） 2.5 μL，dNTP（2.5 mol·L1） 0.6 μL，Primer（Forward和Reverse） 0.5 μL，Taq polymerase（5 U·μL1） 0.2 μL，PCR程序?yàn)閇94 ℃，5 min；（94 ℃，45 s；Ta，30 s；72 ℃，30 s）×35；72 ℃，7 min；16 ℃，∞]。為了控制實(shí)驗(yàn)成本，PCR反應(yīng)產(chǎn)物先用聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行預(yù)檢測，對于呈現(xiàn)較高遺傳多態(tài)性的SSR引物，將其PCR產(chǎn)物再用QIAxcel Advanced System （QIAGEN，德國）毛細(xì)管電泳檢測分析。

統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量（Number of alleles per locus，A），利用GENEPOP version 4.0.10分析觀測雜合度（Observed heterozygosities，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosities，He）（Rousset， 2008）。HardyWeinberg平衡也在GENEPOP中用確切性概率方法（Exact probability test）檢測。

2結(jié)果與分析

采用（AG）15和（AC）15兩種微衛(wèi)星標(biāo)記探針構(gòu)建富集文庫，共獲得陽性克隆約2 500個(gè)；隨機(jī)挑取1 200個(gè)進(jìn)行PCR檢測，具有多態(tài)性的陽性克隆達(dá)400個(gè)（33.33%），隨機(jī)挑取200進(jìn)行測序，分析測序得到的序列，去掉載體序列，將測序結(jié)果比對，去掉相同的單克隆序列，經(jīng)SSRHunter搜索后，再利用primer32.3.4成功設(shè)計(jì)引物105對（52.5%）可用于SSR多態(tài)性篩選。經(jīng)過溫度梯度PCR篩選確定各對引物的退火溫度后，從每個(gè)居群中隨機(jī)挑取6個(gè)個(gè)體——共24個(gè)個(gè)體用于PCR，以初步篩選檢測引物的多態(tài)性；先在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量，后再用8%聚丙烯凝膠電泳檢測引物多態(tài)性。聚丙烯凝膠電泳檢測顯示成功擴(kuò)增45對，其中13對多態(tài)性較高（表2）。

用所獲得的13對SSR引物，對4個(gè)居群全部的80個(gè)個(gè)體進(jìn)行反應(yīng)；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，再在毛細(xì)管電泳中對其多態(tài)性進(jìn)行檢測。對毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析顯示，所檢測的13個(gè)SSR位點(diǎn)（表3）的等位基因數(shù)為2到23不等，均值約為9.192； 觀測雜合度（Ho）范圍為0.048～0.952， 均值約為0.712；而期望雜合度（He）范圍是0.000～1.000，均值約為0.734。GENEPOP檢測顯示多個(gè)位點(diǎn)在某些居群中顯著偏離哈迪溫伯格平衡（P<0.01）。

3討論與結(jié)論

微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的方法多種多樣，且各有利弊（李明芳和鄭學(xué)勤， 2005）。因此，應(yīng)根據(jù)物種信息、研究需要等情況選擇合適的方法。磁珠富集法可以高效率、低成本、簡單快捷地獲得高質(zhì)量的微衛(wèi)星（Brown et al， 1995）；本研究也在以往的研究中使用FIASCO法在高山繡線菊（Spiraea alpina）（Khan et al， 2014）、窄葉鮮卑花（Sibiraea angustata）（Arranz et al， 2013）等物種中獲得了大量微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)方法成熟高效。因此，我們在高通量測序文庫搜索法不滿足后期研究需要的情況下選擇FIASCO法對西川紅景天進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)。

多數(shù)真核生物中SSR重復(fù)單元主要為核苷酸（AC/TG）n，一般情況下，重復(fù)序列單元的堿基數(shù)目越少，其多態(tài)性越高，即兩堿基重復(fù)序列類型的多態(tài)性最高，三堿基、四堿基則依次次之（Kruglyak et al， 2000）。在對西川紅景天的近緣物種唐古紅景天的Solexa高通量測序結(jié)果的SSR分析，發(fā)現(xiàn)其重復(fù)類型以三核苷酸重復(fù)類型為主，二核苷酸重復(fù)類型次之，但AG、GA、CT等核苷酸重復(fù)類型占總核苷酸類型的比例遠(yuǎn)高于三核苷酸重復(fù)類型中其他類型占總核苷酸類型的比例（雷淑蕓等， 2014）。如前文所述，我們也利用唐古紅景天轉(zhuǎn)錄組的高通量測序數(shù)據(jù)，通過基于EST的方法開發(fā)了一些SSR位點(diǎn)及其引物，因而在用磁珠富集法開發(fā)西川紅景天的SSR過程中，我們僅選用了包括（AC/TG）n類型的兩堿基重復(fù)的（AG）15和（AC）15兩種生物素標(biāo)記探針用于富集文庫的構(gòu)建，如果需要增加SSR種類，可以選用更多種類的探針進(jìn)行文庫構(gòu)建（魏大為等， 2014）。在SSR位點(diǎn)多態(tài)性檢測過程中，我們?yōu)榱烁咝У胤从澄⑿l(wèi)星引物的多態(tài)性，采用了聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行預(yù)檢測，得到多態(tài)性較高的位點(diǎn)之后再用分辨率更高的毛細(xì)管電泳（精確度為2bp）進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的分析檢測，從而在一定程度上降低成本的同時(shí)提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

我們所獲得的SSR位點(diǎn)平均等位基因數(shù)約為9.192，觀測雜合度（Ho）均值約為0.712，期望雜合度（He）均值約為0.734，如此高的多態(tài)性已滿足后期研究的需要；GENEPOP檢測顯示數(shù)個(gè)位點(diǎn)在某些居群中顯著偏離哈迪溫伯格平衡（P<0.01），這可能是實(shí)際研究的居群并不能達(dá)到哈迪—溫伯格定律所假設(shè)的無限大等理想狀態(tài)所致。因此，這13對SSR位點(diǎn)及相應(yīng)SSR引物可用于后期的研究。

綜上所述，我們利用磁珠富集法獲得的西川紅景天13個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)合此前基于EST序列開發(fā)的SSR多態(tài)性位點(diǎn)，為今后利用微衛(wèi)星位點(diǎn)開展西川紅景天的居群遺傳結(jié)構(gòu)分析和其他研究提供了一組有效工具。

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