紅海欖內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其抑制魚(yú)類致病菌活性研究

摘要： 紅海欖為紅樹(shù)科紅海屬植物，廣泛分布于熱帶海岸的紅樹(shù)林中，為真紅樹(shù)植物的典型代表。該研究以廣西山口紅樹(shù)林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)紅海欖為對(duì)象，應(yīng)用稀釋涂布法和三線法從紅海欖各組織中分離出17株內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)各菌株形態(tài)特征觀察及利用16S rRNA序列基因和韋恩圖分析其內(nèi)生細(xì)菌多樣性。結(jié)果表明：17株內(nèi)生細(xì)菌分屬3個(gè)門5科7屬8種，Micromonospora和Mangrovibacter屬為其優(yōu)勢(shì)類群。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)紅海欖根莖葉等組織的內(nèi)生細(xì)菌類群差別較大，僅有1個(gè)相同菌屬，17株菌中有3株菌與已有細(xì)菌物種典型菌株的全長(zhǎng)16S rRNA基因相似性低于97%，代表著潛在的新屬或新種。運(yùn)用紙片法研究8株內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對(duì)魚(yú)類致病菌副溶血弧菌活性抑制效果，發(fā)現(xiàn)3株內(nèi)生細(xì)菌（H003、H013、H009，濃度5 mg·mL1）的代謝產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，其抑菌圈直徑分別達(dá)到（8.4±0.07）、（8.2±0.07）、（8.3±0.14）mm。該研究結(jié)果表明紅海欖中具有較好的內(nèi)生細(xì)菌多樣性和抑菌活性，為今后研究其內(nèi)生細(xì)菌的化學(xué)多樣性及其應(yīng)用提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 紅海欖， 內(nèi)生細(xì)菌， 物種多樣性， 副溶血弧菌， 抑菌活性

中圖分類號(hào)： Q946，Q939.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）03030807

Abstract： Rhizophora stylosa is an evergreen tree with prop roots， and a common tree found in tropical coastal mangrove forests， widely distributed in tropical coastal mudflats. As a typical representative of the mangrove， R. stylosa has rich endophytic diversity with little research. The study objects of R. stylosa were collected from Shankou National Nature Reserve， Guangxi， China. From stem， root， leaf and other tissues， seventeen endophytes were isolated with the dilution coating method and the threewire method. We Observed their morphological characteristics， 16S rRNA and Venny Chart were utilized to analyze the diversity of their endogenous bacterial. Depending on the results of diversity analysis， we could find that these strains have different morphological characteristics and they could classified into three doors， seven genera， five families and eight species. Further analysis showed that endophytic bacteria groups of R.stylosa root， stem， leaf and other organizations vary different， only one same genus was Mangrovibacter plantisponsor. Micromonospora and Mangrovibacter genus were its dominant bacteria， the proportion was 29.4% and 17.6%， respectively. Among them， the most endophytic bacteria within the root， the proportion was 47.1%. Seventeen strains belong to three doors， wherein the most number of bacteria were Proteobacteria， accounting for 52.9%， then Actinomycetes door accounted for 41.2%. In those isolated strains， three strains of bacterial species with the fulllength 16S rRNA gene similarity less than 97%， may be possible new genera or new genus and had potential research value. Vibrio parahaemolyticus was a zoonotic bacteria caused some damage to uman health， severe cases even death. To test anti Vibrio parahaemolyticus activity of the crude extract of strains isolated， we used filter paper method， and the results indicated that three strains（H003， H009， H013， 5 mg·mL1） had a strong antibacterial activity against Vibrio parahaemolyticus， their inhibition zone could reach （8.4±0.07）， （8.2±0.07）， and （8.3±0.14） mm， respectively. Endophytic bacteria of Rhizophora stylosa were genetically diverse and most of them showed strong inhibition effect against Vibrio parahaemolyticus. The results provides the essential material basis for the further study of its chemical diversity and utilization of resources.

Key words： Rhizophora stylosa， endophytic bacterial， diversity， Vibrio parahaemolyticus， antibacterial activity

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種人畜共患病原菌。副溶血弧菌為革蘭氏陰性嗜鹽菌，主要分布在沿海地區(qū)的魚(yú)蝦、貝類海產(chǎn)品中，人們食用被該菌污染的海產(chǎn)品，輕者引起腹瀉、嘔吐和惡心等腸胃炎反應(yīng)，重者可引起敗血癥（高磊等，2014；葉靈瓊等，2011；林強(qiáng)等，2011）。近年來(lái)，由副溶血弧菌引起的食物中毒事件已得到廣泛關(guān)注，是世界范圍嚴(yán)重食源性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一（林強(qiáng)等，2012）?？股厥侵委熢摼鸺膊〉乃幬?，但隨著抗生素使用量的增加，耐藥株也不斷增加，因此研究其他有效的抑制藥物顯得尤其重要（葉靈瓊等，2011）。海洋低等生物海洋微生物的提取物對(duì)副溶血弧菌在內(nèi)的弧菌具有顯著的抑制活性（張全忠等，2011；韋露等2015）。從海洋生物中找出有效抑制藥物是研究開(kāi)發(fā)新的生物防治藥物的研究熱點(diǎn)。

紅海欖（Rhizophora stylosa）屬于紅樹(shù)科（Rhizophoraceae）紅海屬（Rhizophora），是生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶海岸潮間的一種特殊植物群體（郭先霞等，2006）。紅海欖內(nèi)生菌的研究?jī)H有內(nèi)生真菌多樣性和抑菌的研究（許婷婷等，2009；吳尚英等，2010），內(nèi)生細(xì)菌尚未見(jiàn)有報(bào)道。本研究以紅海欖為對(duì)象，對(duì)其各部位的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合16S rRNA基因序列信息和韋恩圖分析研究其物種多樣性。同時(shí)，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性研究，以期獲得具有抑菌活性較強(qiáng)的菌株，為后期篩選相關(guān)活性化合物提供良好的研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備TGradient多功能梯度PCR儀，GelDOC 2000 凝膠成像系統(tǒng)，JYSPB水平凝膠電泳裝置，SWCJ2F 潔凈工作臺(tái)，HVE5高壓蒸汽滅菌鍋，ISRDS3恒溫震蕩器，SHZCB 循環(huán)水式多用真空泵，HH. B11BSⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱，VCX500超聲細(xì)胞破碎儀。

1.2.2 供試細(xì)菌副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）由廣東海洋大學(xué)龐歡瑛副教授饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 樣本來(lái)源及采集方法菌株載體采集于廣西山口國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本工程師鑒定為紅海欖。采集的菌株載體在24 h內(nèi)完成菌株分離。

1.2.2 菌株的分離純化菌株的分離純化參照李菲等（2015）的方法進(jìn)行。用無(wú)菌海水分別清洗紅海欖的根、莖、葉等各組織器官，切取一部分組織器官進(jìn)行后續(xù)處理。用5%次氯酸鈉將各部分組織浸泡1 min，無(wú)菌海水沖洗干凈，75%的酒精溶液浸泡1 min，無(wú)菌海水沖洗3遍去除酒精。取3×3 cm的樣品進(jìn)行研磨，加入1 mL無(wú)菌水，混勻后，得到101植物懸液，依次用無(wú)菌水稀釋制成102、103的樣液，分別取各梯度稀釋樣液0.2 mL，接種于ISP2、M4、M5、M7、M9、M10、AGG等7種海水培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布培養(yǎng)，每個(gè)做3個(gè)平行，28 ℃培養(yǎng)2～5 d后觀察菌落，按照菌株的菌落特征（顏色、大小、形態(tài)）進(jìn)行區(qū)分。利用三線法對(duì)典型的菌落進(jìn)行劃線純化，純化后的菌株保藏在20%（W/V）甘油管保藏管中，保藏溫度為-80 ℃，同時(shí)制成凍干牛奶管保藏于4 ℃。

1.2.3 菌株的16S rRNA基因序列分析DNA提取和16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增參照周發(fā)林等（2004）的方法進(jìn)行。利用GenBank BLAST對(duì)紅海欖的內(nèi)生菌線粒體DNA 16S rRNA與庫(kù)中細(xì)菌進(jìn)行同源性比對(duì)。擴(kuò)增和測(cè)序引物為27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCA3′）和1492R（5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′），PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，將所得產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將純化目的片段進(jìn)行切割回收。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性搜索，獲得同源性相近的菌種序列，取同源性高16S rRNA基因序列為參考對(duì)象，采用Clustal X進(jìn)行多重比對(duì)，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用MEGA 5.0軟件的“NeighborJoining”法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，自展數(shù)（Boostrap）為1 000檢測(cè)各分支的置信值，對(duì)各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析（何建瑜等，2013；周煜等，2000）。通過(guò)venny在線分析網(wǎng)站，在屬級(jí)水平上對(duì)紅海欖根、莖、葉來(lái)源細(xì)菌類群分布進(jìn)行韋恩圖分析（Tap et al，2009）。

1.2.4 菌株代謝粗產(chǎn)物的獲取從ISP2固體培養(yǎng)基上挑取菌絲接種到裝有50 mL ISP2液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于28 ℃、180 r·min1條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 d；使用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間15 min，等體積乙酸乙酯萃取3次，真空濃縮干燥后得代謝粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶于200 μL DMSO中，用PBS緩沖溶液將其稀釋到濃度為5 mg·mL1、0.22 μm的過(guò)濾頭進(jìn)行過(guò)濾，裝于已滅菌樣品瓶中，即得所需藥劑。

1.2.5 抑菌活性測(cè)定使用紙片法測(cè)試所得細(xì)菌代謝粗產(chǎn)物對(duì)魚(yú)類致病菌—副溶血弧菌的抑制活性。將副溶血弧菌接種到TSB液體培養(yǎng)基中恒溫震蕩（28 ℃、180 r·min1）培養(yǎng)12 h制備菌懸液，吸取200 μL菌懸液滴在TSB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，制成含弧菌的平板。將滅菌后的濾紙片（φ6.0 mm）用鑷子將其平貼在培養(yǎng)基上，吸取5 μL藥劑于濾紙片上，28 ℃溫度下培養(yǎng)1 d，觀察抑菌圈的大小判斷其抑菌活性。其中，陽(yáng)性對(duì)照為5 mg·mL1卡那霉素，陰性對(duì)照為5 μL DMSO。每組3個(gè)平行。

2結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化及其多樣性

根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌菌落的不同表觀特征（顏色、大小、形態(tài)）和出現(xiàn)時(shí)間的不同，從紅海欖各組織器官中共分離出17株內(nèi)生細(xì)菌，依次編號(hào)為H001、H002……H017，各菌株形態(tài)詳見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，17株內(nèi)生菌顏色多為白色和黃色，表面光滑不透明。經(jīng)送美吉公司進(jìn)行測(cè)序后得到各菌株的種和屬，詳見(jiàn)表1。表1顯示，17株內(nèi)生菌中，從紅海欖葉子中分離出5株內(nèi)生細(xì)菌，莖中分離出4株，根中分離出6株，其中根莖葉中含有相同菌，如H001、H004、H005同為Pantoea Dispersa（泛菌屬）；H008、H002、H017同為Mangrovibacter plantisponsor（紅樹(shù)桿菌屬）等。由表1可知，此次分離出的17株內(nèi)生菌隸屬5科7屬8種，對(duì)17株內(nèi)生細(xì)菌去重合并后得到8株內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 紅海欖可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌群類比較

在屬級(jí)水平上對(duì)紅海欖的根、莖、葉來(lái)源細(xì)菌進(jìn)行venny分析，韋恩圖（圖2）顯示，不同部位中的可培養(yǎng)細(xì)菌雖有差異，但也含有相同的菌屬和菌株。其中，從根部樣品中分離獲得的屬有5個(gè)，莖中分離的屬有4個(gè)，葉中分離到的屬有3個(gè)。根、莖、葉樣品中有一個(gè)共有菌屬為Micromonospora ，占12.5%。根和莖有2個(gè)相同菌株分別為Mangrovibacter plantisponsor 和 Paracoccus limosus ，根與葉也有2個(gè)相同菌，莖葉有1個(gè)相同菌。

2.3 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)比對(duì)16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果，將17株內(nèi)生菌進(jìn)行基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析（圖3）。圖3結(jié)果顯示，從紅海欖中共分離的17株內(nèi)生菌分別屬于3個(gè)類群，即變形菌門、厚壁菌門和放線菌門。其中，變形菌門菌株數(shù)量最多，占52.9%；而變形菌門內(nèi)生細(xì)菌又分屬兩個(gè)綱，即γ變形菌綱和α變形菌綱；其次是放線菌門，占41.2%。

從屬的分類水平上看，分離得到的17株菌中，小單孢菌屬有5株，占29.4%；其次是泛菌屬和紅樹(shù)桿菌屬，占17.6%；副球菌屬和芽孢桿菌屬在紅海欖中分布較少，分別分離出2株和1株。

2. 4 紅海欖內(nèi)生細(xì)菌的抑制海洋魚(yú)類致病菌活性

以副溶血弧菌為指示菌，采用紙片法對(duì)其進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，選取8株菌株進(jìn)行發(fā)酵后，采用乙酸乙酯溶液萃取其發(fā)酵液，最終獲得其代謝粗產(chǎn)物，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2和圖4看出，H003、H013、H009對(duì)副溶血弧菌表現(xiàn)出了較明顯的抑菌作用，其抑菌圈直徑都在8.0 mm以上，其中H003的抑制最強(qiáng)，達(dá)到了8.4 mm。

3討論與結(jié)論

本研究以廣西山口國(guó)家級(jí)紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)的紅海欖為研究對(duì)象，對(duì)其根、莖、葉進(jìn)行采樣，利用7種培養(yǎng)基對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化。研究表明，從紅海欖的根莖葉中共分離出17株內(nèi)生細(xì)菌，隸屬5科7屬，多樣性較為豐富。在分離出的內(nèi)生細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，不同的部位分離出菌株數(shù)量不同，其中從根部中分離出菌株最多，為8株，其次是莖，葉子最少。根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量和屬類上的差異可以推斷，細(xì)菌的多樣性從根部向上是逐步減少的， 土壤是內(nèi)生細(xì)菌的主要來(lái)源，植物組織維管束的蒸騰作用使得土壤內(nèi)微生物進(jìn)入宿主后由地下部分隨著水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸向地上部位擴(kuò)增，因而各組織內(nèi)部分內(nèi)生菌有相同菌屬，且地下部位內(nèi)生菌的數(shù)量多于地上部位（Hollis，1951）。

本研究通過(guò)研究紅海欖內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3株內(nèi)生菌對(duì)其有明顯的抑菌效果，抑菌圈直徑均在8.0 mm以上，這對(duì)開(kāi)發(fā)新的預(yù)防藥物有一定的指導(dǎo)意義。有效菌中有兩株菌（H003、H013）同屬于小單孢菌屬，已有研究表明，小單孢菌屬產(chǎn)生的廣譜抗生素，在抗腫瘤方面具有著廣泛的應(yīng)用，抗菌方面已研究表明其對(duì)金黃色葡萄球菌、彎曲假單孢菌、谷草芽孢桿菌、尖刀鐮孢菌均具有抑制效果（張曉敏等，2013）；其次生代謝產(chǎn)物是新的生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源（程元榮和鄭衛(wèi)，2006；張學(xué)武和張建麗，2006）。小單孢菌屬在抑制魚(yú)類致病菌方面還未見(jiàn)有詳細(xì)報(bào)道，作用物質(zhì)及其作用機(jī)理還需進(jìn)一步的深入研究。

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