馬齒莧生物堿對乳腺癌裸鼠腫瘤抑制的實驗研究

楊華鋒+紀(jì)術(shù)峰+李占文+唐魯兵+史國軍+鐘鎮(zhèn)鏵+范鳳鳳+劉純

[摘要] 目的 探討馬齒莧生物堿對乳腺癌裸鼠腫瘤的抑制作用。 方法 利用體外培養(yǎng)高、低轉(zhuǎn)移的人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MCF-7細胞，并將兩組癌細胞體外培養(yǎng)后移植于裸鼠體內(nèi)，觀察馬齒莧生物堿對腫瘤細胞的抑制效率。比較各組腫瘤組織瘤重，計算腫瘤生長抑制率；通過病理切片HE染色觀察各組腫瘤組織病理學(xué)變化，并通過高效液相色譜分析腫瘤組織對馬齒莧生物堿的親和力。利用ELISA檢測方法分析腫瘤局部組織VEGF的表達水平。 結(jié)果 馬齒莧MDA-MB-231組和馬齒莧MCF-7組腫瘤體積明顯縮小，MCF-7組和MDA-MB-231組腫瘤體積較馬齒莧干預(yù)組明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。馬齒莧生物堿干預(yù)乳腺癌裸鼠后，病理顯示腫瘤細胞減少，并伴有腫瘤壞死和調(diào)亡。實驗結(jié)果顯示腫瘤組織對馬齒莧生物堿有較高的親和力。同時研究還顯示馬齒莧生物堿對腫瘤的VEGF有顯著的抑制作用（P=0.000）。 結(jié)論 馬齒莧生物堿能有效抑制乳腺癌細胞的生長，調(diào)控腫瘤細胞代謝，可能有望成為乳腺癌的新的治療方法和手段。

[關(guān)鍵詞] 馬齒莧；乳腺癌；高效液相色譜；血管表皮生長因子

[中圖分類號] R285 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）06-0025-05

[Abstract] Objective To study the inhibitory effect of alkaloids from purslane on breast cancer in nude mice. Methods Human breast cancer cell lines MDA-MB-231 with high metastatic rate and MCF-7 cells with low metastatic rate were cultured in vitro. And the two cancer cell lines were transplanted in nude mice after being cultured in vitro. The inhibitory effect of purslane alkaloids on tumor cells was observed. The tumor growth inhibition rate was calculated by comparing tumor weight of tumor tissue. The histopathological changes of the tumor tissues were observed by HE staining， and the affinity of the tumor tissue to the alkaloid of the purslane was analyzed by high performance liquid chromatography （RP-HPLC）. The expression level of VEGF in local tissue was analyzed by ELISA. Results The tumor volume of purslane MDA-MB-231 group and purslane MCF-7 group was significantly reduced， and the tumor volume of MCF-7 group and MDA-MB-231 group was significantly higher than that of the control group， and the difference was significant（P=0.000）. After purslane alkaloid intervention of breast cancer in nude mice， the pathology showed the reduction of tumor cells， accompanied by tumor necrosis and apoptosis. The results showed that the tumor tissue had high affinity for the purslane alkaloid. At the same time， it was also shown that the purslane alkaloid had a significant inhibitory effect on VEGF（P=0.000）. Conclusion Purslane alkaloids can effectively inhibit the growth of breast cancer cells， and regulate the metabolism of tumor cells， which may be expected to become a new treatment methods and means of breast cancer.

[Key words] Purslane； Breast cancer； High performance liquid chromatography； Vascular epidermal growth factor

馬齒莧（purslane）為馬齒莧科草本植物，近年來國內(nèi)外研究者對馬齒莧的成分進行了藥理分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬齒莧具有多種活性成分，具有抗腫瘤活性，同時可以提高人體免疫力、改善人體內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)人體機能狀態(tài)。既往研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖對腫瘤細胞有明顯的抑制作用，但有關(guān)馬齒莧對乳腺癌的抗腫瘤作用研究報道較少，本課題主要利用人乳腺癌細胞株（MDA-MB-231和MCF-7），進行體外培養(yǎng)，然后移植于裸鼠乳腺組織內(nèi)，使腫瘤在裸鼠體內(nèi)分裂增殖，將分離提取的馬齒莧生物堿作用于荷瘤裸鼠，觀察馬齒莧生物堿對在體乳腺癌細胞增殖的影響，并通過病理學(xué)分析和腫瘤組織對馬齒莧生物堿的親和力以及腫瘤組織血管表皮生長因子（VEGF）表達進行研究，探討馬齒莧生物堿抗乳腺癌的作用，為乳腺癌的治療尋找新的途徑。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器、細胞株及實驗動物

Dimethyl Sulfoxide、Luminol、P-Coumaric Acid、Paraformaldehyde、Poly Ethyleme Glycol、Glass Beads Acidwashed、Lithium Acetate Dehydrate、MOPS均購于SIGMA公司；NP-40、QRT-PCR試劑盒（購于日本TaKaRa）；ECL、HYBOND-PVDF膜、G418、DMEM干粉、RPMI1640干粉、胎牛血清、Regular-Agarose G-10（均購于Gibco公司）；Leupeptin Hemisulfate、Aprotinin均購于Merck公司；疊氮酸鈉、釩酸鈉（購于廣州維嘉科技有限公司）；高氯酸、無水氯化鈉（購于天津市鑫源化工有限公司）；檸檬酸三鈉、硫酸銨、鹽酸、苯酚（購于上海新高化學(xué)試劑有限公司）；乙腈色譜純試劑、氫氧化鈉（購于武漢強松精細化學(xué)品有限公司）；Sodium orthovanadate購于CALBIOCHEM公司；Liprofectamine 2000、Trizol、PI、Annexin-V、DCFH-DA、Trypan Blue/Hepes、Geneticin、Lipofectamine 2000、Opti MEM（均購自Invitrogen）；新鮮馬齒莧于2015年9月購于浙江省杭州市農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)浙大醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院教研室鑒定。用清水洗凈，瀝干水分，60°C鼓風(fēng)干燥 6 h，粉碎備用。細胞培養(yǎng)箱（Thermo，ShellLab）。超凈工作臺（Esco sve-4A1）；T-75培養(yǎng)瓶、T-100培養(yǎng)瓶（購自威佳公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus）；倒置相差顯微鏡（Eclipse TS100-F）；BILON92-IID（溫控型）超聲波細胞粉碎機（上海比朗儀器有限公司）；Waters 510 液相色譜泵、Waters Nova2Pak ODS 色譜柱（3.9 mm×150 mm）、Waters Nova2Pak ODS保護柱（均購于Waters中國有限公司）；Shimadzu RF551熒光檢測器、CF 16RX低溫離心機（均購于日本）；Millipore過濾器、0.45 μm濾膜、METTLER TOLEDOAE240電子天平、LT.9MACIMSYSPULS整體熒光成像系統(tǒng)（均購于美國）；SEPU3010專用軟件（江蘇國達科技有限公司）；MDA-MB-231和MCF-7細胞株購自上海細胞庫。SFP Balb/c裸小鼠，4～6周齡，雌性，體重16～18 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231和MCF-7細胞株購自廣州市中山大學(xué)細胞庫，用10%滅活Gibico血清，100 U/mL青霉素+鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)基（高糖型），恒溫37℃、5%CO2飽和濕度條件下將MDA-MB-231和MCF-7細胞株置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用0.4%胎盼藍經(jīng)拒染法檢測培養(yǎng)基內(nèi)活細胞率>95%以上。

1.2.2 馬齒莧生物堿的分離提取 馬齒莧生物堿的分離提取參照參文[1]的方法。簡述如下：將烘干后的的新鮮馬齒莧草用藥物粉碎機將其粉碎成粉末狀，取200 g馬齒莧草粉末，加1000 mL無水乙醇，40°C溫度下攪拌機攪拌1 h，濾膜過濾，收集濾液；然后剩余濾渣中再次加入600 mL的無水乙醇，同上方法，40℃條件下攪拌機攪拌1.5 h。濾膜過濾，收集濾液保存，濾渣中再加600 mL的無水乙醇，40°C條件下攪拌半個小時。濾膜過濾，收集濾液，將3次收集的濾液混合。放置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中揮發(fā)盡乙醇，乙醇揮發(fā)干后余留黑色浸膏。在黑色浸膏中加10%的硫酸溶液100 mL，浸膏溶解后，過濾。用氨水溶液調(diào)節(jié)pH=10，再加入飽和NaCl水溶液20 mL（72 g NaCl，200 g）。用氯仿溶液萃取5次（1/5原液體積），置通風(fēng)櫥中將氯仿?lián)]發(fā)干凈。實驗時加入10%乙醇溶解，配制成溶液使用。

1.2.3 裸鼠乳腺癌動物模型的建立 MDA-MB-231和MCF-7細胞的接種：以含10%胎牛血清PRMI-1640培養(yǎng)MDA-MB-231和MCF-7細胞，收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231和MCF-7細胞，500 rpm離心后，棄上清，以Hanks液洗滌2次，在無血清PRMI-1640重懸，調(diào)節(jié)濃度適宜。給裸鼠肌注雌激素1 mg，3 d后，取細胞懸液0.1 mL，含細胞數(shù)0.5×107，分別接種于SFP Balb/c雌裸小鼠左側(cè)腋窩乳腺皮下，3 d后再次種植1次，7 d后再次肌肉注射雌激素1 mg，種植后每天觀察注射點有無破潰紅腫，按規(guī)定時間測量腫瘤體積大小。

1.2.4 實驗分組 以腫瘤直徑達0.5 cm定為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。將裸鼠隨機分成4組，每組10只。分組方法：Ⅰ組：馬齒莧MDA-MB-231組；Ⅱ組：馬齒莧MCF-7組；Ⅲ組：MDA-MB-231組；Ⅳ組：MCF-7組。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1 腫瘤生長情況 自成瘤體之日起每3天分別以游標(biāo)卡尺測量各組瘤體大小，按公式計算瘤體重量：瘤重=ab2/2 mg（a：長徑，b：短徑）計算瘤體重量和生長曲線；27 d后處死裸鼠，測瘤重，計算腫瘤生長抑制率：腫瘤生長抑制率=（1-處理組瘤重/空白對照組瘤重）×100%。

1.3.2 腫瘤的病理變化 12 d裸鼠體成瘤后，馬齒莧MCF-7組和馬齒莧MDA-MB-231組，每日給予配制的馬齒莧生物堿溶液灌腸2次，每次15 mL，直至27 d治療結(jié)束后2 h處死。將腫瘤標(biāo)本稱重后，常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別行HE染色觀察病理變化。

1.3.3 高效液相色譜分析馬齒莧生物堿組織親和性 27 d后處死裸鼠，各實驗組于處死裸鼠后，切除各組無壞死裸鼠惡性腫瘤組織各約1 g，并取瘤旁正常組織約1 g，4°C鹽水中沖洗除掉血污，立即置入液氮中，低溫冰箱存放。檢測前分別取保存的標(biāo)本少許，稱重后，按100∶1的比例（質(zhì)量/體積），低溫條件下將標(biāo)本超聲粉碎并與生理鹽水混合，制成10%的腫瘤組織及健康組織勻漿，高速離心后，取上清液待檢。分別取各組標(biāo)本組織上清液500 μL加入等體積的乙腈混合，混勻后室溫下靜置約20 min，然后高速離心約25 min，取5 μL上清液進樣分析。嚴(yán)格按照色譜分析的操作程序進行，流動相有四種緩沖液：1號緩沖液為限制和終止液。2號緩沖液：檸檬酸三鈉+苯酚+鹽酸按規(guī)定比例混合溶解，加水稀釋至2000 mL，調(diào)節(jié)pH=4.25，Millipore過濾器過濾并收集。3號緩沖液：檸檬酸三鈉+氯化鈉+鹽酸+苯酚按規(guī)定比例混合溶解，加水稀釋至2000 mL，pH=6.45，Millipore過濾器過濾收集。4號緩沖液：主要為氫氧化鈉溶液，加水稀釋至500 mL，配制成0.4 M濃度的溶液，Millipore過濾器過濾收集。采用梯度洗脫方式進行標(biāo)本分析，初始相：A相為100%，B相為0；洗脫程序進行約8 min后，A相逐漸降至10%，B相又反向逐漸升高達到90%；隨著時間的推移，A相和B相又逐漸回升至初始狀態(tài)，泵流速為1.3 mL/min，熒光檢測器的激發(fā)波長為335 nm，檢測波長為455 nm，以外標(biāo)法用紫外線檢測器測定馬齒莧生物堿的含量，面積外標(biāo)法計算馬齒莧生物堿的含量。

1.3.4 各實驗組組織中VEGF表達水平 取各實驗組腫瘤組織和瘤旁健康組織勻漿，利用ELISA法檢測各組組織勻漿中VEGF表達水平。嚴(yán)格按照VEGF ELISA試劑盒操作說明進行。簡述如下：分別將待檢測的標(biāo)本的組織勻漿加入檢測板相應(yīng)孔中（100 μL/孔），封孔室溫孵育2 h。洗板數(shù)次并將板拍干，加入抗體工作液，封孔室溫孵育1 h。洗板拍干，加入顯色劑TMB避光室溫孵育約20 min，加入終止液50 μL/孔，混勻后即可測量OD450值。根據(jù)檢測的OD450值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料不同組之間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。對檢測結(jié)果的相關(guān)性分析采用Spearson 積矩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤裸鼠腫瘤生長情況

接種腫瘤細胞后12 d左右，出現(xiàn)皮下腫瘤結(jié)節(jié)，待瘤達0.5 cm后為成瘤。自成瘤體之日起每3天分別以游標(biāo)卡尺測量各組瘤體大小，觀察27 d，殺鼠，腫瘤標(biāo)本的稱重結(jié)果及抑瘤率：Ⅰ組：（69.03±3.09）mg，95.03%；Ⅱ組：（69.10±4.12）mg，95.03%；Ⅲ組：（488.94±4.50）mg，0.37%；Ⅳ組：（489.96±6.27）mg，0.40%?？梢姡M間瘤重有顯著差異（F=12727.420，P=0.000），第Ⅰ、Ⅱ組明顯縮小，Ⅲ、Ⅳ組腫瘤生長情況組間無明顯差異（P>0.166）。見封三圖1。

2.2 腫瘤病理變化

見封三圖2、3。封三圖2為MDA-MB-231和MCF-7細胞組腫瘤組織切片，癌細胞呈實性條索狀或小片狀巢狀生長，癌細胞多，間質(zhì)較少，可見明顯的核分裂。封三圖3 為馬齒莧MDA-MB-231組和馬齒莧MCF-7組腫瘤組織切片，可見腫瘤細胞呈條索裝生長，癌細胞數(shù)量減少，伴腫瘤細胞壞死和調(diào)亡，核分裂少見。

2.3 高效液相色譜分析腫瘤組織及正常對照組織的馬齒莧生物堿水平

圖1～5為高效液相色譜分析腫瘤組織及正常對照組織的波譜圖，利用紫外線檢測器測定各實驗組馬齒莧生物堿水平，以面積外標(biāo)法計算馬齒莧生物堿的含量。統(tǒng)計結(jié)果顯示：兩組試驗結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)的馬齒莧生物堿含量高于腫瘤組織旁組織，有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000）。腫瘤組織兩組馬齒莧生物堿含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.230）；腫瘤旁組織中馬齒莧生物堿的含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.103）。見表1。

2.4 各實驗組組織中VEGF水平變化

統(tǒng)計結(jié)果顯示：MDA-MB-231組VEGF水平高于MCF-7組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000）。腫瘤空白組（MDA-MB-231組和MCF-7組）VEGF含量高于馬齒莧生物堿干預(yù)組（馬齒莧MDA-MB-231組和馬齒莧MCF-7組），有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000）。馬齒莧生物堿干預(yù)的兩組VEGF含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.098）。見表2。

3 討論

馬齒莧為馬齒莧科草本植物，分布廣泛，不同氣候條件均可生長，可食用亦可入藥，藥性寒味酸，既往研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧成分復(fù)雜，含皂甙、氨基酸、有機酸、生物堿、鞣酸類蛋白、維生素C以及抗腫瘤活性物質(zhì)，具有清熱、解毒、止痢、去濕抗腫瘤等功效[2-3]。其在祖國醫(yī)學(xué)《本草經(jīng)集注》和《本草圖經(jīng)》等經(jīng)典中均有記載，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。近年來研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧等有很多中藥含有植物生物堿一類的活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、提高免疫力等多種生物學(xué)效應(yīng)[4-10]，其生物學(xué)作用越來越受到研究者的重視，馬齒莧生物堿屬于植物生物堿的一類，目前馬齒莧生物堿對乳腺惡性腫瘤抑制的作用和機制研究報道很少，本實驗主要觀察了馬齒莧生物堿對人乳腺癌細胞增殖作用的影響，實驗結(jié)果表明馬齒莧生物堿對荷瘤裸鼠乳腺癌細胞增殖具有較好的抑制作用，抑瘤率高達95%。此前多項研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖對肝癌細胞（SMMC7721）增殖具有明顯的抑制作用[11-13]，與能使移植性實體瘤生長得到明顯抑制的結(jié)論基本一致。馬齒莧抗乳腺腫瘤的機制目前研究不多，機制也尚不十分清楚，分析其可能的機制是因為馬齒莧生物堿激活了機體的體液免疫和細胞免疫功能，使T淋巴細胞的數(shù)量和活性增多、加強，并使細胞免疫也進入活躍狀態(tài)，增強對腫瘤細胞的殺傷作用。盧新華等[14]研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖可以顯著提高小鼠巨噬細胞吞噬指數(shù)，促進淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，增強機體抗腫瘤活性。這也從一定意義上佐證了我們對馬齒莧抗乳腺癌細胞機制的分析。

為了進一步研究馬齒莧生物堿的抗腫瘤機制，本實驗利用高效液相色譜分析了腫瘤組織和非腫瘤組織中馬齒莧生物堿藥物的聚集濃度，探索馬齒莧生物堿腫瘤抑制的內(nèi)在因素，研究結(jié)果顯示乳腺癌組織對馬齒莧生物堿有較高親和性和相容性，乳腺癌組織馬齒莧生物堿的親和性明顯高于腫瘤旁組織，且對腫瘤細胞的作用為持續(xù)性和漸進性，由此我們可以推測，腫瘤細胞膜上可能存在可供馬齒莧生物堿結(jié)合的受體機構(gòu)，通過競爭的結(jié)合，活化腫瘤細胞膜上某些靜止?fàn)顟B(tài)和半靜止?fàn)顟B(tài)的可結(jié)合馬齒莧生物堿的受體。使其與游離狀態(tài)的馬齒莧生物堿結(jié)合，進而啟動激活的腫瘤細胞調(diào)亡的信號通路，隨著馬齒莧生物堿濃度的增加和作用時間的延長，馬齒莧生物堿在腫瘤部位高濃度聚集，可能對腫瘤細胞的殺傷或抑制作用逐漸增強。而在正常健康組織并不聚集，不會對正常組織產(chǎn)生損傷和毒性。研究結(jié)果顯示在馬齒莧生物堿干預(yù)后的乳腺癌細胞，無論是高遷徙專業(yè)特性的MDA-MB-231乳腺癌細胞，還是低遷徙轉(zhuǎn)移特性的MCF-7乳腺癌細胞，均有較好的抗腫瘤和殺傷腫瘤的活性作用。病理切片顯示在經(jīng)過馬齒莧生物堿治療后，裸鼠腫瘤細胞數(shù)目減少，并伴有癌細胞的壞死和調(diào)亡，核分裂少。實驗結(jié)果也證實了我們的推測。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血小板源性生長因子家族中的一個亞家族，在胚胎及后天的發(fā)育中，廣泛參與血管的發(fā)生、血管的再生及淋巴管的生成。VEGF是惡性腫瘤獨立的預(yù)后因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要作用[15-16]，在人體多種組織的惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，VEGF表達水平主要與腫瘤組織微血管密度密切相關(guān)，呈正相關(guān)關(guān)系，高表達VEGF可以刺激組織細胞促使腫瘤血管生成，進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，通過與細胞膜上VEGF受體特異性結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)，介導(dǎo)絡(luò)氨酸激酶磷酸化，從而使其發(fā)揮一系列生理功能[17-21]。本實驗研究顯示在體裸鼠乳腺癌組織中VEGF為高表達，水平含量較高，而經(jīng)過馬齒莧生物堿干預(yù)后VEGF水平顯著降低，提示馬齒莧生物堿可以干擾VEGF的代謝，進而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。由此可以推測馬齒莧生物堿具有成為抗人乳腺癌的一種新治療藥物，具有藥物的開發(fā)潛力，同時也為乳腺癌的治療尋找一種新的思路。

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（收稿日期：2016-12-10）