基于ITS序列的中國(guó)外來莧屬植物系統(tǒng)關(guān)系分析

摘要： 通過ITS序列對(duì)21種中國(guó)外來莧屬植物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究。通過ITS序列種間、種內(nèi)遺傳距離分析，發(fā)現(xiàn)莧屬種間變異為0～0.055 1，種內(nèi)變異為0～0.009 2。使用TAXON DNA 軟件分析ITS序列種間、種內(nèi)變異的分布圖看出規(guī)律，結(jié)果表明莧屬ITS序列的種間變異適中， 種間變異明顯大于種內(nèi)變異。采用最大似然法（ML）構(gòu)建的系統(tǒng)樹將中國(guó)莧屬分為5或6個(gè)進(jìn)化支（根據(jù)自展支持率取值不同）。異株莧亞屬長(zhǎng)芒莧和莧亞屬刺莧聚類在一起，西部莧和糙果莧單獨(dú)成為一個(gè)進(jìn)化支。莧亞屬中莧組莧亞組反枝莧和綠穗莧亞組鮑氏莧有著更近的親緣關(guān)系，莧組莧亞組尾穗莧和綠穗莧亞組綠穗莧、繁穗莧等親緣關(guān)系更近。白莧亞屬分為2或3個(gè)類群，根據(jù)自展支持率取值不同，合被莧可以和白莧、北美莧并為一支，也可以單獨(dú)成為一支。綜上所述，該文認(rèn)為莧屬經(jīng)典分類體系中3亞屬或2～3組的分類地位不成立，建議中國(guó)莧屬采取5組2亞組或6組2亞組的分類體系。5組2亞組分別由長(zhǎng)芒莧組、糙果莧組、莧組（莧亞組和綠穗莧亞組）、白莧組和凹頭莧組組成。其中，合被莧也可從白莧組分出，單獨(dú)構(gòu)成1組，形成6組2亞組的分類體系。表明該序列對(duì)莧屬大部分種類分類 效果較好，對(duì)西部莧和糙果莧復(fù)合群，綠穗莧復(fù)合群以及白莧亞屬的分類價(jià)值不高。

關(guān)鍵詞： 莧屬， 異株莧亞屬， 長(zhǎng)芒莧， 西部莧， 糙果莧， ITS序列， 系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號(hào)： Q941文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 10003142（2017）02013906

Abstract： We collected 21 species of Amaranthus and carried out phylogenetic evolutionary studies on ITS sequences of the 21 species of Amaranthus. Through interspecific and intraspecific genetic distance analysis of ITS sequences， the values of interspecific variation were 0-0.055 1 and intraspecific variation were 0-0.009 2. Using TAXON DNA software to build barcoding gap figure of ITS sequences， we could see interspecific variations of Amaranthus species were moderation. And inter and intraspecific variation were overlapping in a few. In addition， five or six clades could be separated on the phylogenetic tree constructed by ML methods （according to the bootstrap value）. Such as， A. plameri （subgen. Acnida） and A. spinosus （subgen. Amaranthus） clustered together. A. tuberculatus and A. rudis formed a sole clade jointly. A. retroflexus （subgen. Amaranthus， sect. Amaranthus， subsect. Amaranthus） and A. powellii （subgen. Amaranthus， sect. Amaranthus， subsect. Hybrida） had more close relationship. A. caudatus （subgen. Amaranthus， sect. Amaranthus， subsect. Amaranthus） and A. hybridus complex （including A. hybridus， A. cruentus and A. hypochondriacus） （subgen. Amaranthus， sect. Amaranthus， subsect. Hybrida） were closer more. Subgen. Albersia was divided into two or three groups， A. polygonoides could be merged into A. albus and A. blitoides， or form a sole clade （Clade 6） by itself according to the bootstrap value. Therefore， categories of three subgenus or two to three sections based on traditional classification systems were problematic， we suggested that classification of Amaranthus in China should be divided into five sections and two subsections， or six sections and two subsections. The five sections and two subsections respectively were sect. Saueranthus including A. palmeri and A. spinosus， sect. Acnida （A. tuberculatus and A. rudis）， sect. Amaranthus including subsect. Amaranthus （A. retroflexus and A. powellii） and subsect. Hybrida （A. hybridus， A. hypochondriacus， A. cruentus and A. caudatus）， sect. Albersia including A. blitum， A. viridis， A. deflexus， A. tricolor， A. graecizans， A. crispus， A. tenuifolius and A. standleyanus， and sect. Blitopsis including A. albus， A. blitoides， A. capensis and A. polygonoides. Most Amaranthus Pecies could be discriminated， only a few allied species （A. rudis and A. tuberculatus complex， and A. hybridus complex） and species under subgen. Albersia could not be separated clearly.

Key words： Amaranthus， subgen. Acnida， A. palmeri， A. tuberculatus， A. rudis， ITS sequences， phylogenetic evolution

世界上莧屬植物共有70多種，其中大部分是世界范圍分布雜草，還有少數(shù)栽培種和瀕危種（Mosyakin Robertson，2003）。莧屬植物主要原產(chǎn)北美，少數(shù)產(chǎn)自歐洲、西亞、非洲和大洋洲。隨著科技發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)基因作物的栽培和除草劑的廣泛使用，使部分雜草產(chǎn)生了抗除草劑特性，如反枝莧（Amaranthus retroflexus）、綠穗莧（A. hybridus），以及檢疫性有害雜草長(zhǎng)芒莧（A. palmeri）、西部莧（A. rudis）和糙果莧（A. tuberculatus），對(duì)農(nóng)業(yè)環(huán)境造成巨大破壞（Tranel et al， 2002； Salas et al， 2016）。長(zhǎng)芒莧、西部莧和糙果莧原產(chǎn)美國(guó)，是北美轉(zhuǎn)基因大豆、玉米農(nóng)田的主要草害，被稱為“超級(jí)雜草”，難以防除，其種子容易隨糧食貿(mào)易跨境傳播。我國(guó)是美國(guó)大豆主要進(jìn)口國(guó)，該類雜草隨糧谷傳入中國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)極大，對(duì)該類雜草的防范工作勢(shì)在必行（徐晗等，2013）。但莧屬雜草種子小，約1 mm，形態(tài)相近，難以識(shí)別。筆者已就莧屬植物種子開展過形態(tài)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)種子變異大，形態(tài)特征不明顯，鑒別技術(shù)難以掌握，尤其對(duì)亞種、變種和雜交種的區(qū)分較難（徐晗等，2014）。因此，結(jié)合其它方法開展莧屬植物分類研究十分必要。

有關(guān)中國(guó)莧屬分類體系，有研究者根據(jù)花被片數(shù)目，將國(guó)內(nèi)莧屬植物分為五被組和三被組（Guan，1979）；根據(jù)雄蕊數(shù)目把中國(guó)莧屬分為3組（五蕊組、三蕊組和二蕊組）（樊守金等，1995）。宋葆華等（1998，2000）根據(jù)RAPD及ITS序列將莧屬又分為刺莧組、五蕊組和2～3蕊組。Mosyakian Robertson（1996）根據(jù)花序和花的特征，將三被組從莧亞屬（subgen. Amaranthus）中分開單列為凹頭莧亞屬（subgen. Albersia），形成具有3個(gè)亞屬（subgen. Acnida， subgen. Amaranthus和subgen. Albersia）的分類體系。Flora of China（2003年）收錄莧屬植物17種（Bao et al， 2003），分別隸屬2個(gè)亞屬或3組。截止目前，新發(fā)現(xiàn)的莧屬植物已有6種，包括長(zhǎng)芒莧等異株莧亞屬種類。對(duì)新增亞屬后的中國(guó)外來莧屬植物進(jìn)行系統(tǒng)梳理，對(duì)系統(tǒng)修訂和物種鑒定具有重要意義。

ITS序列已廣泛地應(yīng)用于解決科內(nèi)不同等級(jí)的系統(tǒng)發(fā)育和分類問題（Baldwin et al，1995），并被Kress et al（2005）選作植物條形碼候選序列。宋葆華等（2000）已對(duì)中國(guó)莧屬16個(gè)類群進(jìn)行過ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，表明ITS序列在莧屬屬內(nèi)具有良好的辨識(shí)能力。但之前研究的種類不全，存在大量異名問題，因此應(yīng)對(duì)中國(guó)莧屬整個(gè)類群重新進(jìn)行分類學(xué)探討。本文在近年新發(fā)現(xiàn)的莧屬外來雜草基礎(chǔ)上，結(jié)合傳統(tǒng)分類體系，對(duì)中國(guó)莧屬植物進(jìn)行基于ITS序列的系統(tǒng)和分類學(xué)研究。

1材料與方法

1.1 材料

自2005年至今，我們收集了莧屬21種27個(gè)居群的33份樣品，以及2種作為外類群的青葙（Celosia argentea）和空心蓮子草（Alternanthera philoxeroides）的植株和種子標(biāo)本。植株標(biāo)本采自國(guó)內(nèi)，種子標(biāo)本來自口岸截獲的糧谷樣品中。此外，還含有來自GenBank里莧屬11個(gè)種的ITS序列。

1.2 樣品DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增

硅膠干燥的植物葉片或種子約10 mg， 用DNA提取研磨儀 （Retsch MM400， Germany） 研磨1 min（1 800 r·min1）后，使用植物DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.， China）提取總DNA。擴(kuò)增ITS序列（ITS1、5.8S和ITS2）通用引物為ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）。PCR反應(yīng)體積25 μL，體系包含MgCl2 2 μL（25 mmol·L1），dNTP 2 μL（2.5 mmol·L1），PCR緩沖液2.5 μL（10×），引物各為1.0 μL（2.5 μmol·L1），聚合酶1.0 U，總DNA 1 μL（約30 ng）。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s（進(jìn)行30個(gè)循環(huán)）；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，擴(kuò)增引物同時(shí)作為測(cè)序引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

測(cè)序后所得峰圖采用Codon Code Aligner V 2.06校對(duì)拼接。ITS序列范圍依據(jù)長(zhǎng)芒莧（GenBank序列號(hào)：KF493784.1、KC747433.1和KP318856.1）界定。排好的序列使用MEGA6.0系統(tǒng)發(fā)育分析軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用最大似然法（Maximum Likelihood）、鄰接法（NeighbourJoining）、與最小進(jìn)化法（MinimumEvolution）構(gòu)建ITS系統(tǒng)樹。在基因信息分析中，空位作缺失處理。所有自展分析重復(fù)1 000次， 以檢驗(yàn)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性。使用TAXON DNA 軟件（Slabbinck et al， 2008）分析序列種內(nèi)、種間變異并作barcoding gap圖。

2結(jié)果與分析

2.1 ITS序列種內(nèi)、種間變異分析

中國(guó)外來莧屬植物ITS序列（包括ITS_1、5.8S rDNA、ITS_2）長(zhǎng)度變異不大（僅相差3 bp），5.8S rDNA區(qū)在莧屬內(nèi)無長(zhǎng)度差異。ITS_1區(qū)的變異位點(diǎn)在屬內(nèi)有41個(gè)，ITS_2區(qū)有25個(gè)，5.8S區(qū)有3個(gè)。簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)在ITS_1區(qū)有32個(gè)，ITS_2有18個(gè)，5.8S區(qū)有3個(gè)。分析ITS序列種間、種內(nèi)變異情況，結(jié)果表明種間變異為0～0.055 1，種內(nèi)變異為0～0.009 2。使用TAXON DNA 軟件分析候選序列， 并做barcoding gap圖（圖1）。從種間、種內(nèi)變異的分布圖看出，莧屬ITS序列的種間變異適中， 種間、種內(nèi)變異也有相互重疊的地方。該序列對(duì)莧屬大部分種類分類效果較好，對(duì)近似種以及白莧亞屬的分類價(jià)值不高。

2.2 ITS序列系統(tǒng)樹的比較和分析

用最大似然法、鄰接法、最小進(jìn)化法分別構(gòu)建ML樹、NJ樹和ME樹， 除ML樹對(duì)野生莧（A. hybridus）和栽培莧（A. hypochondriacus、A. cruentus和A. caudatus）的區(qū)分與NJ樹和ME樹不同外，三種樹對(duì)其余類群構(gòu)建的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（自展支持率不同）（圖1）。NJ樹和ME樹結(jié)構(gòu)基本一致（自展支持率略有不同）。三個(gè)系統(tǒng)樹均表明莧屬為一個(gè)單系起源類群。后續(xù)對(duì)研究結(jié)果的描述和討論依據(jù)ML樹。據(jù)ML系統(tǒng)樹，莧屬屬內(nèi)自展支持率在75%以上的單系類群進(jìn)化支共6個(gè)，其中一個(gè)進(jìn)化支只含一個(gè)物種合被莧（A. polygonoides）。自展支持率在69%以上的進(jìn)化支為5個(gè)，合被莧并入clade 2中（圖2）。

3討論

莧屬屬下等級(jí)的劃分一直存在爭(zhēng)議。根據(jù)花被片和雄蕊數(shù)目，前人將中國(guó)莧屬分為2～3組（Guan，1979；樊守金等，1995），Mosyakin Robertson（1996）則將北美莧屬分為3個(gè)亞屬9個(gè)組。結(jié)合RAPD和ITS序列信息，中國(guó)莧屬分為3組（五蕊組、2～3蕊組和刺莧組）（宋葆華等，1998，2000）。本文在新增物種基礎(chǔ)上進(jìn)行的，基于ITS序列研究的系統(tǒng)發(fā)育研究表明，莧屬分為3個(gè)亞屬，亦或2～3組的分類體系并不成立。

3.1 異株莧亞屬（subgen. Acnida）

被劃為異株莧亞屬的長(zhǎng)芒莧、西部莧和糙果莧原產(chǎn)美國(guó)，近年隨糧谷貿(mào)易傳入我國(guó)。該雌雄異株種類的出現(xiàn)，為中國(guó)莧屬植物的系統(tǒng)分類研究提供了新的素材。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)雌雄異株特征劃為異株莧亞屬的長(zhǎng)芒莧與西部莧和糙果莧分開，與雌雄同株種類刺莧聚為一支，且高達(dá)88%的自展支持率。形態(tài)上，長(zhǎng)芒莧和刺莧均具有花被片5、苞片長(zhǎng)且尖銳直刺、苗期帶白色V型的葉片等特征。此外，刺莧花序上的不規(guī)則排列也與其它雌雄同株莧種不同。刺莧雌花位于葉腋球狀花序，雄花位于頂端穗狀花序，在某種程度上表現(xiàn)出向雌、雄異株類型過渡的跡象（Mosyakin Robertson， 1996）。

西部莧（Amaranthus rudis）和糙果莧（A. tuberculatus）與長(zhǎng)芒莧分開，以97%的支持率并在一起成為單獨(dú)的進(jìn)化支，與其它分支互為姊妹群。根據(jù)雌花花被片數(shù)目及等位酶實(shí)驗(yàn)，Sauer（1967，1972）認(rèn)為西部莧和糙果莧分屬兩個(gè)獨(dú)立的物種。而Robertson（1981）經(jīng)過長(zhǎng)期觀察，認(rèn)為西部莧起源于美國(guó)坦克薩斯到愛荷華密西西比河流域西部的大平原，糙果莧起源于密蘇里和田納西北部至五大湖一帶。兩個(gè)種種間雜交頻繁，產(chǎn)生大量難以歸類的中間型，認(rèn)為應(yīng)屬于一個(gè)類群（Robertson，1981）。Pratt Clark（2001）經(jīng)形態(tài)學(xué)研究，建議將西部莧歸到糙果莧中，兩個(gè)種作為復(fù)合種來處理。Costea Tardif（2003）則將西部莧作為糙果莧的種下變種（A. tuberculatus （Moq.） Sauer var. rudis （Sauer） Costea Tardif）。本文ITS序列分析顯示西部莧和糙果莧種間差異不大。形態(tài)上，西部莧胞果周裂、1～2花被片、雌花花序間生有小葉、葉片黃綠或綠色并長(zhǎng)橢圓型的特征，與糙果莧胞果不裂、無花被片、雌花花序細(xì)長(zhǎng)無小葉、葉片深綠色并狹長(zhǎng)橢圓型的特征相區(qū)別，但二者的雄株卻難以區(qū)分。綜合考慮，Costea Tardif（2003）的建議更為合理，即將西部莧作為糙果莧的變種來處理。

3.2 莧亞屬（subgen. Amaranthus）

莧屬的亞屬等級(jí)劃分中，莧亞屬的分類地位最明確，但該亞屬內(nèi)部分類爭(zhēng)議較多。其中，亞屬內(nèi)隸屬于刺莧組（sect. Centrusa）的刺莧與異株莧亞屬長(zhǎng)芒莧聚在一起。莧亞屬莧組（sect. Amaranthus）莧亞組（subsect. Amaranthus）的反枝莧和綠穗莧亞組（subsect. Hybrida）的鮑氏莧以95%的支持率聚在一起。反枝莧和鮑氏莧分別以66%和63%的自展值分為兩支。而莧組莧亞組的尾穗莧和綠穗莧亞組的綠穗莧、千穗谷和繁穗莧以98%的支持率聚在一起。4個(gè)物種間ITS序列堿基差異小，難以區(qū)分。Sammour et al（1993）通過種子總蛋白的分析將繁穗莧和千穗谷作為綠穗莧的亞種處理。Coon（1977）認(rèn)為廣義的綠穗莧應(yīng)包括繁穗莧、千穗谷和尾穗莧。宋葆華等（2000）建議將繁穗莧、千穗谷和尾穗莧劃為綠穗莧種下變種。結(jié)合綠穗莧等4種莧花被片、苞片以及花序等相似的形態(tài)特征，以及反枝莧與鮑氏莧具有的苞片較硬并長(zhǎng)于花被片，且該特征能與綠穗莧等4種莧相區(qū)分的特點(diǎn)。本文建議將反枝莧與鮑氏莧并作新的亞組，尾穗莧與綠穗莧、繁穗莧和千穗谷并作一個(gè)亞組。

3.3 白莧亞屬（subgen. Albersia）

列為白莧亞屬（三被組或2～3蕊組）的物種以75%和69%的支持率分別組成Clade 1和Clade 2兩支。Clade 1和Clade 2間47%的自展支持率并不支持白莧亞屬的分類地位。Clade 1由凹頭莧等8種莧組成，8種莧之間花序、花被片、苞果等形態(tài)差異較大。如菱葉莧雌花花被片數(shù)目為5，薄葉莧無花被，而其余種類花被片為3。這種種間形態(tài)特征缺乏規(guī)律性，ITS序列差異小的特點(diǎn)，導(dǎo)致Clade 1中各物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系仍不明確。Clade 2由合被莧、白莧（A. albus）和北美莧（A. blitoides）組成，以69%的支持率劃為一支。其中，白莧和北美莧的親緣關(guān)系更近（91%），均具有腋生花序、3～4花被片，胞果周裂的特征，推測(cè)二者可能源于一個(gè)共同的祖先。而合被莧的分類地位還應(yīng)結(jié)合Clade 1以及其它物種進(jìn)一步明確。

綜上所述，根據(jù)ITS序列分析結(jié)果，結(jié)合形態(tài)特征，本文認(rèn)為中國(guó)外來莧屬應(yīng)分為5組2亞組或6組2亞組。按5組2亞組的分類方法，原異株莧亞屬分作2組[組的拉丁文名均沿用Mosyakin 和 Robertson（1996）在莧屬分類體系中使用的組名]，由長(zhǎng)芒莧組（sect. Saueranthus）（A. palmeri和A. spinosus）和糙果莧組（sect. Acnida）（A. tuberculatus和A. rudis）組成。原莧亞屬構(gòu)成1組（sect. Amaranthus），組內(nèi)分為2亞組，分別為莧亞組（subsect. Amaranthus）（A. retroflexus和A. powellii）和綠穗莧亞組（subsect. Hybrida）（A. hybridus，A. hypochondriacus，A. cruentus和A. caudatus）。原白莧亞屬分為2組，由白莧組（sect. Albersia）（A. albus，A. blitoides，A. capensis和A. polygonoides）和凹頭莧組（sect. Blitopsis）（A. blitum，A. viridis，A. deflexus，A. tricolor，A. graecizans，A. crispus，A. tenuifolius和A. standleyanus）組成。其中，合被莧（A. polygonoides）也可從白莧組分出，單獨(dú)構(gòu)成1組（sect. Pyxidium），可形成6組2亞組的分類體系。

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