不同產(chǎn)地不同部位壯藥大羅傘樹定性和定量分析

摘要： 該研究采用TLC方法，對(duì)不同產(chǎn)地大羅傘樹進(jìn)行定性鑒別，并采用HPLC方法對(duì)大羅傘樹不同產(chǎn)地和不同部位的巖白菜素進(jìn)行了含量測(cè)定。其中，色譜柱為SinoChrom ODSBP C18（250 mm × 4.6，5 μm），流動(dòng)相為甲醇水（23∶77），流速為1.0 mL·min1，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。結(jié)果表明：10批不同產(chǎn)地大羅傘樹藥材的TLC均可檢出巖白菜素斑點(diǎn)；10批不同產(chǎn)地大羅傘樹藥材中巖白菜素平均含量為1.67%，但產(chǎn)地間含量差異較大，最高含量可達(dá)2.58%，最低含量0.95%；大羅傘樹不同部位中巖白菜素含量有所差異，地下部分（根及根莖）含量較高，平均值為4.05%，地上部分（莖枝和葉）含量較低，平均值為1.21%。所建立的大羅傘樹藥材TLC鑒別和巖白菜素含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確。該研究結(jié)果能準(zhǔn)確鑒別大羅傘樹藥材真?zhèn)?，并測(cè)定藥材中巖白菜素的含量，為大羅傘樹藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)，對(duì)于控制壯藥大羅傘樹藥材質(zhì)量具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 大羅傘樹， 巖白菜素， TLC， HPLC

中圖分類號(hào)： Q946文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 10003142（2016）02026005

Abstract： We indentified with TLC and analyzed the contents of Bergenin through different regions and parts of the Ardisia quinquegona to provide experimental basis for the Zhuang medicine quality evaluation and standard. The different habitats of A. quinquegona were identified by TLC. The contents of Bergenin in different habitats and parts of A. quinquegona were determinated by HPLC. Using SinoChrom ODSBP C18 chromatographic column （250 mm × 4.6， 5 μm） with the detection wavelength of 275 nm， methanolwater （23∶77） as mobile phase with the flow rate of 1.0 mL·min1. The results showed that ten batches different eares of A. quinquegona which contained Bergenin by TLC. And the average content of bergenin was 1.67%， but there were significant differences among them， the highest content up to 2.58%， the lowest content 0.95%. The contents of A. quinquegona of different parts were different， the underground part（root and rhizome） contents higher with an average of 4.05%， the ground parts （stems and leaves） were lower with an average of 1.21%. TLC identification method and determination of Bergenin in A. quinquegona were simple， reproductive and accurat. The chemical method could accurately identify the authenticity of A. quinquegona and determination in Bergenin. This study provides experimental basis for the establishment of A. quinquegona medicinal Zhuang medicine quality standards for the control of its quality is of great significance.

Key words： Ardisia quinquegona， Bergenin， TLC， HPLC

大羅傘樹系紫金?？谱辖鹋僦参锖Ｄ狭_傘樹（Ardisia quinquegona），又名鐵涼傘、大鐵涼山、高腳涼傘、筷子根。我國(guó)主要分布于廣西、云南、海南、福建、臺(tái)灣等省區(qū)，廣西主要分布于桂南和桂西南等地區(qū)。本品為壯醫(yī)常用藥材，以全株入藥，壯醫(yī)認(rèn)為本品有調(diào)火路，清熱毒，消腫痛的作用，用于咽喉疼痛、牙痛和跌打損傷（黃瑞松等，2015）。文獻(xiàn)記載，該屬植物中主要含苯醌類、苯酚類和香豆精類化合物（江香梅等，2003），現(xiàn)已從該屬6種植物中獲得了巖白菜素（矮地茶素Bergenin），含量在 0.52%～1.80%之間（劉姩等，1993） 。

巖白菜素具有明顯的止咳、抗炎、抗心律失常、抗病毒、護(hù)肝等作用（夏從龍等，2006；王剛等，2002）。目前有關(guān)大羅傘樹藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法及該植物不同產(chǎn)地、不同部位藥材巖白菜素含量的研究未見有報(bào)道，致使該藥材質(zhì)量控制欠缺，給臨床用藥和大羅傘樹植物資源的開發(fā)利用造成技術(shù)“瓶頸”。為此，本文采集了廣西10批不同產(chǎn)地大羅傘樹樣品，采用TLC對(duì)不同產(chǎn)地大羅傘樹進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)，采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地全株和同一植株的地下部分（根及根莖）、地上部分（莖枝及葉）樣品進(jìn)行巖白菜素含量測(cè)定，并進(jìn)行質(zhì)量分析評(píng)價(jià)，為壯藥大羅傘樹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂、臨床用藥和植物資源開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1儀器與材料

1.1 儀器

LC20AT高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司），LC Solution 色譜工作站；SG2200HDT型超聲波清洗器（功率 190 W，頻率 39 kHz，上海冠特超聲儀器有限公司）；XS205 1/105電子天平（瑞士梅特勒公司）；EASYPURE II 超純水器（美國(guó)熱電公司）。

1.2 材料

共采集10批不同產(chǎn)地的大羅傘樹樣品，詳見表1。藥材采收后除去雜質(zhì)，洗凈，切段，曬干。其中，1號(hào)、2號(hào)和5號(hào)的臘葉標(biāo)本分別經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員、廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定，均為紫金?？浦参锖Ｄ狭_傘樹（Ardisia quinquegona）。巖白菜素對(duì)照品，批號(hào)為111532（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，含量94.4%）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)為20120812；煙臺(tái)市化工研究所，批號(hào)為20120524）；TLC展開系統(tǒng)所用甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸均為分析純；HPLC流動(dòng)相所用甲醇為色譜純（默克股份兩合公司）；水為自制超純水。

2方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 對(duì)照品和供試品溶液制備（1）對(duì)照品溶液制備：取巖白菜素對(duì)照品，加甲醇溶液制成每1 mL含0.5 mg的溶液，搖勻即得。（2）供試品溶液制備：取大羅傘樹樣品粉末0.3 g于具塞錐形瓶中，加入甲醇5 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，取濾液，即得。

2.1.2 TLC試驗(yàn)參照2015年版中國(guó)藥典通則0502薄層色譜法方法進(jìn)行試驗(yàn)，薄層板為硅膠G，點(diǎn)樣量供試品溶液1～2 μL、對(duì)照品溶液1 μL，展開劑為二氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（4∶1∶0.7∶0.5），展距8 cm，顯色劑為2%三氯化鐵乙醇溶液1%鐵氰化鉀溶液（1∶1）混合溶液，在可見光下檢視。結(jié)果顯示，10批大羅傘樹供試品薄層色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上均顯示灰藍(lán)色斑點(diǎn)，且Rf值適中，斑點(diǎn)集中清晰，重現(xiàn)性好（圖1）。

2.1.3 耐用性實(shí)驗(yàn)考察（1）薄層板的考察：分別對(duì)青島海洋化工廠（批號(hào)20120812）和煙臺(tái)市化工研究所（批號(hào)20120524）兩個(gè)廠家生產(chǎn)的預(yù)制板進(jìn)行層析效果考察。（2）展開溫度的考察：分別對(duì)8 ℃和25 ℃兩種不同展開溫度進(jìn)行層析效果考察。（3）展開相對(duì)濕度的考察：分別對(duì)65%和80%兩種不同展開相對(duì)濕度進(jìn)行層析效果考察。（4）不同點(diǎn)樣方式的考察：分別對(duì)點(diǎn)狀點(diǎn)樣和條帶狀點(diǎn)樣進(jìn)行層析效果考察。

以上結(jié)果顯示，在上述各試驗(yàn)條件下大羅傘樹的TLC效果均較好，表明本試驗(yàn)建立的大羅傘樹TLC鑒別方法的耐用性良好。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件色譜柱為SinoChrom ODSBP C18（250 mm × 4.6，5 μm），流動(dòng)相為甲醇水（23∶77），流速1.0 mL·min1，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為對(duì)照品和供試品溶液均為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。

2.2.2 對(duì)照品、供試品和陰性溶液制備（1）對(duì)照品溶液制備：精密稱定巖白菜素對(duì)照品適量，加入甲醇溶液制成濃度約為100 μg·mL1的溶液，即得。（2）供試品溶液制備：取本樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得。

陰性對(duì)照溶液：50%乙醇溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)精密吸取2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液色譜圖中有巖白菜素對(duì)照品吸收峰，陰性對(duì)照溶液則無(wú)此吸收峰。說(shuō)明本方法測(cè)定大羅傘樹中巖白菜素含量專屬性強(qiáng)，無(wú)陰性干擾（圖2）。

2.2.4 儀器最低檢測(cè)限和定量限分別取巖白菜素甲醇溶液（約0.5 μg·μL1）進(jìn)行稀釋，以S/N=3時(shí)注入液相色譜儀的濃度作為檢測(cè)限，以S/N=10時(shí)注入儀器的濃度作為定量限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巖白菜素的檢測(cè)限為1.6 ng，定量限為11.2 ng。

2.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.5.1 巖白菜素線性關(guān)系考察精密稱取巖白菜素對(duì)照品適量，加甲醇制備成0.531 mg·mL1的溶液，備用。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液0.2、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，各以甲醇定容至5 mL，搖勻。

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL進(jìn)樣測(cè)定，縱坐標(biāo)（Y）為峰面積積分值，橫坐標(biāo)（X）為進(jìn)樣量（μg），進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，計(jì)算回歸方程?；貧w方程為Y=1 324 645.67X+4 961.78，r=0.999 9。說(shuō)明巖白菜素在0.212 2～5.305 3 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（圖3）。

2.2.5.2 精密度試驗(yàn)（1）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（8號(hào)樣品），重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次，測(cè)定峰面積值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5次測(cè)定巖白菜素峰面積的平均值為1 916 498，RSD為0.12%。（2）重現(xiàn)性試驗(yàn)：照2.2.2項(xiàng)方法，平行制備6份同一批樣品（8號(hào)樣品）供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6份供試品溶液巖白菜素平均含量為1.98%，RSD為1.19%。

2.2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液（8號(hào)樣品）， 分別于0、2、4、6、8和24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)6次測(cè)得的巖白菜素峰面積的平均值為1 975 312，RSD為0.60%。

2.2.5.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)采用加樣回收試驗(yàn)方法進(jìn)行，分別取已知含量的同一批樣品（8號(hào)）制備供試品溶液6份，制備方法參考2.2.2項(xiàng)中的“供試品溶液制備”，但樣品取樣量為0.1 g，提取溶劑為含巖白菜素的50%乙醇溶液（巖白菜素濃度為72.2 μg·mL1）；測(cè)定方法參照2.2. 1項(xiàng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巖白菜素平均回收率為101.08%，RSD為1.69%（表2）。

2.2.5.5 耐用性試驗(yàn)（1）色譜柱的考察： 在相同的色譜條件下，分別采用賽芬Sapphire C18柱、菲羅門公司 Gemini C18柱和依利特公司SinoChrom ODSBP C18三根不同品牌的色譜柱（規(guī)格均為5 μm，4.6 mm × 250 mm），測(cè)定同一供試品溶液（8號(hào)樣品）巖白菜素含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三根色譜柱測(cè)定的巖白菜素含量平均值為1.99%，RSD=2.29%（n=3）。

（2）色譜儀的考察： 在相同的色譜條件下，分別采用島津LC20AT和Waters 2695兩臺(tái)不同品牌的色譜儀，測(cè)定同一供試品溶液（8號(hào)樣品）巖白菜素含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩臺(tái)色譜儀測(cè)定的巖白菜素含量平均值為1.93%，RSD=0.29%（n=2）。

結(jié)果表明，本研究建立的HPLC測(cè)定大羅傘樹中巖白菜素含量的方法對(duì)上述不同的色譜柱和儀器具有良好的耐用性。

2.2.6 樣品測(cè)定分別取巖白菜素對(duì)照品、10批樣品的全株、地下部分和地上部分，照2.2.2項(xiàng)方法制備對(duì)照品和供試品溶液，照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定巖白菜素含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10批樣品以藥材干燥品計(jì)算，巖白菜素含量全株為0.95%～2.58%，平均含量為1.67%；地下部分為2.23%～6.29%，平均含量為4.05%；地上部分為0.70%～2.44%，平均含量為1.21%（表3）。

3討論與結(jié)論

大羅傘樹為壯族民間常用的壯藥， 來(lái)源于紫金?？谱辖鹋僦参锖Ｄ狭_傘樹。過(guò)去人們對(duì)紫金牛屬藥用植物的研究多集中在朱砂根、紫金牛、紅涼傘、酸苔菜等藥材上（李萍萍等，2009），對(duì)大羅傘樹的研究則甚少，特別是對(duì)其藥材的鑒別和有效成分的測(cè)定未見報(bào)道， 致使該藥材質(zhì)量缺乏評(píng)價(jià)和控制的指標(biāo)，嚴(yán)重影響了該藥材臨床用藥的安全有效和開發(fā)利用。過(guò)去的研究表明，紫金牛屬植物多含有巖白菜素，巖白菜素具有顯著的藥理活性，以其作為紫金牛屬植物的有效成分或特征成分進(jìn)行測(cè)定分析具有重要的意義。

在本研究的TLC鑒別方法中，我們對(duì)比甲醇和乙醇兩種不同溶劑準(zhǔn)備的供試品溶液進(jìn)行了比較，結(jié)果以甲醇作為溶劑較乙醇作為溶劑層析斑點(diǎn)清晰，因此選用甲醇為提取溶劑；曾對(duì)正丁醇冰醋酸水（3∶1∶1）、二氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（4∶1∶0.7∶0.5）和三氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（4∶1∶1∶1.5）等不同展開劑系統(tǒng)進(jìn)行摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者展開效果欠佳，后兩者展開效果較好，斑點(diǎn)集中，Rf值適中。但考慮到三氯甲烷毒性較大，故本試驗(yàn)選用二氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（4∶1∶0.7∶0.5）作為展開劑。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，表明本研究建立的大羅傘樹藥材巖白菜素含量測(cè)定方法，專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性高、耐用性良好，且該方法操作簡(jiǎn)便，可作為壯藥大羅傘樹藥材巖含量測(cè)定方法。

供試品溶液制備中，分別對(duì)不同溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）和不同提取方法（加熱回流和超聲處理）進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以50%乙醇超聲提取巖白菜素得率最高。故供試品溶液制備方法初步確定采用50%乙醇超聲處理。為此，進(jìn)一步采用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)提取方法條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)藥材取樣量、破碎度和超聲提取時(shí)間三因素三水平進(jìn)行考察。根據(jù)結(jié)果最終確定本品供試品溶液制備方法的條件為藥材取樣量約0.2 g，藥材破碎度為過(guò)四號(hào)藥典篩的粉末，超聲提取時(shí)間為30 min。

由表3可知，不同產(chǎn)地大羅傘樹藥材巖白菜素含量有一定差異，其中含量最高的是采集于芩溪縣波塘鎮(zhèn)的4號(hào)樣品，巖白菜素含量達(dá)2.58%，含量最低的是采集于欽州市欽北區(qū)的6號(hào)樣品，含量為0.95%；同一個(gè)地區(qū)不同區(qū)域采集的樣品含量也有所不同，如采集于融水縣的1號(hào)樣品含量為1.85%，3號(hào)樣品則為2.41%。因此，對(duì)大羅傘樹藥材進(jìn)行巖白菜素含量測(cè)定，對(duì)于控制該藥材質(zhì)量顯得尤為必要。建議有關(guān)部門盡早制訂壯藥大羅傘樹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并將該藥材巖白菜素含量測(cè)定項(xiàng)收入標(biāo)準(zhǔn)。

壯族民間使用大羅傘樹常以全株入藥用。本研究結(jié)果表明，該植物不同部位均含有巖白菜素，其中全部樣品含量均是地下部分（根及根莖）顯著高于地上部分（莖枝及葉），平均含量前者是4.05%，后者是1.21%，但從充分利用資源考慮，以全株入藥具有一定的科學(xué)道理。

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