中甸燈臺報春與鵝黃燈臺報春的系統(tǒng)演化

摘要： 中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春在形態(tài)上較為相似，通常被認為是親緣關系較近的物種。該研究選取核基因ITS序列和葉綠體trnLF為分子標記，利用貝葉斯的方法構建系統(tǒng)樹，在用兩種分子標記構建的系統(tǒng)樹中，兩種報春均以0.81的支持率聚成一個分支，明確了兩種報春的姐妹種關系。首先，通過選取兩個物種的五個形態(tài)學性狀，進行主成分分析，聚類結果中兩種報春各自的個體分別聚在兩塊區(qū)域，表明兩種報春的形態(tài)學性狀產(chǎn)生了明顯的分化，且中甸燈臺報春的花部各性狀值明顯大于鵝黃燈臺報春，表明花部綜合征和繁育系統(tǒng)間的相關聯(lián)系。然后，通過用8對SSR分子標記對兩種報春進行STRUCTURE聚類分析，結果檢測K的最適值為2，此時中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春的個體各自以不同顏色聚成界限清晰的兩塊區(qū)域，揭示了兩種報春在分子水平上也產(chǎn)生了顯著而穩(wěn)定的分化，通過Ima2軟件，依據(jù)葉綠體聯(lián)合序列，計算了兩種報春的分化時間大約是在更新世，推測這兩個姐妹種的物種分化受更新世氣候動蕩和一些地質(zhì)歷史事件的影響。最后，運用maxent軟件分析兩個物種的生態(tài)位差異，結果表明最干季節(jié)降水量、年均降水量和季節(jié)性降水量對中甸燈臺報春的分布有重要影響，最冷季節(jié)平均溫度、最干月降水量、年均降水量和季節(jié)性降水量對鵝黃燈臺報春的分布有重要影響，兩個物種間的生態(tài)位產(chǎn)生了分化。由此推測，這種生態(tài)位的差異是物種分化的結果，同時也是物種間系統(tǒng)演化的重要驅(qū)動力。

關鍵詞： 中甸燈臺報春， 鵝黃燈臺報春， 姐妹種， SSR， 生態(tài)位

中圖分類號： Q949文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）02015310

Abstract： Primula chungensis and P. cockburniana， are usually considered as close species for the similar morphological traits. We reconstructed the phylogenetic trees with the Bayesian inference method based on two DNA fragments， the molecular marker we chose was internal transcribed spacer and chloroplast fragment trnLF， among the two phylogenetic trees we reconstructed， P. chungensis and P. cockburniana got into a branch with 0.81 support， which indicated that P. chungensis and P. cockburniana were sister species. we also utilized principle component analysis based on five morphological traits， and the two species got into two clusters， which indicated that in term of the morphology， there was significant differentiation between the two species， and this differentiation had an important relationship with the mating system， and we discussed the relationship between flora syndrome and breeding system of these two species. We chose eight pairs of SSR primers and sent the polymerase chain reaction production to the company to measure the peak value， according to the anlysis of the softwae STRUCTUER based on the nuclear microsatellite marker， the appropriate value of K was two， the result of structure consisted of two area and with different colors， the red area represented the population of P. cockburniana， and the green area represented the populations of P. chungensis， which meant that there was significant and stable differentiations between the two species on the molecular level. Then we calculated the differentiation time between the two species with Ima2 based on the united chloroplast fragments， which showed turbulent environment and geological and historical accidents in Pleistocene may have an important effect on the differentiation of the two species. Finally we analysed the ecological niches of the two species with the software maxent. The results indicated that the precipitation of the driest quarter， range of annual temperature， isothermality and the annual average precipitation had important effects on the distribution of P. chungensis， the mean temperature of the coldest quarter， precipitation of the driest month， annual average precipitation and the precipitation seasonality had an important effect on the distribution of P. cockburniana. We speculate that the different ecological niches had been influenced by the phylogenetic evolution of the species， and in turn the different niches can also promote the phylogenetic evolution process.

Key words： Primula chungensis， P. cockburniana， sister species， SSR， ecological niche

物種形成是基本的進化過程，是指一個物種通過適應不同生境分化出新物種的過程，也是生物多樣性產(chǎn)生的基本機制（Cracraft， 1983）。在探究物種形成過程中，界定物種間的系統(tǒng)位置及其相互關系，對于認識生物多樣性的形成過程具有重要意義，而物種分化的機制和過程，一直是進化生物學領域研究的熱點和難點（Michalke， 2012）。物種間的分化程度、進化狀況都強烈地受到過去歷史事件的影響，因此對物種分化現(xiàn)狀的分析，可用于推測過去的氣候、地質(zhì)歷史事件（Strasburg et al， 2012）。對物種或種群進化歷史的揭示，可為分析物種的進化潛能提供重要信息，從而能對稀有或瀕危物種采取科學有效的保護措施（Nosil Feder， 2012）。

報春花屬（Primula L.）是報春花科（Primulaceae）的第一大屬，共有25個組，近500余種（胡啟明，1990）。廣布于歐亞大陸溫帶地區(qū)，沿東喜馬拉雅山兩側(cè)到云南、四川西部是本屬的現(xiàn)代分布中心（吳之坤等，2006）。報春花是世界著名的觀賞花卉，燈臺報春組（sect. Proliferae）花色艷麗，花序獨特，具有很高的觀賞價值（Richards，2014）。Pax（1888）基于顯著的輪狀花序?qū)?5～30個物種歸并為燈臺報春組。燈臺報春組擁有原始的輪狀花序和三溝型花粉，種間容易雜交，種間關系比較復雜（Wilkins， 2011）。Martins et al（2003）用ITS序列構建過報春花科的系統(tǒng)樹。Vos et al（2014）為了探究花部綜合征和花柱繁育系統(tǒng)的關系，構建了報春花屬124種報春的系統(tǒng)樹，然而燈臺報春組內(nèi)的系統(tǒng)進化關系很少有學者探究，物種內(nèi)的進化歷史也值得深入探討。

中甸燈臺報春（Primula chungensis）是燈臺報春組多年生的草本植物，根莖極短；葉橢圓形、矩圓形或倒卵狀短圓形，先端圓形，基部楔狀漸窄，邊緣具不明顯的波狀淺裂和不整齊的小牙齒，中脈和側(cè)脈寬扇，在下面稍隆起，葉柄不明顯或長達葉片的1/4；花葶通常1 枚，自葉叢中抽出，節(jié)上微被粉，具傘形花序?；ㄆ?-6 月，單花花期4～6 d，每個植株花期約1個月。模式標本采于云南香格里拉縣，主要分布于云南西北部、四川西南部和西藏東南部。

鵝黃燈臺報春（P. cockburniana）是二年生草本植物，具極短的根莖和成叢的支根；葉矩圓形至矩圓狀倒卵形，先端圓形，基部近圓形或闊楔形，幾乎不下延，因而葉片與葉柄具明顯的界限，邊緣呈不明顯的淺波狀，具細密的小牙齒，上面綠色，下面淡綠色，被粉質(zhì)腺體；花期6-7 月，果期8 月。主要產(chǎn)于四川西部。生長于高山潮濕草地和林緣，海拔2 900～4 200 m。模式標本采自康定。

中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春的形態(tài)學差異在于：鵝黃燈臺報春花深橙黃色至橙紅色，葉片基部鈍圓或闊楔形幾不下延，與葉柄有明顯的界限，中甸燈臺報春花淺橙黃色，葉片基部楔狀漸狹窄（胡啟明， 1990）。除了花色和葉片的差異外，兩個物種間最顯著的差異在于：中甸燈臺報春存在花柱異型的現(xiàn)象，異型花柱是指被子植物中一種特殊的花多態(tài)現(xiàn)象和雌雄異位形式，即在一個居群內(nèi)，根據(jù)雌蕊和雄蕊的高度，可以區(qū)別出兩種或兩種以上花的表型，而表型之間雌雄蕊的高度是互補的（Darwin， 1877； Ganders， 1979； Barrett Richards，1990）。在中甸燈臺報春中，有三種花柱形態(tài)，即長花柱型、短花柱型和等高花柱型，而鵝黃燈臺報春只有一種花柱類型，即等高花柱類型（圖1）。兩個物種間的差異如表1所示，然而由于花色變異和葉片與葉柄的過渡程度的差異，在野外鑒定中很容易將這兩個種混淆。

本研究試圖通過構建系統(tǒng)樹來闡明中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春的關系。通過對其形態(tài)學性狀的測量，生境的考察以及分子方面的分析鑒定，對這兩個物種進行深入的調(diào)查研究，這對其引種及資源保護具有重要的參考意義，并且對研究報春花的起源和進化提供重要的參考價值。通過對其分化時間的計算，以及生態(tài)位的模擬檢測，探討了促進物種形成的驅(qū)動力，并且推測了在物種形成過程中，不同的選擇壓力對植物形態(tài)學性狀的影響。

1材料與方法

1.1 材料

中甸燈臺報春采樣居群集中在西藏東南部，鵝黃燈臺報春主要集中分布在四川西部，每個居群采集20～30個植株新鮮、完整的葉片，植株間隔至少10 m，采集的葉片用硅膠迅速干燥后帶回實驗室進行總DNA提取。共采集中甸燈臺報春4個居群和鵝黃燈臺報春9個居群。此外，還采集了燈臺報春組的粉被燈臺報春（Primula pulverulenta），桔紅燈臺報春（P. bulleyana），霞紅燈臺報春（P. beesiana），橙紅燈臺報春（P. aurantiana）。采樣點信息見表2。

1.2 花形態(tài)特征觀測

在野外居群采樣過程中，隨機采集鵝黃燈臺報春30朵完全開放的花，鑒于中甸燈臺報春有三種花柱表型，每種表型選擇30朵，共選擇90朵進行形態(tài)學性狀測量。對采集的報春花進行縱向解剖，用標尺放一旁做比例尺，照相后保存，通過軟件ImageJ （Abràmoff， 2004）測量關鍵的花形態(tài)學性狀。包括花冠檐直徑、花冠管長度、花冠口直徑、花藥長度、柱頭寬5個性狀（圖2）。從這5個性狀里提取出兩條最主要的軸axi.1，axi.2。先用R軟件里的knn包里的kmeans函數(shù)進行聚類分析，再用ggplot2包里的geom_point函數(shù)繪制聚類圖。

1.3 系統(tǒng)分析與SSR分析

植物總DNA的提取采取改良的CTAB的方法（Doyle，1987）。ITS（internal transcribed spacer）序列和葉綠體序列是構建物種系統(tǒng)樹常用的分子標記（Ngamriabsakul et al， 2000； Martins et al， 2003）。ITS 序列擴增采用的引物為ITS1 （5′AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATAT GC3′）（White et al， 1990）。trnLF序列擴增采用通用引物為（5′CGAAATCGGTAGACGCTACG3′）和通用引物（5′ATTTGAACTGGTGACACGAG3′）（Taberlet et al， 1991）。每個物種選取2～3個個體進行目的條帶擴增，PCR的反應體系為15 μL，在反應過程中，設置94 ℃預變性4 min， 94 ℃變性1 min，退火52～55 ℃ 1 min，72 ℃延伸1.5 min，設置35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min， 擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)銀染后觀察結果，產(chǎn)物送公司進行測序。我們選取了燈臺報春組的16個近緣種基于ITS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以報春花屬鐘花組的錫金報春（Primula sikkimensis）作為外類群。其中，8種報春的ITS序列在Genebank下載，包括日本燈臺報春（P. japonica）、川東燈臺報春（P. mallophylla）、滇緬燈臺報春（P. burmanica）、橙紅燈臺報春、芒齒燈臺報春（P. serratifolia）、小花燈臺報春（P. prenantha）、澤地燈臺報春（P. helodoxa）、玉山燈臺報春（P. miyabeana）。選取燈臺報春組的12個近緣種基于葉綠體trnLF序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以點地梅屬的點地梅（Androsace umbellata）作為外類群。其中，7種報春的葉綠體序列在Genebank下載，包括橙紅燈臺報春（P. aurantiana）、齒葉燈臺報春（P. serratifolia）、小花燈臺報春（P. prenantha）、燈臺報春（P. prolifera）、澤地燈臺報春（P. helodoxa）、玉山燈臺報春（P. miyabeana）、香海仙報春（P. wilsoni）。PCR后的產(chǎn)物進行測序，測序結果導入軟件Sequencher 4.14（Codes， 2000）進行編輯，用MegAlign （Clewley， 1997）將堿基序列調(diào)成矩陣的模式，用MEGA4.0 （Tamura et al，2007）打開調(diào)整編輯序列，用jmodeltest 0.1 （Posada， 2008）選取合適的模型，用mesquite（Maddison，2001）將矩陣調(diào)整成nex的模式，用MrBayes （Ronquist Huelsenbeck， 2003）軟件分別對ITS序列和trnLF序列進行貝葉斯建樹。

SSR（sequence tagged microsatellite site）序列是廣泛存在于真核生物基因組中的較短重復序列，在研究居群的遺傳結構和物種間的親緣關系等方面有重要作用（Barker， 1997； Mateus et al， 2004）。吳之坤和張長芹（2010）基于轉(zhuǎn)錄組開發(fā)了海仙報春的54對SSR引物，本研究從中篩選出8對容易擴增多態(tài)性較好的SSR引物序列（表3）。將擴增產(chǎn)物先進行熒光標記后殖民再進行峰值的測定。選取中甸燈臺報春4個居群共154個個體，鵝黃燈臺報春9個居群共203個個體進行分析，熒光標記PCR的反應條件為巢式PCR（Schuelke，2000）。 設置94 ℃預變性4 min，退火52～55 ℃，72 ℃延伸1.5 min；設置30個循環(huán)，94 ℃變性1 min，退火52～55 ℃，72 ℃延伸1.5 min；設置8個循環(huán)，結果用軟件GeneMaker v2.2.0（Lukashin Borodovsky，1998）進行峰值測定。

1.4 物種分化時間的計算及生態(tài)位的比較

Ima（isolation with migration analysis）是基于隔離-遷移模型，對基因位點間的差異性進行分析，描述兩個關系緊密的群體或物種關系的軟件（Hey Nielsen， 2007），針對不同的位點，可以采用不同的核苷酸替代模型和進化速率，我們選取葉綠體片段進行Ima分析。其中，鵝黃燈臺選14個個體，中甸燈臺選21個個體，聯(lián)合葉綠體psbAtrnH，atpBrbcL，trnLF片段。設置葉綠體每個位點每年的突變率平均為1.52×109（Yamane et al， 2006），置信區(qū)間設置為（0.000 001，0.000 1）（Li Graur， 1991； Richardson et al， 2001）。Maxent即最大熵模型（maximum entropy mode），通過對物種已知分布數(shù)據(jù)和環(huán)境數(shù)據(jù)，探究對物種分布影響最大的氣候因子（Phillips et al， 2006）。將實地采集的物種信息及在CVH中查到的信息進行搜集，聯(lián)合在標本館中搜集的信息進行整理歸納，從wordclim里下載19個生態(tài)因子，運用現(xiàn)有物種分布信息監(jiān)測物種生態(tài)位的差異。

2結果與分析

2.1 中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春的系統(tǒng)發(fā)育關系

核基因ITS序列排列后片段長度為631 bp， 用jModelTest 0.1尋找用于Bayesian分析的模型，通過AIC方法算出最適模型為TPM1uf+I+G，葉綠體基因序列排列后片段長度為657 bp， 用AIC方法算出最適模型為GTR。在用貝葉斯構建的兩個系統(tǒng)樹（圖3）中，中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春都以較高的支持率0.81聚成一個分支，故認為，中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春為親緣關系很近的姐妹種。

2.2 兩種報春的形態(tài)學差異

從圖4中的散點分布可以看出，中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春的個體分別聚在兩塊區(qū)域，且兩塊區(qū)域間區(qū)分較明顯，這從形態(tài)學上來說，兩個姐妹種間的差異明顯且穩(wěn)定，兩個姐妹種之間產(chǎn)生了形態(tài)學上穩(wěn)定的分化。從各解剖結構測量值上，可以知道中甸燈臺報春的花朵顯著大于鵝黃燈臺報春，我們推測這種花部特征與交配系統(tǒng)密不可分， 花部形態(tài)對訪花昆蟲對花部的拜訪有重要影響。鵝黃燈臺報春有很高的自交親和性，而通過對中甸燈臺報春進行套袋實驗表明，傳粉昆蟲對中甸燈臺報春的繁殖成功具有很高的貢獻率，且在野外實驗和觀測中，熊蜂為其有效的傳粉者，故相對于鵝黃燈臺報春來說，中甸燈臺報春對花設計的資源投入相對較多，擁有更大的花展示，表明交配系統(tǒng)在塑造花部性狀過程中的重要作用。

2.3 SSR的structure聚類分析

通過對這兩個物種共357個個體進行structure聚類分析，我們看到，無論是L′（K）值還是Delta K值，都是在K值為2時，其值具有明顯的轉(zhuǎn)折點，即K的最適值為2，當K=2時，可以看到聚類結果形成顏色分明的兩個分支，其中綠色的是中甸燈臺報春的個體，紅色的是鵝黃燈臺報春的個體。從聚類結果（圖5）可以看出，中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春在分子水平上是聚類明顯的兩個物種。即兩個物種間的分子組成成分相差較明顯，在分子方面，兩個物種間也產(chǎn)生了穩(wěn)定的分化。

2.4 物種間的分化時間

聯(lián)合的葉綠體的序列長度為1 650 bp，通過Ima2計算，兩個物種間的分化時間大約在13.058 2萬年前，處于更新世時期，更新世時期地球經(jīng)歷了劇烈的氣候動蕩和地質(zhì)形成過程。對動植物來說，更新世時期氣候的動蕩對物種的形成和分化以及分布格局有重要的影響，特別是對今天的姐妹種之間的形成和分化有重要的作用（Soltis， 2013）。這種冰期間冰期氣候的劇烈變化可能對這兩種報春的形成和分化產(chǎn)生了重要的影響。

2.5 物種間生態(tài)位的差異

共收集了中甸燈臺報春9個地理分布信息，鵝黃燈臺報春18個地理分布信息。通過軟件對生態(tài)位進行檢測，從氣候因子的貢獻率可以看出來，在中甸燈臺報春中，bio17、bio7、bio3、bio12即最干季節(jié)降水量、年均溫變化范圍、等溫性和年均降水量對其分布有重要的影響（表4）。在鵝黃燈臺報春中，bio11、bio14、bio12、bio15即最冷季節(jié)平均溫度、最干月降水量、年均降水量和季節(jié)性降水量對其分布有重要的影響（表5）。由此可見，兩種報春的生態(tài)位發(fā)生了一定程度的分化。

3討論

報春花屬燈臺報春組擁有較原始的輪狀花序和三溝型花粉，組間物種因為形態(tài)和生境上的相似性，種間易雜交（Wilkins， 2011）。因此，通過多方面探究理清組內(nèi)的物種關系，對報春花屬的起源和進化有重要意義。本研究通過用貝葉斯的方法構建關于核糖體和葉綠體的系統(tǒng)樹，兩棵樹一致表明了中甸燈臺報春和鵝黃燈臺報春的姐妹種關系。除去花柱異型的特征，我們用另外五組形態(tài)學性狀進行主成分聚類分析，發(fā)現(xiàn)兩種報春的性狀產(chǎn)生了穩(wěn)定的分化，即中甸燈臺報春的各花部性狀大于鵝黃燈臺報春的。而通過SSR的分析數(shù)據(jù)表明， 在分子上兩個姐妹種的遺傳背景也發(fā)生了穩(wěn)定而顯著的分化。通過對兩種報春種間關系的界定，為物種的引種和保護提供了參考價值。Ima的分析表明，這兩個分化較為穩(wěn)定的姐妹種，其分化時間大約是在更新世時期，故我們推測更新世時期氣候的動蕩，地質(zhì)歷史的形成時期，特別是冰期間冰期的反復震蕩對全球氣候的影響，對姐妹種的分化產(chǎn)生了一定的促進作用。

花柱異型是由一對等位基因控制的性狀（Wedderburn Richards 1992； Nowak et al， 2015）。我們推測在更新世時期，兩個物種的共同祖先產(chǎn)生了基因突變，這種突變基因型由于適合特定的生境，故在適合自身生境范圍進行擴散。兩種報春的分布范圍產(chǎn)生了一定分化。而不同生境內(nèi)由于生態(tài)位的不同，選擇壓力不同，物種交配系統(tǒng)受到影響，產(chǎn)生了不同的交配系統(tǒng)?；ㄗ鳛楸蛔又参锏姆敝称鞴伲哂泻芨叩淖儺愋?，為適應不同的環(huán)境以利于植物的繁殖延續(xù)，花部性狀易產(chǎn)生適應性的進化（Dafni 1996； Bynum Smith， 2001； Galen， 2005）?；邬Z黃燈臺報春同型的花柱系統(tǒng)，且自交親和性較高，可能對傳粉昆蟲的依賴性較小，而在中甸燈臺報春中，傳粉昆蟲對中甸燈臺報春的繁殖成功有很高的貢獻率，故相對于鵝黃燈臺報春來說，對花展示的資源投入相對較多，中甸燈臺報春擁有更大的花展示。通過對這兩種報春的分化歷史進行探究，為更新世時期氣候的動蕩促進物種的分化提供了新的參考，同時揭示了花部綜合征和繁育系統(tǒng)間的相互聯(lián)系。

參考文獻：

ABRMOFF MD， MAGALHES PJ， RAM SJ， 2004. Image processing with ImageJ [J]. Biop Int， 11（7）： 36-42.

BARKER JSF， MOORE SS， HETZEL DJS， et al， 1997. Genetic diversity of Asian water buffalo （Bubalus bubalis）： microsatellite variation and a comparison with proteincoding loci [J]. Anim Genet， 28 （2）： 103-115.

BARRETT SCH， RICHARDS JH， 1990. Heterostyly in tropical plants [J]. Mem NY Bot Gard， 55： 35-61.

BYNUM MR， SMITH WK， 2001. Floral movements in response to thunderstorms improve reproductive effort in the alpine species Gentiana algida （Gentianaceae） [J]. Am J Bot， 88（6）： 1088-1095.

CLEWLEY JP， ARNOLD C， 1997. Megalign [J]. Seq Data Anal Guide： 119-129.

CODES G， 2000. Sequencher： Version 4.1. 2. Gene Codes Corporation [J]. Ann Arbor.

CRACRAFT J， 1983. Species concepts and speciation analysis [J]. Curr Ornithol， 1： 159-187.

DAFNI A， 1996. Autumnal and winter pollination adaptations under Mediterranean conditions [J]. Bocconea， 5（1）： 171-181.

DARWIN C， 1877. The different forms of flowers on plants of the same species [M]. London： John Murray

DOYLE JJ， 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull， 19： 11-15.

GALEN C， 2005. It never rains but then it pours： the diverse effects of water on flower integrity and function [J]. Reprod Alloc Plant： 77-95.

GANDERS FR， 1979. The biology of heterostyly [J]. NZ J Bot， 17（4）： 607-635.

HEY J， NIELSEN R， 2007. Integration within the Felsenstein equation for improved Markov chain Monte Carlo methods in population genetics [J]. Proc Nat Acad Sci， 104（8）： 2785-2790.

LI WH， GRAUR D， 1991. Fundamentals of molecular evolution [M]. Sinauer Associates.

LUKASHIN AV， BORODOVSKY M， 1998. GeneMark.hmm： new solutions for gene finding [J]. Nucl Acid Res， 26（4）：1107-1115.

MADDISON WP， MADDISON DR， 2001. Mesquite： a modular system for evolutionary analysis [J].

MARTINS L， OBERPRIELER C， HELLWIG FH， 2003. A phylogenetic analysis of Primulaceae sl based on internal transcribed spacer （ITS） DNA sequence data [J]. Plant Syst Evol， 237（1-2）： 75-85.

MATEUS JC， PENEDO MCT， ALVES VC， et al， 2004. Genetic diversity and differentiation in Portuguese cattle breeds using microsatellites [J]. Anim Genet， 35（2）： 106-113.

MICHALKE B， 2012. Manganese exposure and neurodegenerative diseasesinvestigations with Mn specation analysis [J]. Zentr Arbei Arbei Ergon， 62： 156-158.

NGAMRIABSAKUL C， NEWMAN MF， CRONK QCB， 2000. Phylogeny and disjunction in Roscoea （Zingiberaceae） [J]. Edin J Bot， 57（1）： 39-61.

NOSIL P， FEDER JL， 2012. Genomic divergence during speciation： causes and consequences [J]. Phil Trans Roy Soc BBiol Sci， 367（1587）： 332-342.

NOWAK MD， RUSSO G， SCHLAPBACH R， et al， 2015. The draft genome of Primula veris yields insights into the molecular basis of heterostyly [J]. Genome Biol， 16（1）： 1-17.

PAX F， 1888. Monographische übersicht über die Arten der Gattung Primula [M]. Leipzy： W. Engelmann.

PHILLIPS SJ， ANDERSON RP， SCHAPIRE RE， 2006. Maximum entropy modeling of species geographic distributions [J]. Ecol Mod， 190（3）： 231-259.

POSADA D， 2008. jModelTest： phylogenetic model averaging [J]. Mol Biol Evol， 25（7）： 1253-1256.

RICHARDS J， 2014. Primula [M]. London： Pavilion Books.

RICHARDSON JE， PENNINGTON RT， PENNINGTON TD， et al， 2001. Rapid diversification of a speciesrich genus of neotropical rain forest trees [J]. Science， 293（5538）： 2242-2245.

RONQUIST F， HUELSENBECK JP， 2003. MrBayes 3： Bayesian phylogenetic inference under mixed models [J]. Bioinformatics， 19（12）： 1572-1574.

SCHUELKE M， 2000. An economic method for the fluorescent labe ling of PCR fragments [J]. Nat Biotechnol， 18（2）： 233-234.