香鱗毛蕨提取物對咪喹莫特誘導銀屑病樣小鼠皮損的影響

朱沖沖，彭冰，王燕，曾祖平，韓旭陽，王宏，王天園，何薇

首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，銀屑病中醫(yī)臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010

香鱗毛蕨提取物對咪喹莫特誘導銀屑病樣小鼠皮損的影響

朱沖沖，彭冰，王燕，曾祖平，韓旭陽，王宏，王天園，何薇

首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，銀屑病中醫(yī)臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010

目的 觀察香鱗毛蕨提取物對咪喹莫特誘導銀屑病樣小鼠皮損的干預作用。方法 采用背部每日涂抹5%咪喹莫特乳膏制作銀屑病樣小鼠模型。72只6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為空白組、模型組、香鱗毛蕨提取物組和陽性藥組，每組8只。模型組和空白組給予蒸餾水灌胃，各給藥組給予相應藥物灌胃，每日0.3 mL，連續(xù)6 d。采用銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）評分標準觀察銀屑病樣小鼠皮損變化。光鏡下觀察皮損組織形態(tài)學變化，測量表皮層厚度；檢測小鼠脾指數(shù)。結果 與空白組比較，模型組小鼠皮膚出現(xiàn)鱗屑、紅斑，皮損增厚；皮損組織表現(xiàn)為表皮棘細胞層增厚，角化不全；脾臟肥大；與模型組比較，香鱗毛蕨提取物組小鼠銀屑病樣皮損癥狀緩解，PASI積分降低，角化不全減輕，脾指數(shù)明顯降低。結論 香鱗毛蕨提取物可顯著改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損。

香鱗毛蕨提取物；銀屑??；皮膚損傷；小鼠

銀屑病俗稱“牛皮癬”，中醫(yī)學稱之為“白疕”，是常見的免疫介導的慢性炎癥性皮膚疾病。由于其病程長，皮損廣泛，常給患者身心健康帶來嚴重影響。香鱗毛蕨Dryopteris fragrans（L.）Schott是鱗毛蕨科Dryopteridaceae鱗毛蕨屬Dryopteris Adans.植物，多生長于高寒地區(qū)的滑石坡、森林中的碎石坡和火山周圍的巖漿縫隙中，主要分布于我國東北、華北及俄羅斯、日本、朝鮮等。國內(nèi)有學者采用鼠尾鱗片表皮模型研究香鱗毛蕨提取物對銀屑病的作用效果，發(fā)現(xiàn)其提取物可通過促進表皮顆粒層形成而對銀屑病有一定的治療效果[1-2]，也有研究發(fā)現(xiàn)香鱗毛蕨乙醇提取物對糠秕馬拉色菌引起的銀屑病有較好的治療作用[3]。本實驗采用咪喹莫特誘導制作銀屑病樣小鼠模型，觀察香鱗毛蕨對其皮損的干預作用。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SPF級BALB/c小鼠72只，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，中國食品藥品檢定研究院，動物許可證號SCXK（京）20140013。飼養(yǎng)于SPF級動物室，室溫22～26℃，濕度30%～50%，自由攝食飲水。

1.2 藥物

香鱗毛蕨采自黑龍江省五大連池地區(qū)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥學院高增平教授鑒定為Dryopteris fragrans（L.）Schott，憑證標本（DF0110801）保存于北京市中醫(yī)研究所；咪喹莫特乳膏，四川明欣藥業(yè)有限責任公司，批號20140828；甲氨蝶呤片（MTX），上海信宜藥廠有限責任公司，批號20150722。

1.3 主要試劑與儀器

0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），化學純，國藥集團化學試劑有限公司。正置熒光顯微鏡（ZEISS，德國）；組織脫水機，輪轉式切片機，石蠟包埋機（LEICA，德國）。

2 實驗方法

2.1 香鱗毛蕨提取物制備

醇提物：香鱗毛蕨粗粉50 g，加95%乙醇600 mL浸0.6 h，超聲處理0.6 h，抽濾，減壓濃縮至無醇味，加0.5%CMC-Na制成混懸液50 mL，稀釋得含原藥材0.8 g/mL（高）、0.4 g/mL（中）、0.2 g/mL（低）劑量組；水提物：香鱗毛蕨粗粉50 g，加入蒸餾水600 mL浸0.6 h，超聲0.6 h，抽濾，減壓濃縮，加0.5%CMC-Na制成混懸液50 mL，稀釋得含原藥材0.8 g/mL（高）、0.4 g/mL（中）、0.2 g/mL（低）劑量組。

2.2 造模及分組

[4]方法，背部每日涂抹5%咪喹莫特乳膏約42 mg，制作銀屑病樣小鼠模型。實驗前將80只BALB/c雄性小鼠0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部2 cm×3 cm去毛后單籠飼養(yǎng)。次日選取背部較光滑、無傷口小鼠72只，隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、香鱗毛蕨醇提物和水提物高、中、低劑量組，每組8只。模型組和空白組小鼠每日給予蒸餾水灌胃，陽性藥組小鼠每日給予1 mg/kg MTX溶液灌胃，各給藥組小鼠每日給予相應藥物灌胃。給藥體積均為0.3 mL，連續(xù)6 d。第7日小鼠脫頸處死，剪取背部皮膚并取脾稱重。

2.3 檢測指標

2.3.1 皮損積分 采用數(shù)碼照相方法每日記錄，并依據(jù)銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index，PASI）評分標準，對小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度計分，三者積分相加為總積分。PASI評分標準：0分，無；1分，輕度；2分，中度；3分，重度；4分，極重度。對各組小鼠積分取平均值。

2.3.2 皮損病理改變 小鼠脫頸處死后，各組剪取相對應皮損處組織。10%福爾馬林固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察并照相。測量表皮厚度。

2.3.3 脾指數(shù) 小鼠稱重，處死后取脾臟稱重，計算

脾指數(shù)（脾質(zhì)量÷體質(zhì)量）。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 香鱗毛蕨提取物對模型小鼠皮損部位鱗屑、浸潤增厚、紅斑及皮損積分的影響

與空白組比較，咪喹莫特涂抹1 d后模型組皮膚即出現(xiàn)鱗屑，第7日最嚴重；2～3 d出現(xiàn)紅斑；皮膚持續(xù)增厚，出現(xiàn)類似銀屑病樣皮損。隨著藥物作用的積蓄，模型組皮損越加嚴重，紅斑由淡粉色斑點變?yōu)榇竺娣e深紅色斑塊，鱗屑由散在零星小點變?yōu)槠瑺睿黄つw浸潤、增厚明顯。陽性藥組、香鱗毛蕨醇提物和水提物中、高劑量組皮損較模型組癥狀明顯減輕，皮膚較光滑，鱗屑較少，紅斑變淺，浸潤增厚減輕；香鱗毛蕨提取物低劑量組皮膚較粗糙，鱗屑較多呈片狀，浸潤增厚較重，與模型組比較有所減輕但癥狀不明顯。結果見圖1、圖2。

4.2 香鱗毛蕨提取物對模型小鼠皮損病理的影響

HE染色結果顯示，治療7 d后，空白組皮膚表皮層較薄，模型組角化不全明顯，表皮棘細胞層增厚，類似銀屑病樣的皮損形成。香鱗毛蕨醇提物、水提物組皮損中表皮層較平整，角化不全細胞明顯減少，表皮層厚度明顯低于模型組，作用結果與陽性藥組相似，見圖3。通過測量表皮層垂直厚度發(fā)現(xiàn)，模型組表皮層明顯增厚，約為空白組小鼠表皮厚度4～5倍，香鱗毛蕨醇提物、水提物組表皮層增厚較低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中醇提物高劑量組抑制表皮增厚效果最為明顯，見圖4。

圖1 各組小鼠皮損積分情況

圖2 各組小鼠治療7 d皮損大體表現(xiàn)

圖3 各組小鼠治療7 d皮損組織病理形態(tài)（HE染色，×40）

圖4 各組小鼠治療7 d表皮層厚度比較（±s，每組8只）

4.3 香鱗毛蕨提取物對模型小鼠脾臟的影響

模型組小鼠脾指數(shù)明顯高于空白組；與模型組比較，香鱗毛蕨水提物和醇提物中、高劑量組小鼠脾指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），其中香鱗毛蕨醇提物高劑量組明顯低于其他各給藥組（P＜0.05，P＜0.01）。結果見圖5。

圖5 各組小鼠治療7 d脾指數(shù)比較（±s，每組8只）

5 討論

銀屑病是一種常見的多基因遺傳、多環(huán)境因素誘導的慢性炎癥增殖性皮膚病[5]，現(xiàn)代醫(yī)學定義其為免疫介導的器官特異性自身免疫性疾病，基本病理特點是表皮細胞增殖過快和角化不全[6]，臨床表現(xiàn)為紅色丘疹或境界清楚的斑塊，表面覆蓋有銀白色鱗屑，可局部發(fā)作，也可以泛發(fā)全身。

香鱗毛蕨是鱗毛蕨屬藥用植物綿馬貫眾同屬植物，具有抗腫瘤[7]、抗菌[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]作用，并對各種皮膚病如銀屑病、皮疹、痤瘡等有較好的療效[11]，東北地區(qū)民間廣泛用于治療皮膚疾病，被譽為“皮膚病克星”。

咪喹莫特是咪唑喹啉胺類免疫應答調(diào)節(jié)劑，該藥可以誘發(fā)人類和鼠類銀屑病。咪喹莫特是Toll樣受體（TLR）激動劑，TLR的激活主要通過3個途徑發(fā)揮作用：①白細胞介素（IL）-23/IL-17炎性反應軸；②IL-27激活Th1細胞應答途徑；③氧化應激途徑。TLR的激活有助于宿主免疫反應的發(fā)生，進而因其一系列的炎癥反應和免疫損傷，也可促進抗微生物肽的釋放，活化對氧化還原敏感的細胞信號轉導途徑，促進炎性細胞因子和趨化因子的表達。

本實驗結果顯示，香鱗毛蕨醇提物和水提物中、高劑量組小鼠皮膚癥狀明顯緩解，皮損癥狀明顯減輕，皮膚較光滑，鱗屑較少，紅斑色淺，浸潤、增厚較輕，PASI積分顯著降低，組織形態(tài)趨于正常，表皮角質(zhì)形成細胞增殖減緩，角化不全細胞減少；香鱗毛蕨醇提物和水提物低劑量組改善不明顯。與其他給藥組比較，香鱗毛蕨醇提物高劑量組作用最明顯。

脾臟是機體重要的免疫器官，脾指數(shù)的意義在于提示免疫能力的強弱狀態(tài)。實驗結果顯示，香鱗毛蕨提取物各劑量組小鼠脾指數(shù)較模型組降低，表明香鱗毛蕨提取物通過降低機體免疫而達到抑制銀屑病的作用，香鱗毛蕨提取物高劑量組脾指數(shù)明顯降低。

綜上所述，香鱗毛蕨乙醇提取物和水提取物在一定程度上可抑制機體免疫，減輕咪喹莫特致小鼠銀屑病樣皮損癥狀。在后續(xù)的研究中，我們將對香鱗毛蕨治療銀屑病的作用機制及其有效成分進一步深入探討。

參考文獻：

[1]沈志濱,金哲雄,張德連,等.香鱗毛蕨治療銀屑病的藥理作用研究[J].中草藥,2002,33(5)：448-449.

[2]羅榮,金哲雄,張延萍.香鱗毛蕨擦劑的藥效學研究[J].哈爾濱商業(yè)大學學報：自然科學版,2003,19(4)：388-390.

[3]王潔,唐春萍,江濤,等.香鱗毛蕨有效部位對糠秕馬拉色菌的體外抗真菌作用研究[J].中成藥,2015,37(3)：642-645.

[4]FITS L V,MOURITS S,VOERMAN J S,et al.Imiquimod induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis[J].J Immunol,2009,182(9)：5836-5845.

[5]鄭敏.銀屑病發(fā)病機制研究中若干問題的思考[J].中華皮膚科雜志, 2006,39(3)：121-123.

[6]底婷婷,趙京霞,王燕,等.涼血活血膠囊對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮損的干預作用[J].中國病理生理雜志,2012,28(4)：718-722.

[7]SONG R,LI G,LI S.Aspidin PB,a novel natural anti-fibrotic compound,inhibited fibrogenesis in TGF-β1-stimulated keloid fibroblasts via PI-3K/Akt and Smad signaling pathways[J].Chem Biol Interact,2015,238：66-73.

[8]GAO C,GUO N,LI N,et al.Investigation of antibacterial activity of aspidin BB against Propionibacterium acnes[J].Arch Dermatol Res,2016,308(2)：79-86.

[9]LI X J,WANG W,LUO M,et al.Solvent-free microwave extraction of essential oil from Dryopteris fragrans and evaluation of antioxidant activity[J].Food Chem,2012,133(2)：437-444.

[10]PENG B,BAI R F,HAN X Y,et al.Two new glycosides from Dryopteris fragrans with anti-inflammatory activities[J].J Asian Nat Prod Res,2016,18(1)：59-64.

[11]范華倩,沈志濱,唐春萍.香鱗毛蕨化學成分及其治療皮膚病藥理作用的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(1)：199-201.

Effects of Dryopteris Fragrans Extracts on Psoriasis-like Skin Lesions Induced by Imiquimod in Mice

ZHU Chong-chong,PENG Bing,WANG Yan,ZENG Zu-ping,HAN Xu-yang, WANG Hong,WANG Tian-yuan,HE Wei
(Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University,Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine,Beijing Key Laboratory of Clinic and Basic Research with Traditional Chinese Medicine on Psoriasis,Beijing 100010,China)

Objective To observe the intervention effects of Dryopteris fragrans extracts on psoriasis-like skin lesions induced by imiquimod in mice.Methods A psoriasis-like mouse model was made by applying 5%imiquimod cream daily on the back.Totally 72 6–8 week old male BALB/c mice were randomly divided into control group, model group,Dryopteris fragrans extracts groups and positive medicine group,8 mice in each group.The model group and the control group were given distilled water for gavage.The mice in each administration group were given relevant medicine for gavage,0.3 mL daily,for 6 days.The skin lesions were evaluated according to the psoriasis area and severity index(PASI).The histology and epidermal thickness were observed under light microscope.The spleen index was detected to reflect the changes of spleen in mice.Results Compared with control group,the erythema scales and skin lesions were thickened in the model group;lesions of the performance of the epidermis acanthosis was thickening,parakeratosis;spleen hypertrophy.Compared with model group,the cutaneous symptoms in Dryopteris fragrans extracts groups were alleviated;PASI scores decreased;epidermal parakeratosis was relieved;the spleen index was lower than that of model group.Conclusion Dryopteris fragrans extracts can significantly improve the psoriasis-like skin lesions induced by imiquimod in mice.

Dryopteris fragrans extract;psoriasis;skin lesions;mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.011

R285.5

：A

：1005-5304(2017)05-0044-04

2016-10-24）

（

2016-12-01；編輯：華強）

北京市自然科學基金（7144200）

何薇，E-mail：hewei1124@sina.com