鎘脅迫下超氧陰離子對水稻幼苗根系生長和生長素分布動態(tài)變化的影響

鄭欣+劉夏囡+鄭勝男+車軒+周士釗+遲世飛+邢偉+付童童+孫川惠+趙鳳云

摘要：以DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻 （以水稻中花11為背景）為試驗材料，分析鎘脅迫下超氧陰離子（O-2· ）介導(dǎo)的根系生長動態(tài)變化與生長素重新分布之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鎘脅迫與非脅迫條件下DDC（SOD抑制劑）處理明顯促進(jìn)了根系的生長。GUS活性檢測顯示DDC和Cd+DDC處理條件下根系生長的動態(tài)變化與生長素濃度和分布的動態(tài)變化密切相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，DDC+BFA（蛋白運輸抑制劑）/MG132 /（蛋白降解抑制劑）或Cd+DDC+BFA/MG132處理比DDC或Cd+DDC處理增強了GUS活性。這些結(jié)果證實O-2· 介導(dǎo)的生長素重新分布與蛋白轉(zhuǎn)運/降解有密切關(guān)系，O-2· 與生長素信號之間存在交互作用。以上結(jié)果表明，適量的O-2· 通過蛋白轉(zhuǎn)運/降解介導(dǎo)的生長素重新分布是鎘脅迫及非脅迫條件下水稻幼苗根系生長特別是不定根和側(cè)根生長所必需的。

關(guān)鍵詞：生長素分布；鎘脅迫；水稻根系；超氧陰離子

中圖分類號： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0055-04

水稻根系是吸收水分和營養(yǎng)的主要器官，根系的結(jié)構(gòu)受內(nèi)部遺傳因子和外界環(huán)境條件的共同調(diào)節(jié)[1]。生長素是調(diào)節(jié)植物根系生長發(fā)育的關(guān)鍵激素之一，如添加外源生長素促進(jìn)側(cè)根的形成，而使用生長素運輸抑制劑則抑制根的生長[2-3]。研究表明，生長素信號是水稻不定根形成所必需的[4]。高濃度氮對玉米根生長的抑制作用與其降低根系內(nèi)生長素（IAA）水平有關(guān)[5]。各種環(huán)境因子和內(nèi)部信號調(diào)節(jié)生長素的運輸和極性分布，進(jìn)而影響植物根系的生長發(fā)育[6-7]。如低溫影響擬南芥生長素運輸，從而抑制根系生長[8]；鎘 （Cd）脅迫條件下擬南芥根內(nèi)生長素的分布與其側(cè)根的形成密切關(guān)聯(lián)[9]；在鋁和銅脅迫植物中根系結(jié)構(gòu)的變化也與生長素重新分布有關(guān)[3，10]。近來研究發(fā)現(xiàn)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是調(diào)節(jié)植物根系生長發(fā)育的重要信號分子之一[11-12]。如在非脅迫條件下ROS是調(diào)節(jié)玉米和水稻根系生長所必需的[13-14]，前期研究也表明 0.1 mmol/L Cd 處理下O-2· 和H2O2參與了水稻根系生長發(fā)育的調(diào)控[15-16]，但是Cd脅迫下根系生長和生長素分布的動態(tài)變化與O-2· 之間的關(guān)系還不清楚。Cd是主要的環(huán)境污染物，低濃度促進(jìn)根系生長，高濃度則抑制生長。本試驗進(jìn)一步研究 0.1 mmol/L Cd 處理條件下根系生長和生長素分布的動態(tài)變化與O-2· 之間的關(guān)系，旨在為更好地了解Cd脅迫影響植物生長發(fā)育的機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與處理

DR5-GUS 轉(zhuǎn)基因水稻種子（中花 11 為背景，DR5-GUS 報告基因廣泛用于生長素研究）預(yù)萌發(fā)3 d后分別轉(zhuǎn)入含0.1 mmol/L Cd（NO3）2、3 mmol/L DDC （SOD 抑制劑） 和0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC的固體MS 培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱內(nèi)[光照度200 μmol/（m2·s） 、14 h光照、晝/夜溫度27 ℃/21 ℃和相對濕度60%/80%]培養(yǎng)5～9 d，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。每種處理至少重復(fù)3次。

1.2根系生長統(tǒng)計

初生根和不定根長度用尺子測量，側(cè)根數(shù)量和長度在解剖鏡下統(tǒng)計，每個處理至少用60株幼苗，數(shù)據(jù)用每株的平均值表示。

1.3O-2· 的測定

上述幼苗處理 9 d后用NBT法[17] 檢測根尖上O-2· 的積累與分布，每種處理至少用 60個根尖，解剖鏡拍照。

1.4根系GUS活性組織化學(xué)分析

DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻種子預(yù)萌發(fā)3 d后分別轉(zhuǎn)入含01 mmol/LCd（NO3）2、3 mmol/L DDC和0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC的固體MS培養(yǎng)基上，在上述條件下培養(yǎng)3～7 d，然后進(jìn)行GUS活性檢測[18]。為進(jìn)一步分析 O-2· 與蛋白轉(zhuǎn)運和降解的關(guān)系，DR5-GUS 轉(zhuǎn)基因水稻種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長7 d后轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液，分別用50 μmol/L BFA （蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑）或50 μmol/L MG132 （蛋白降解抑制劑） 處理 3 h，再轉(zhuǎn)入新的Hoagland 營養(yǎng)液分別加入3 mmol/L DDC 或0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC 處理24 h（培養(yǎng)條件同上），取根系進(jìn)行GUS染色，解剖鏡拍照。每種處理至少用15株。1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0軟件對不同處理數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<005為差異顯著，試驗結(jié)果用3次獨立重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理對根尖O-2· 積累的影響

與對照相比，Cd、DDC和Cd +DDC處理增加了O-2· 在初生根根尖的積累，而且Cd+DDC處理的根尖O-2· 產(chǎn)生量比單一Cd或DDC處理的多。在每種處理中O-2· 主要集中在分生區(qū)和伸長區(qū)，不定根中O-2· 的積累與分布變化與初生根的類似（圖1）。

2.2Cd脅迫下O-2· 對初生根生長的影響

Cd、DDC和Cd+DDC處理5～9 d后初生根生長的動態(tài)變化存在差異（圖2）。在5～9 d處理期間Cd+DDC比其他處理顯著促進(jìn)了初生根的生長，與對照比，Cd處理7 d促進(jìn)生長，而DDC處理9 d時才有明顯的促進(jìn)作用。

2.3Cd脅迫下O-2· 對不定根生長的影響

在5～9 d處理期間，DDC和Cd+DDC明顯加快了不定根的形成和伸長生長（P<0.05），而Cd 處理7 d時不定根的數(shù)量和長度才明顯增加（圖3）。

2.4Cd脅迫下O-2· 對側(cè)根生長的影響

Cd+DDC處理5～9 d后側(cè)根總數(shù)明顯比其他處理的多（P<0.01），而在DDC 處理中這種促進(jìn)作用發(fā)生在處理后9 d（P<0.05，圖4-a）。與對照比，Cd+DDC處理5～9 d后側(cè)根總長度明顯增加（P<0.01，圖4-b），而DDC處理7 d時這種促進(jìn)作用特別顯著（P<0.01）。這些結(jié)果表明O-2· 參與了水稻根系生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，而且這種促進(jìn)作用與其水平有關(guān)。在Cd、DDC和Cd+DDC處理條件下初生根、不定根、側(cè)根生長的動態(tài)變化有明顯差異。

2.5Cd脅迫下O-2· 介導(dǎo)的水稻根系生長動態(tài)變化與生長素重新分布有關(guān)

為進(jìn)一步了解Cd脅迫下O-2· 介導(dǎo)的根系生長動態(tài)變化與生長素時空分布之間的關(guān)系，以DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻幼苗為材料，測定不同處理3～7 d期間根系GUS活性的變化（圖5）。不同處理3 d時，根內(nèi)GUS的表達(dá)方式類似，GUS染色主要在初生根的前端（圖5-A）。DDC和Cd+DDC處理 5 d 時，GUS的表達(dá)方式發(fā)生了變化，GUS染色主要集中在不定根和側(cè)根，生長素分布的變化與這些根的快速增加和伸長生長密切關(guān)聯(lián)（圖5-B）。但是對照和Cd處理的根GUS的表達(dá)方式變化不明顯，不定根和側(cè)根的產(chǎn)生也比較少。Cd處理7 d時，GUS染色在不定根和側(cè)根豐富，此時DDC和Cd+DDC處理整個根系GUS活性則比Cd處理的低（圖5-C）。試驗結(jié)果表明，生長素分布的動態(tài)變化與根系生長的動態(tài)變化有密切關(guān)系，DDC和Cd+DDC處理加快了生長素的重新分布和不定根與側(cè)根的生長；無論在Cd脅迫還是非脅迫條件下O-2· 對根系生長的調(diào)節(jié)與其調(diào)控生長素的重新分布有關(guān)。

2.6Cd脅迫下O-2· 介導(dǎo)的生長素分布與蛋白轉(zhuǎn)運和降解有關(guān)

生長素分布是生長素合成和運輸共同作用的結(jié)果。OsPIN 是生長素極性運輸?shù)鞍?，BFA抑制OsPIN蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞膜的運輸，進(jìn)而影響生長素的轉(zhuǎn)運。生長素合成與蛋白代謝有關(guān)，MG132抑制蛋白降解，從而介導(dǎo)生長素的分布。DDC+BFA處理24 h，初生根和不定根GUS活性比單一DDC處理的強；同樣，Cd+DDC+BFA處理的GUS活性也比Cd+DDC處理的強（圖6），表明O-2· 調(diào)節(jié)的生長素重新分布與蛋白轉(zhuǎn)運有關(guān)。DDC+MG132處理的根GUS活性比DDC處理的強，與此類似，Cd+DDC+MG132處理的根GUS活性也比Cd+DDC處理的高（圖6），說明O-2· 介導(dǎo)的生長素重新分布與蛋白降解有密切關(guān)系。

3討論與結(jié)論

越來越多的研究表明，ROS是調(diào)節(jié)植物根系生長發(fā)育的重要信號分子[12-13]。前期研究顯示，在分子水平上O-2· 影響生長素和細(xì)胞周期基因的表達(dá)[15]。本研究中不同處理條件下初生根、不定根、側(cè)根生長的動態(tài)變化與O-2· 水平有密切關(guān)系。在Cd脅迫和非脅迫條件下，較高的O-2· 促進(jìn)不定根和側(cè)根的生長發(fā)育，特別是在幼苗生長早期（5～7 d）這種促進(jìn)作用更明顯（圖1至圖5）。這些結(jié)果說明 O-2· 在水稻根系生長過程中有重要的調(diào)節(jié)作用。值得注意的是，在幼苗生長早期適量的O-2· 促進(jìn)根系的快速生長對植物在脅迫條件下的生存至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，生長素運輸是水稻不定根形成所必需的[4]，本研究中DDC和Cd+DDC處理5 d時顯著促進(jìn)了不定根的形成和生長，說明O-2· 在這一過程中可能影響了生長素運輸（圖2、圖5）。生長素分布的動態(tài)變化調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的眾多過程。本研究中根系生長的動態(tài)變化與生長素分布的動態(tài)變化密切關(guān)聯(lián)，較高水平的O-2· （DDC和Cd+DDC處理）加快了生長素的重新分布，促進(jìn)了不定根和側(cè)根的快速生長（圖5）。生長素的局部濃度是生長素合成和轉(zhuǎn)運共同作用的結(jié)果，與蛋白轉(zhuǎn)運和代謝有關(guān)。本研究中DDC+BFA/MG132和Cd+DDC+BFA/ MG132處理的根中GUS活性明顯高于DDC和Cd+DDC處理的根，這些結(jié)果證實O-2· 介導(dǎo)的生長素重新分布與蛋白轉(zhuǎn)運和降解有密切關(guān)系。O-2· 與生長素信號存在交互作用，本試驗條件下O-2· 可能在生長素信號傳導(dǎo)途徑的上游發(fā)揮作用，因為O-2· 影響生長素的分布，但不能排除 O-2· 通過其他途徑調(diào)節(jié)水稻根系的生長和生長素分布。

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