美洲鰣致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

張偉，張鋮，貢成良，薛仁宇，柳一方

（1.蘇州市陽澄湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 蘇州 215141；

2.蘇州市陽澄湖國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司，江蘇 蘇州 215141；

3.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

美洲鰣致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

張偉1，張鋮2，貢成良3，薛仁宇3，柳一方1

（1.蘇州市陽澄湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 蘇州 215141；

2.蘇州市陽澄湖國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司，江蘇 蘇州 215141；

3.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

從自然感染發(fā)病的美洲鰣肝臟、腎臟和腸道中分離出1株細(xì)菌，經(jīng)革蘭染色鏡檢及PCR鑒定，確定為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）。用該菌株接種健康美洲鰣，鑒定其致病力，從人工感染50 g左右的健康美洲鰣發(fā)現(xiàn)，菌株具有很強(qiáng)的致病力，試驗(yàn)魚在感染后72 h內(nèi)全部死亡，且患病癥狀與自然發(fā)病的魚癥狀一致。進(jìn)一步采用藥敏紙片法測(cè)定分離菌株對(duì)多種抗生素的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：維氏氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻吩三種藥物極為敏感，對(duì)紅霉素、頭孢唑啉中度敏感，對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、鏈霉素不敏感。

美洲鰣；維氏氣單胞菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

維氏氣單胞菌又稱凡隆氣單胞菌、維羅納氣單胞菌，屬弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas）[1-2]，1983年，美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心為紀(jì)念法國(guó)微生物學(xué)家Veron在弧菌和氣單胞菌研究中的貢獻(xiàn)而命名。該菌普遍存在于淡水、污水，土壤乃至海水中，其中一部分菌株是微生態(tài)環(huán)境中正常存在的，而另一些菌株具有致病性[3]。維氏氣單胞菌可產(chǎn)生一系列的有毒因子，如氣溶素、腸毒素和黏附因子等，這些有毒因子在水產(chǎn)動(dòng)物、人類甚至畜禽感染中起著舉足輕重的作用。近年來，日益增多的病例表明維氏氣單胞菌已成為一種重要的人-魚共患致病菌[4]。

美洲鰣（Alosa sapidissima，鯡形目、鯡科、鰣亞科）是近年來新興起的一種養(yǎng)殖品種，因其抗病力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)而備受廣大養(yǎng)殖戶歡迎。然而，近年來由于養(yǎng)殖密度大、水質(zhì)下降、種質(zhì)退化等原因，其病害發(fā)生率明顯增加，其中細(xì)菌病的暴發(fā)是造成美洲鰣經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一[5-7]。氣單胞菌作為主要的病原菌之一，其發(fā)病率及耐藥性也逐年增加。本研究從基地養(yǎng)殖池中發(fā)病的美洲鰣?bào)w內(nèi)分離細(xì)菌，并進(jìn)行PCR鑒定、致病力試驗(yàn)和藥敏研究，以期為臨床指導(dǎo)用藥提供參考，為該病的防控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病魚（20 g左右）采自蘇州市相城區(qū)陽澄湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園工廠化基地養(yǎng)殖池，死亡魚體表可見鰓絲充血，腸道內(nèi)食糜少或無，腸壁薄，腎臟充血明顯，部分有大面積的皮膚潰爛。營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基以及細(xì)菌微量生化鑒定管購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）、抗生素藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化選擇患病個(gè)體，先用75%酒精對(duì)個(gè)體表面進(jìn)行嚴(yán)格消毒，然后在無菌室中解剖，從肝臟、腸道、腎臟等器官中取樣，用75%酒精浸洗、無菌水沖洗，無菌環(huán)境下攪碎并放入無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行增菌，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后蘸取增菌液接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落二次純化培養(yǎng)，挑取單菌落劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，無菌液體石蠟密封后4℃短期儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?80℃長(zhǎng)期保種。

1.2.2 細(xì)菌的鑒定挑取單個(gè)新鮮培養(yǎng)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8 h，離心收集菌體，取新鮮菌液50 μL，煮沸5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液用作模板，用16S rRNA基因的通用引物27F（5'-agagtttgatcctggctcag-3'）/1492R（5'-tacggttaccttgttacgactt-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）回收特異性擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物連接到pMD18-T載體（TaKaRa公司）后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，用質(zhì)粒抽提試劑盒（AXYGEN公司）抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 致病力試驗(yàn)將分離純化的病原菌接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)16～18 h后制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL，人工感染50 g左右美洲鰣以確定病原菌的致病力。將暫養(yǎng)并確定健康的美洲鰣隨機(jī)抽選20尾，隨機(jī)分成2組（A、B），每組10尾。無菌注射器腹腔注射健康試驗(yàn)魚，A組注射菌液，B組作為對(duì)照組注射等量的無菌生理鹽水，每尾注射劑量為25 μL。A、B兩組魚分別置于單獨(dú)的水缸中，28℃水溫下連續(xù)養(yǎng)殖觀察1周，記錄魚死亡情況，并從試驗(yàn)組病魚的病灶組織中再次分離純化病原菌。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法），參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，將菌株用0.85%生理鹽水稀釋至1.5×108CFU/mL，取200 μL菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平板（90 mm）上，用無菌鑷子將藥敏紙片按要求貼在培養(yǎng)基表面，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈直徑，并根據(jù)NCCLS的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏特性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及染色鏡檢

增菌培養(yǎng)之后增菌液變渾濁，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上28℃恒溫條件下培養(yǎng)24～48 h，形成圓形、灰白色較不透明、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、直徑為2 mm左右的菌落，菌株有β溶血環(huán)，革蘭染色后鏡檢為革蘭陰性短桿菌。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

將測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列用在線Blast程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源搜尋，根據(jù)所測(cè)序列與GenBank中已公開的細(xì)菌16S rRNA基因序列的相似性確定所分離細(xì)菌的分類地位。結(jié)果顯示，所分離的細(xì)菌為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）。

2.3 致病力試驗(yàn)結(jié)果

攻毒20 h后，A組魚開始陸續(xù)死亡，游動(dòng)緩慢，死魚鰓充血、解剖發(fā)現(xiàn)腎臟不同程度充血、腸壁薄、死亡癥狀與自然發(fā)病魚一致；攻毒48 h后10尾魚全部死亡。將A組死魚隨機(jī)取兩條進(jìn)行剖檢，分離細(xì)菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為維氏氣單胞菌。B組（CK）攻毒7 d后魚無死亡。說明分離到的這株維氏氣單胞菌具有很強(qiáng)的致病性。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表1 菌株對(duì)10種常見藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用10種常見的藥物對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。由表1可知，該菌株對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻吩三種藥物極為敏感，對(duì)紅霉素、頭孢唑啉中度敏感，對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、鏈霉素不敏感。

3 討論

維氏氣單胞菌廣泛存在于淡水及含有機(jī)物的水中、淤泥及淡水魚體表，健康魚帶菌率高，但有病原不一定會(huì)有流行病的發(fā)生，要由環(huán)境和宿主抵抗力兩方面決定[8]，黎炯等[9]認(rèn)為維氏氣單胞菌是一種人畜共患的條件致病菌。近年來關(guān)于因感染維氏氣單胞菌而致病的報(bào)道越來越多，如中華鱉[10]、黃顙魚[11]、團(tuán)頭魴[12]、異育銀鯽[13]、斑點(diǎn)叉尾鮰等品種[14]。典型案例如浙江省德清縣曾由于維氏氣單胞菌的感染引起養(yǎng)殖青蝦的暴發(fā)病，發(fā)病率14.6%～60%，病死率71.1%～90%[15]。

試驗(yàn)以美洲鰣為研究對(duì)象，發(fā)病個(gè)體臨床癥狀表現(xiàn)為鰓絲充血，腸道內(nèi)食糜少或無，腸壁薄，腎臟充血明顯，部分有大面積的皮膚潰爛，從其肝臟、腸道、腎臟等器官中分離出一株細(xì)菌，經(jīng)分離、純化、鑒定為維氏氣單胞菌。進(jìn)一步鑒定其致病力，發(fā)現(xiàn)該菌株具有很強(qiáng)的致病力，試驗(yàn)魚在感染后72 h內(nèi)全部死亡，且患病癥狀與自然發(fā)病的魚癥狀一致，這表明該菌株是導(dǎo)致此次美洲鰣發(fā)病的致病菌。

進(jìn)一步的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻吩三種藥物對(duì)維氏氣單胞菌有較好的敏感性，而青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、阿莫西林和氨芐西林對(duì)維氏氣單胞菌有較好的耐藥性。這可能跟當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥情況有關(guān)，在用藥上大量使用青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、阿莫西林和氨芐西林等抗生素，導(dǎo)致該致病菌對(duì)以上幾種抗生素產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。而恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻吩三種藥物作為近幾年新興的抗菌藥物，對(duì)維氏氣單胞菌仍具有較好的敏感性，這與黎炯等[9]從羅非魚上和王浩等[16]從草魚上分離出的維氏氣單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本一致，這表明目前恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻吩三種藥物對(duì)美洲鰣維氏氣單胞菌病有較好的治療效果。

然而，美洲鰣目前的養(yǎng)殖技術(shù)還不是很成熟，其病害的相關(guān)研究也很少，而養(yǎng)殖戶為追求高的經(jīng)濟(jì)效益，往往養(yǎng)殖密度偏大，管理不到位，導(dǎo)致水質(zhì)變差，魚體體質(zhì)差，使魚體易遭受病原菌的侵襲，造成批量死亡。因此，加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖用水的消毒凈化處理、控制養(yǎng)殖環(huán)境是防治該病發(fā)生的關(guān)鍵。同時(shí)在實(shí)際治療過程中，應(yīng)充分了解病原菌對(duì)藥物的敏感性，合理科學(xué)用藥，避免耐藥菌株形成，提高治療效果。

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Isolation，identification and drug sensitivity test of pathogenic Aeromonas veronii from Alosa sapidissima

Zhang Wei1，Zhang Cheng2，Gong Chengliang3，Xue Renyu3，Liu Yifang1
（1.Suzhou Yangcheng Lake Modern Agricultural Development Co.，Ltd.，Yangcheng Lake 215141，China；2.The State of Modern Agricultural Demonstration Zone Development Co.，Ltd.in Suzhou Yangcheng Lake，Suzhou 215141，China; 3.School of Biology and Basic Medical Science of Soochow University，Suzhou 215123，China）

A bacterial strain was isolated from liver，kidney and intestinal tract of natural infected Alosa sapidissima，and it was identified to be Aeromonas veronii by gram staining and PCR identification.This bacterial strain was used to artificially infect healthy Alosa sapidissima weighed about 50 grams，all infected fish died in 72 hours and the symptoms of the infected fish were consistent with the natural diseased fish.The results of drug sensitivity test shows that this strain of Aeromonas veronii was extremely sensitive to enrofloxacin，ofloxacin and cephalothin，and it was sensitive to erythromycin and cefamedinⅤ，it was insensitive to peillin G，ampicillin，amoxicillin，tetracycline and streptomycin.

Alosa sapidissima；Aeromonas veronii；isolation and identification；drug sensitivity

S943

A

1004-2091（2017）04-0012-04

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.003

2016-07-26）

陽澄湖農(nóng)業(yè)人才計(jì)劃項(xiàng)目（XNY20150203）

張偉（1982-），男，工程師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖.E-mail:skyzhang820706@163.com