甜瓜鯊烯合酶基因克隆及酶分子結(jié)構(gòu)分析

摘要： 葫蘆素類是主要分布于葫蘆科植物中具有多種醫(yī)藥活性的四環(huán)三萜類化合物，目前藥用葫蘆素原料主要從甜瓜蒂中提取。該研究從甜瓜中克隆葫蘆素類合成關(guān)鍵酶——鯊烯合酶（SQS）的基因，并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：DNA測(cè)序和BLAST RefSeqGene分析表明，克隆的甜瓜SQS基因片段具有完整的該酶基因開(kāi)放閱讀框架（ORF）序列。ORF分析顯示，甜瓜SQS由417氨基酸殘基構(gòu)成，等電點(diǎn)為7.56。對(duì)推衍的甜瓜SQS氨基酸序列分析結(jié)果提示，該酶二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，SQS屬于異戊二烯合酶家族，具有法呢?；姿峒版V離子的結(jié)合位點(diǎn)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提示，甜瓜SQS為單體酶，其活性中心主要由幾個(gè)α螺旋圍繞形成的穴狀結(jié)構(gòu)。磷酸化位點(diǎn)分析顯示，S48處于酶活性中心相關(guān)47VSRSF52的模體中，而S196是正選擇位點(diǎn)，提示這兩處磷酸化位點(diǎn)可能是甜瓜SQS酶活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位。以甜瓜SQS基因ORF序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。該研究結(jié)果為葫蘆素類的生物合成調(diào)控研究提供了新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 甜瓜， 鯊烯合酶， 基因克隆， 序列分析

中圖分類號(hào)： Q946.83

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）03037308

Abstract： Cucurbitacins （Cus） are tetracyclic triterpenoid compounds which exist mainly in cucurbitaceous plants and have various pharmaceuticalslike actions. The medicinal raw materials of Cus are currently extracted mainly from the pedicellus melo. In this study， the gene of squalene synthase （SQS）， the key enzyme for Cus biosynthesis， from Cucumis melo was cloned， and the amino acid sequence of the enzyme derived from its nucleotide sequence was analyzed with bioinformatics methods. DNA sequencing and BLAST RefSeqGene analysis indicated that the cloned fragment of the C. melo SQS gene contained a complete open reading frame （ORF） of the gene. ORF Finder analysis showed that the SQS of C. melo was constituted of 417 amino acid residues with an isoelectric point of 7.56. Analysis of the deduced amino acid sequence suggested that the main type of secondary structure of the enzyme was α helix. Domain prediction study indicated that the SQS belonged to the isoprenoid biosynthase superfamily possessing the banding sites of farnesyl diphosphate and magnesian ion. Prediction of the tertiary structure suggested that the SQS was a monomeric enzyme with a cavelike activity center formed by α helixes. Protein phosphorylation analysis indicated that the phosphorylation site S48 located in the activity centerrelated motif 47 VSRSF52 and S196 was a positive selection site， suggesting that both S48 and S196 were critical sites for the regulation of SQS activity. The phylogenetic classification based on the phylogenetic tress constructed with the ORF sequence of the SQS gene showed that the result was in accordance with that of morphologic classification. Therefore， this study provides new clues and reference for research of the regulation of Cus biosynthesis.

Key words： Cucumis melo， squalene synthase， gene cloning， sequence analysis

葫蘆素類（Cucurbitacins， Cus）為一類主要分布于葫蘆科植物中的四環(huán)三萜化合物，其抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值（王莉梅和姚銘，2015）。植物體內(nèi)包括Cus在內(nèi)的三萜化合物主要通過(guò)甲羥戊酸途徑（mevalonic acid pathway， MVA）合成。該途徑以乙酰 CoA 為原料，經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)生成金合歡基焦磷酸或法尼基焦磷酸 （farnesyl diphosphate， FPP）。2分子FPP 在鯊烯合酶（squalene synthase， SQS）催化下以尾尾方式連接生成鯊烯，后者經(jīng)不同途徑環(huán)合生成三萜化合物（Kim et al，2011）。SQS 處于萜類代謝途徑中的FPP到其它產(chǎn)物的分支點(diǎn)上，是生物合成三萜化合物的一個(gè)關(guān)鍵酶。SQS的含量和活性直接影響到鯊烯的生物合成量，進(jìn)而影響到三萜化合物的生物合成（吳耀生等， 2007）。

目前，三七、人參和紅花栝樓等多種藥用植物的SQS基因已被克隆（吳耀生等，2007；張明哲等，2010；陶晨陳等，2015）。然而，盡管藥用葫蘆素原料主要從甜瓜蒂中提取，但甜瓜SQS基因序列及酶分子結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究從甜瓜葉中克隆了SQS基因開(kāi)放閱讀框架（open reading frame， ORF）及其3′末端序列，并對(duì)推衍的甜瓜SQS氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

1材料與方法

1.1 材料

甜瓜種為購(gòu)自駐馬店市志海種業(yè)有限公司2014年3月的甜瓜一代大田用種，將種子種于溫室發(fā)芽至10 cm后，取其葉片保存至液氮中備用。Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司，3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase購(gòu)自日本TaKaRa公司，2×Taq PCR MasterMix、核酸電泳Marker DL2000、質(zhì)粒小提試劑盒和大腸桿菌DH5α購(gòu)自于天根生化科技有限公司，異硫氰酸胍粉劑、Xgal、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒及引物購(gòu)自上海生物工程股份有限公司，pGEMT Easy Vector連接試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司?？寺y(cè)序由上海生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄在陶晨陳等（2015）方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)異硫氰酸胍法提取甜瓜葉片中的總RNA。取0.01～0.02 g葉片，剪成碎片置于2 mL凍存管中，放入液氮罐，過(guò)夜。次日取出凍存管，立即加入異硫氰酸胍提取緩沖液（4 mol·L1異硫氰酸胍，25 mmol·L1檸檬酸鈉 pH7.0，0.5% 十二烷基肌氨酸鈉，用前加β巰基乙醇至總濃度2%），用S10高速勻漿機(jī)（手提式高速分散器）勻漿。加入100 μL 2 mol·L1 NaAc （pH4.0）， 800 μL飽和酚，200 μL氯仿，漩渦振蕩混勻，冰浴5 min，4 ℃ 15 000 r·min1 離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)移入另一1.5 mL離心管中，加入2/3體積的5 mol·L1的KAc，混勻，冰浴5 min ，4 ℃ 15 000 r·min1離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)移入另一1.5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻。-20 ℃冰浴5～10 min，4 ℃ 15 000 r·min1離心10 min。棄上清，70 %的乙醇洗沉淀后加入無(wú)RNA酶水溶解沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆?。? μg總RNA，Oligo（dT）反轉(zhuǎn)錄后作為擴(kuò)增甜瓜SQS的ORF的模板。取1 μg總RNA，按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase說(shuō)明書操作，反轉(zhuǎn)錄后用于擴(kuò)增甜瓜SQS基因的3′末端序列。

1.2.2 甜瓜SQS基因部分片段的擴(kuò)增及3′端序列的擴(kuò)增參照NCBI上GenBank中其它葫蘆科植物SQS序列中的高度保守序列，設(shè)計(jì)引物P1：5′ACAACAACGTTGAAGTCTTCAGGGG3′，P2：5′CGGTAACCGTTTGGCAGAGA3′，擴(kuò)增甜瓜SQS基因部分片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為300 bp，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min， 然后94 ℃變性30 s， 58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物直接送上海生物工程有限公司測(cè)序證實(shí)所獲序列為甜瓜SQS基因部分序列。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)甜瓜SQS基因3′末端內(nèi)部特異性引物P3： 5′GGTCAACAGTGATCCTAATGC3′及外部特異性引物P4： 5′CGATTGCGGATGTCTATGGAGC3′。按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase說(shuō)明書操作并克隆甜瓜SQS 基因3′末端，將克隆菌液送上海生物工程有限公司測(cè)序證實(shí)所獲序列為甜瓜SQS基因 3′末端序列。

1.2.3 甜瓜SQS基因 ORF的克隆鑒于SQS基因 5′末端高度保守，因此根據(jù)NCBI上GenBank中其它葫蘆科植物SQS基因序列及上述操作獲得的甜瓜SQS基因3′末端序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增甜瓜SQS基因ORF的引物P5： 5′GATTGAGAGCGAGAAATGGG3′；P6：5′TCATACAGATTGGTTGGCTG3′，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 60 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸4 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后，按美國(guó)Promega公司的pGEMT Easy Vector試劑盒克隆甜瓜SQS基因ORF，將獲得的質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析將獲得的甜瓜SQS基因序列置NCBI上，以O(shè)RF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）尋找ORF，應(yīng)用DNASTAR將獲得的ORF序列翻譯為氨基酸序列，以ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）及ProtParam（http：//web.expasy.org/cgibin/protparam/protparam）分析甜瓜SQS蛋白的疏水性/親水性，NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。以DNASTART軟件中的protean以及在線網(wǎng)站NPS@（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_seccons.htm）分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)在NCBI CDSearch（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）網(wǎng)站上進(jìn)行。以TMHMM Server v. 2.0分析其跨膜區(qū)。

通過(guò)SWISS-MODEL軟件對(duì)甜瓜SQS蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，用RASTOP 2.0軟件編輯。

從GenBank中下載植物SQS基因，布朗葡萄藻為outgroup，以clustalx1.8對(duì)已報(bào)道的絞股藍(lán)、香瓜、黃瓜、人參、丹參、擬南芥、甘草、番茄、馬鈴薯、煙草、玉米等物種的SQS氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹， 在MEGA5.0軟件上進(jìn)行UPGMA算法，并進(jìn)行1 000次的Bootstrap 測(cè)試。

2結(jié)果與分析

2.1 甜瓜總RNA提取結(jié)果

提取的甜瓜葉子總RNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)的A260/280值均在1.8～2.0之間，A260/230值也都大于2.0，且瓊脂糖凝膠電泳顯示，28SrRNA與18SrRNA的亮度接近2∶1，提示所提取的總RNA質(zhì)量良好。

2.2 甜瓜SQS基因的擴(kuò)增結(jié)果

參照NCBI上GenBank中其它葫蘆科植物SQS基因序列中的高度保守序列，設(shè)計(jì)引物了P1及P2，擴(kuò)增了甜瓜SQS基因部分片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度與預(yù)期相符，測(cè)序列結(jié)果在NCBI的BLAST RefSeqGene上比對(duì)提示獲得SQS基因部分序列。按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase說(shuō)明書克隆甜瓜SQS基因 3′末端，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期相符。

2.3 甜瓜SQS 基因的克隆

根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增甜瓜SQS基因ORF的引物P5和P6擴(kuò)增出甜瓜SQS基因ORF片段，結(jié)果與預(yù)期相符。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEMT Easy 載體中，測(cè)序結(jié)果在NCBI的BLAST RefSeqGene上比對(duì)提示獲得甜瓜SQS基因ORF序列。

2.4 生物信息學(xué)分析

2.4.1 甜瓜SQS核苷酸序列分析將獲得的甜瓜基因序列上傳至NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） Analyz中的ORF Finder工具對(duì)甜瓜SQS基因ORF 核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果提示甜瓜SQS基因ORF編碼417個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為7.56。將甜瓜SQS基因ORF與其它植物SQS基因進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)樹，顯示系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致（圖1）。

2.4.2 甜瓜SQS氨基酸序列分析結(jié)合NCBI中的ORF Finder工具以及DNASTART軟件將甜瓜SQS 基因ORF 核苷酸序列推衍出其氨基酸序列，甜瓜SQS與葫蘆科其它植物氨基酸序列比對(duì)。圖2顯示，與酶活性中心相關(guān)的47VSRSF52、Y70、R74、R77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217、R225均高度保守。NetPhos2.0 Server分析提示甜瓜SQS共有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，分別為S48、S196、S249、S281、S358、S407。蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，分別為 T78、T83、T144、T161、T318、T327。酪氨酸磷酸化位點(diǎn)5個(gè)，分別為 Y165、Y236、Y245、Y273、Y387。ProtParam分析結(jié)果提示，甜瓜SQS為親水性蛋白，多肽鏈中包含50個(gè)堿性氨基酸、49個(gè)酸性氨基酸。極性氨基酸100個(gè)，疏水性氨基酸159個(gè)，GRAVY值為-0.065。

2.4.3 甜瓜SQS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析二級(jí)結(jié)構(gòu)分析提示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占64.99%，延伸主鏈占7.19%，無(wú)規(guī)則卷曲占27.82%，甜瓜SQS主要由α螺旋構(gòu)成（圖4：A）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果提示，甜瓜SQS氨蛋白質(zhì)屬于異戊二烯合酶家族，具結(jié)合法呢酰基二磷酸及鎂離子的結(jié)合位點(diǎn)，以及富含天冬氨酸模體（圖4：B）?？缒^(qū)分析提示，甜瓜SQS具兩個(gè)跨膜區(qū)，分別為282到304氨基酸之間及386到408氨基酸之間，1到281氨基酸及409到417氨基酸位于膜外側(cè)，305到385氨基酸位于膜內(nèi)側(cè)。

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提示，甜瓜SQS為單體蛋白結(jié)構(gòu)（圖5），結(jié)合文獻(xiàn)（Pandit et al，2000；侯嶸等，2011），其活性中心主要由幾個(gè)α螺旋圍繞形成一穴狀活性中心結(jié)構(gòu)，其17個(gè)磷酸化位點(diǎn)均位于蛋白質(zhì)的表面。

3討論

SQS是葫蘆科植物Cus生物合成的關(guān)鍵酶，其細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（Pandit et al；殷秀梅等，2012）。盡管藥用Cus原料主要來(lái)自甜瓜，但目前對(duì)甜瓜SQS的結(jié)構(gòu)與功能仍不清楚。本研究基于克隆的甜瓜SQS基因ORF推導(dǎo)出甜瓜SQS氨基酸序列。序列分析結(jié)果提示，甜瓜SQS是由417氨基酸殘基構(gòu)成的單體酶，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋占為主。其活性中心為主要由幾個(gè)α螺旋圍繞形成的穴狀結(jié)構(gòu)。該酶有兩段跨膜區(qū)，分別位于282到304及386到408氨基酸殘基之間，是酶蛋白錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的肽段。1到281及409到417氨基酸殘基的肽段位于酶蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外側(cè)，其中包括與酶活性中心相關(guān)的47VSRSF52、Y70、R74、77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217和R225等保守序列。這些肽段和氨基酸殘基的分布特點(diǎn)應(yīng)與酶的催化功能相適應(yīng)。

序列分析發(fā)現(xiàn)，一些磷酸化位點(diǎn)可能是甜瓜SQS活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位。該酶共有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，均位于蛋白質(zhì)的表面。其中S48、S196、S249、S281、T78、T83、T144、T161，Y165、Y236、Y245和Y273 12個(gè)磷酸化位點(diǎn)位于酶蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外側(cè)，S358、T318和T327 3個(gè)磷酸化位點(diǎn)位于酶蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)側(cè)，S407

和Y387 2個(gè)磷酸化位點(diǎn)位于酶蛋白的跨膜區(qū)。位于酶蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)的12個(gè)磷酸化位點(diǎn)可能參與酶的活性調(diào)節(jié)。特別是S48恰好位于與酶活性中心相關(guān)47VSRSF52模體中，因而提示其可能是酶活性調(diào)節(jié)的一個(gè)關(guān)鍵性磷酸化位點(diǎn)。此外，在陸生SQS中目前已發(fā)現(xiàn)21個(gè)正選擇位點(diǎn)，分別為Q33、Q59、E133、S189、S194、S196、I265、K278、V381、R382、S383、E384、P385、I386、P389、T390、A408、R410、F411、P412和N414（劉墉等，2013）。其中S196分布于甜瓜SQS表面并位于酶蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外側(cè)，因此，正選擇位點(diǎn)S196可能是該酶活性調(diào)節(jié)的另一個(gè)關(guān)鍵性磷酸化位點(diǎn)。

以甜瓜SQS基因 ORF序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹得到系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，表明甜瓜等陸生植物的SQS基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹可以較好地反映不同物種間的親緣關(guān)系。推衍的甜瓜SQS氨基酸序列與其它植物比對(duì)結(jié)果顯示，該酶不具備特征性的氨基酸位點(diǎn)。葫蘆科植物SQS與其他植物SQS的氨基酸序列比對(duì)顯示，葫蘆科植物SQS氨基酸序列也不具備特征性的氨基酸位點(diǎn)。

總之，本研究克隆了葫蘆科植物甜瓜SQS基因，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析甜瓜SQS分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該酶磷酸化位點(diǎn)S48和S196可能是酶活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵位點(diǎn)。這些結(jié)果為SQS酶活性和Cus生物合成調(diào)節(jié)研究提供了新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

HOU R， GONG NX， LIU FT， 2011. Cloning and bioinformatics analysis of squalene synthase gene （SQS） from Jatropha curcas L. [J]. J Trop Subtrop Bot， 19（5）： 391-399. [侯嶸，龔諾希，