幾種中藥提取物對不同病原菌的抑制作用

張文芳　高郁芳

隨著時代的發(fā)展，人們健康意識的逐漸提高，環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品的安全性受到了廣泛重視，而且對農(nóng)藥殘留的限制也要求的很嚴格。近年來，化學農(nóng)藥被大量使用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于多數(shù)在自然環(huán)境中不易降解，蓄積能力強，導致污染了環(huán)境，使病蟲害產(chǎn)生了抗藥性，破壞了生態(tài)平衡，農(nóng)作物及畜產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量超標，危害了人體健康。而最值得注意的是生產(chǎn)這些化學農(nóng)藥過程中三廢的排放問題，按我國1998年生產(chǎn)化學農(nóng)藥約18萬t計，年排放的三廢超過40萬t[1]。因此，化學農(nóng)藥的使用量勢必會不斷下降，而植物源農(nóng)藥將替代化學農(nóng)藥廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

植物源農(nóng)藥的活性成分是自然存在的物質(zhì)，在自然界中的降解不污染環(huán)境，不會對人體產(chǎn)生危害，且低毒、低殘留、病蟲害不易產(chǎn)生抗藥性， 農(nóng)產(chǎn)品的高品質(zhì)能夠得到充分保留。植物源農(nóng)藥活性成分復雜，通常能作用于靶標生物的多個位點，有利于延緩靶標生物的抗藥性；有些植物源農(nóng)藥還能刺激植物生長，起到生長調(diào)節(jié)作用[2]。因此植物源農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。

紀淑娟等對丁香抑菌成分超聲波提取工藝進行研究，得到以95%乙醇為溶劑的提取物對灰葡萄孢菌的抑菌率為62.47%[3]；楊幫等對美洲商陸抑菌活性進行研究，得出以極性強的甲醇為溶劑對柑橘綠霉病和小麥紋枯病2種病原菌的抑菌率均達100%[4]；崔永明等在甘草總黃酮的提取技術及其抑菌活性研究中指出甘草總黃酮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用均較為明顯[5]；楊國平等通過天南星提取物對小鼠S180肉瘤的抑制作用的研究，得出天南星醇提物對小鼠S180肉瘤表現(xiàn)出明顯的抑制生長作用，并未造成明顯毒害作用[6]。根據(jù)上述文獻可知，丁香、商陸、甘草、天南星對不同致病菌有很強的抑制生長作用，而為研究不同中藥提取物對不同致病菌的抑制作用，本試驗選用8種中藥材的提取物對4種主要致病菌進行抑菌活性研究，以篩選出對主要致病菌有抑制作用的中藥提取物，對于開發(fā)和利用我國豐富的中藥植物資源，有著十分重要的意義。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器與試劑

LRH—280型微電腦控制生化培養(yǎng)箱、LDEX—40SCⅠ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、無菌操作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、回流提取器、HH—S型恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿、試管、分析天平﹑托盤天平﹑玻璃棒﹑燒杯、量筒、錐形瓶、玻璃吸管﹑酒精燈﹑涂布棒、打孔器、接菌環(huán)、挑針、記號筆等。95%乙醇、75%乙醇、無菌水等。

1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli），由吉林農(nóng)業(yè)科技學院微生物實驗室提供；帶有薏苡彎孢葉斑病菌的病葉和菜豆灰霉病菌的病果，均采自吉林農(nóng)業(yè)科技學院九站校區(qū)藥植園。

1.3 供試藥材

辛夷（Magnolia biondii Pamp.）的干燥花蕾、艾蒿（Artemisia argyi Levl.et Van.）的干燥葉、北豆根（Menispermum dahuricmn DC.）的干燥根莖、天南星[Arisaema erubescens （Wall.） Schott]的干燥塊莖、丁香（Eugenia aromatica Baill）的干燥花蕾、商陸（Phytolacca acinosa Roxb.）的干燥根、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖、蘿藦[Metaplexis japonica （Thunb.） Mark.]的干燥全草，以上藥材均購自國營中藥材藥店。

1.4 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 20g，水 1000ml；高溫濕熱滅菌：121℃ 30min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，瓊脂 20g，水 1000ml；pH 7.0-7.2；高溫濕熱滅菌：121℃ 30min。

2 試驗方法

2.1 病原菌的分離、純化與鑒定

2.1.1 薏苡彎孢葉斑病菌的分離、純化與鑒定

取帶有病斑的薏苡葉，于病健交界處剪成2mm×5mm的長方形小塊，在無菌操作臺中對其進行表面消毒，先置于75%乙醇中滅菌25s，取出，然后放入到0.1%升汞中滅菌3-5min，取出，再放入到無菌水中洗滌3次。

將上述經(jīng)滅菌的病組織采用五點法接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，倒置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)3-5d，觀察菌體生長情況，挑取組織邊緣長出的菌絲，接種到新培養(yǎng)基中，多次重復挑取、接種，進行純化。

根據(jù)左淑珍等對玉米彎孢菌葉斑病及其抗源鑒定、抗性遺傳研究現(xiàn)狀鑒定此種病菌為薏苡彎孢葉斑病菌（Coix curvularia lunata）[7]。

2.1.2 菜豆灰霉病菌的分離、純化與鑒定

菜豆灰霉病菌的分離采用菌絲直接挑取培養(yǎng)法。將帶病的病果用無菌水擦洗干凈，在無菌操作臺上，用75%乙醇擦拭沒有菌絲的部分進行表面消毒，用消毒過的鑷子撥開表層菌絲，挑取內(nèi)層的菌絲，將其接種于PDA平板培養(yǎng)基上，倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，3天后觀察、挑取邊緣菌絲，將其移至新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進行純化。

根據(jù)楊素梅等對菜豆灰霉病的發(fā)生與防治措施的研究鑒定該病菌的病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）[8]。

2.2 中藥提取液的制備

將上述中藥材料粉碎，取粉碎的各類藥粉30g，以95%乙醇為溶劑（藥粉：95%乙醇=1：15[3]），采用回流提取法提取4h（提取溫度為85℃），然后將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行濃縮，再用95%乙醇定容，使溶液的濃度為1g/ml，然后移置廣口瓶中，密封， 保存于4℃冰箱中，備用。

2.3 供試菌種的活化擴繁與菌懸液的制備

薏苡彎孢葉斑病菌、菜豆灰霉病菌的活化擴繁：將冰箱中純化的病原菌取出，在無菌操作臺中分別用滅菌后的接種環(huán)接種于新PDA培養(yǎng)基上，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)3-5d，備用。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的活化：分別將菌種用接種環(huán)接種于含牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基試管中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，備用。

菌懸液的制備：將20ml無菌水倒入含已活化好的細菌的試管中，用滅菌的接種環(huán)將菌種挑起，稍加振搖，既得金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的菌懸液。

2.4 幾種中藥提取物的抑菌活性測定

2.4.1 幾種中藥提取物對病原真菌的抑制作用

采用生長速率法[9]，測定各類藥材1g/ml的乙醇提取物對供試菌種的抑制效果。

在無菌條件下，取各類藥材提取物1ml分別加入無菌的直徑9cm培養(yǎng)皿中，對照組加入等量95%乙醇，再加入10mlPDA培養(yǎng)基，混勻，待其凝固后，得到含藥平板。用直徑0.6cm的打孔器分別制得薏苡彎孢葉斑病菌和菜豆灰霉病菌的菌餅，用挑針將菌餅接種于含藥平板中央，28℃條件下進行恒溫培養(yǎng)，每次處理重復3次。3d后開始觀察菌落大小，并采用十字交叉法測量菌落直徑，連續(xù)測量4d，并記錄數(shù)據(jù)，計算抑菌率[9]。

菌落生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-打孔器直徑）×100%

所得結(jié)果通過spss軟件進行方差分析，進而采用SNK-q檢驗法進行顯著性檢驗。

2.4.2 幾種中藥提取物對細菌的抑制作用

采用濾紙片法[10]，測定各類藥材1g/ml的乙醇提取物對供試菌種的抑制效果。

用打孔器將濾紙打成直徑0.8cm的圓片，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，放入盛有各提取物的容器中浸泡1h，對照組濾紙片用95%乙醇浸泡。向平板中的培養(yǎng)基表面加入0.5ml已配制的金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的菌懸液，用三角涂布棒將其均勻涂布，采用五點法將浸泡好的濾紙片放入到平板中，每次處理重復3次，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)24h，然后用十字交叉法測量抑菌圈直徑。用表示抑菌圈的直徑。

2.5 幾種中藥提取物的最小抑菌濃度測定

通過上述實驗，篩選出丁香和辛夷對兩種病原真菌、商陸對菜豆灰霉病菌分別作最小抑菌濃度試驗。在無菌條件下，用95%乙醇將各提取物稀釋成稀釋度為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的溶液，分別精取各濃度溶液1ml與適量PDA培養(yǎng)基混合均勻，制成含藥培養(yǎng)基，冷卻，備用。將打好的病原菌菌餅接種到含藥培養(yǎng)基上，倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，每次處理重復3次，從第3d開始觀察，每間隔1d觀察一次，連續(xù)觀察至第7d。得到最小抑菌濃度[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 幾種中藥提取物對真菌的抑制作用

3.1.1 幾種中藥提取物對菜豆灰霉病菌的抑制作用

由表3-1可知各類中藥提取物除天南星外都對病原菌的生長產(chǎn)生了抑制作用，其中辛夷、商陸和丁香的提取物對菜豆灰霉病菌的抑菌率均達100%，與其他中藥提取物有極顯著性差異；其次是北豆根和蘿藦的提取物，抑菌率達到76.3%；甘草提取物的抑菌率為69.7%；艾蒿提取物的抑菌率相對較低，為33.8%；天南星提取物對菜豆灰霉病菌無抑制作用。從結(jié)果來看，辛夷、商陸和丁香的提取物表現(xiàn)出較強的抑菌活性，可見，辛夷、商陸和丁香提取物中含有的抑菌活性成分較多。

3.1.2 幾種中藥提取物對薏苡彎孢葉斑病菌的抑制作用

由表3-2可知各類中藥提取物都對病原菌的生長產(chǎn)生了抑制作用，其中辛夷和丁香的提取物對薏苡彎孢葉斑病菌的抑制效果最好，抑菌率達到100%；其次是甘草和商陸的提取物，抑菌率也達到83%左右；而北豆根、蘿藦和艾蒿提取物的抑菌率也分別達到了70.8%、65.4%、59.1%；天南星提取物對薏苡彎孢葉斑病菌的抑制作用不是很明顯，抑菌率為2.5%。從結(jié)果看，辛夷和丁香的提取物中抑菌成分的活性較強，可見，辛夷和丁香中的抑菌活性成分為醇溶性成分。

3.2 幾種中藥提取物對細菌的抑制作用

由表3-3可知，幾種中藥提取物對大腸桿菌的抑制效果整體比對金黃色葡萄球菌的抑制效果好，其中丁香提取物的活性最強，甘草、商陸和蘿藦的提取物的活性較弱；而這些提取物對金黃色葡萄球菌也有不同程度的抑制效果，甘草和丁香提取物的活性最強，而辛夷和艾蒿提取物對金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)為無活性。從結(jié)果看，丁香提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有很強的抑制作用；而甘草提取物只對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出很強的活性。

3.3 幾種中藥提取物的最小抑菌濃度

由表3-4可以看出，不同稀釋度的辛夷提取物對真菌的抑制效果不同，濃度越大，抑制效果越好。實驗得出，辛夷提取物對菜豆灰霉病菌和薏苡彎孢葉斑病菌的最小抑菌濃度分別為0.125g/ml、1g/ml。

由表3-5可以看出，不同稀釋度的丁香提取物對菜豆灰霉病菌和薏苡彎孢葉斑病菌的抑制效果基本相同，最小抑菌濃度均為0.0625g/ml。

由表3-6可以看出，不同稀釋度的商陸提取物對菜豆灰霉病菌的抑制效果也是隨著濃度的降低而減弱。實驗得出，商陸提取物對菜豆灰霉病菌的最小抑菌濃度為0.5g/ml。

綜上所述，8種中藥提取物除天南星提取物外對兩種病原菌均有很好的抑制效果。辛夷、商陸和丁香的提取物對菜豆灰霉病菌抑菌效果最好，達到了完全抑制的效果；辛夷和丁香提取物對薏苡彎孢葉斑病菌抑菌效果也是最好，達到完全抑制的效果。對于細菌來說，這幾種中藥提取物除辛夷和艾蒿提取物對金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性外，其他提取物對兩種細菌均有不同程度的抑菌活性。總體上來說，這些提取物對大腸桿菌的抑菌活性要好于對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，甘草和丁香的提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，丁香提取物對大腸桿菌的抑菌活性也最強，其他提取物對大腸桿菌也均有不同程度的抑菌活性。

綜合上述實驗結(jié)果可以看出，丁香提取物對4種病原菌均有很強的抑制作用。丁香提取物的主要成分為揮發(fā)油，揮發(fā)油中含量最高的組分是丁香酚，而揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌作用，丁香酚對不同病原真菌均有較強的抑制和殺滅作用，因此，丁香提取物中主要的抑菌成分應為揮發(fā)油中的丁香酚；丁香提取物中抑菌成分并非單一的丁香酚，丁香提取物中所含的脂溶性成分、水溶性成分均對金黃色葡萄球菌有很強的抑菌作用[11]。這與前人研究的丁香提取物對不同致病菌均有很強的抑菌作用相吻合。李巧如等[12]通過研究丁香提取物與各類抗菌素間的相互作用探討其抗菌機理，推測丁香提取物的抗菌機理可能是由于氨基糖苷類競爭性地抑制蛋白質(zhì)的合成而產(chǎn)生的。

辛夷提取物對兩種病原真菌均有很強的抑菌作用。辛夷提取物中生物堿類成分對致病性的真菌有明顯的抑制作用；高濃度的辛夷提取物對細菌有不同程度的抑制作用[13，14]。商陸提取物對菜豆灰霉病菌有很好的抑制作用。商陸提取物中的總皂甙成分對真菌菌體的生長有很好的抑制作用[4]。甘草提取物中主要含有甘草酸、甘草苷、異甘草素等活性成分，對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌活性[15]；甘草中的總黃酮成分對細菌的抑菌效果也較為明顯[5]。

本試驗分別用8種不同中藥的乙醇提取物對4種常見致病菌作了抑菌活性研究，從結(jié)果來看，總體上這些提取物的抑菌效果有明顯差異，但個別提取物之間的差異不明顯，產(chǎn)生這樣的原因可能是由于提取過程中的差異造成，或是其他成分同時也被提取出來，也有可能是藥材地域性、季節(jié)性的變化而影響其有效成分含量，亦或是致病菌本身的差異，而影響了對各個菌種的抑菌效果。本試驗只采用了95%乙醇作為提取溶劑提取得到8種中藥的粗提物，沒有對其他溶劑進行研究，也沒有對粗提物進一步提取確定其抑菌活性成分為單體成分或幾種成分聯(lián)合作用進行研究；真菌在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)生分生孢子，因而只對菌絲作了抑菌活性研究，沒能作對致病菌分生孢子形成和萌發(fā)的影響試驗[9]，導致了本試驗的局限性。另外，試驗中只針對室內(nèi)的抑菌活性進行了研究，其在田間試驗的防治效果如何，對篩選出抑菌活性強的提取物制成何種劑型能被植物有效吸收，使用后是否能完全降解，還需作進一步深入研究。本研究初步篩選出丁香提取物對不同致病菌均有明顯的抑制作用，為后續(xù)開發(fā)植物源農(nóng)藥應用于生物防治中提供了理論依據(jù)。