農(nóng)桿菌侵染條件對玉米單倍體遺傳轉(zhuǎn)化的影響

趙愛菊，陳希勇，高增玉，王江浩

（河北省作物遺傳育種實驗室，河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北 石家莊 050035）

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對農(nóng)作物性狀進行改良是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的重要應(yīng)用，該技術(shù)可以突破物種間的遺傳障礙、跨越物種間的不親和性、豐富作物的基因資源，從而達到改良農(nóng)作物性狀的目的[1]。轉(zhuǎn)基因玉米是全球種植面積較大、商業(yè)化較早的轉(zhuǎn)基因作物之一，其遺傳轉(zhuǎn)化一直備受人們關(guān)注[2～8]。到目前為止，雖然對農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化有很多報道，但大多以幼胚等二倍體為受體材料，且轉(zhuǎn)基因植株需經(jīng)若干代的自交篩選才能得到純合的轉(zhuǎn)基因植株，育種程序復(fù)雜。隨著單倍體和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，國內(nèi)外開始了以單倍體為受體的轉(zhuǎn)基因研究，并且在小麥[9]、水稻[10]、煙草[11]和亞麻[12]等植物上得到了成功應(yīng)用。玉米的胚芽鞘[13]和莖尖組織[14]等單倍體受體也已經(jīng)實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)化，但由于植株生長勢弱，移栽不易存活，因而未能成為主流的轉(zhuǎn)基因受體。陳琦[15]利用玉米單倍體幼胚和成熟胚為受體材料進行轉(zhuǎn)基因研究，開拓了單倍體轉(zhuǎn)基因的新方向。

玉米單倍體的遺傳轉(zhuǎn)化是一個復(fù)雜過程，受到多種因素的影響。侵染條件的優(yōu)化對提高其轉(zhuǎn)化效率具有重要作用。通過繼代可以讓愈傷組織長時間保持胚性，而胚性愈傷組織是進行侵染的先決條件。截至目前，該方面的報道內(nèi)容多集中于如何高頻率地誘導(dǎo)愈傷組織，而對于繼代條件的研究很少。菌株選擇是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。農(nóng)桿菌菌株的侵染力在不同玉米基因型之間存在很大差異，因而，不同的玉米自交系對應(yīng)存在著最為敏感的農(nóng)桿菌菌株[16]。權(quán)瑞黨等[17]和莊志揚等[18]認為，高濃度的農(nóng)桿菌有利于玉米細胞轉(zhuǎn)化，但菌液濃度過高會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。侵染時間過短，農(nóng)桿菌未吸附或吸附的農(nóng)桿菌少，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率不高；而侵染時間過長，則會因農(nóng)桿菌過度繁殖而造成抑菌困難，也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。因此，確定農(nóng)桿菌的最佳侵染條件十分重要。

以HHI69誘導(dǎo)系對改58-2、A220、A218自交系誘導(dǎo)的單倍體為受體材料，在現(xiàn)有二倍體受體材料高效再生的基礎(chǔ)上，對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米單倍體遺傳轉(zhuǎn)化的侵染條件進行研究，旨為建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)單倍體遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的單倍體幼胚由骨干自交系改58-2、A220和A218與HHI69誘導(dǎo)系雜交得到。待誘導(dǎo)系花粉授粉后9～15 d，幼胚大小為2 mm時摘取玉米果穗。

本研究的農(nóng)桿菌菌株為LBA4404和EHA105，攜帶載體質(zhì)粒為pCAMB IA3300，該質(zhì)粒帶有組成型啟動子CaMV35S。所用目的基因及質(zhì)粒表達載體，均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)倪中福老師提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 本研究分3個試驗完成。

1.2.1.1 菌株種類對玉米單倍體愈傷組織侵染力的影響。以自交系改58-2、A220和A218與HHI69誘導(dǎo)系雜交得到的單倍體胚為受體材料，用攜帶相同載體的LBA4404和EHA105菌株侵染玉米愈傷組織并進行共培養(yǎng)2.5 d。取愈傷組織進行GUS染色，根據(jù)GUS染色率判斷不同菌株的侵染力。

1.2.1.2 侵染濃度和侵染時間對玉米單倍體愈傷組織侵染力的影響。使用攜帶載體的EHA105，將自交系改58-2與HHI69雜交的單倍體愈傷組織浸泡在OD600（侵染濃度） 分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液中侵染10、20、30 min，用無菌紙將愈傷表面殘余菌液吸干，置培養(yǎng)基（100 mg/L AS） 上25℃共培養(yǎng)2.5 d。將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有250 mg/L羧芐青霉素的恢復(fù)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)14 d。取愈傷組織進行GUS染色，根據(jù)GUS染色率判斷不同侵染濃度和侵染時間的侵染力。

1.2.1.3 繼代時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響。將誘導(dǎo)的愈傷組織繼代培養(yǎng)，將繼代不同時間（4、6、8、10、12、15 d） 的愈傷組織浸泡在OD600為0.7～0.8的侵染液中侵染30 min，經(jīng)篩選后統(tǒng)計抗性愈傷組織的數(shù)目，計算抗性愈傷組織率。

1.2.2 GUS染色 參照Jefferson[19]的方法，取共培養(yǎng)過的愈傷組織放入GUS染色液中，37℃溫浴4～6 h，統(tǒng)計GUS表達的愈傷數(shù)。根據(jù)公式，計算愈傷組織的GUS瞬時表達率∶

GUS瞬時表達率＝GUS表達的愈傷數(shù)/愈傷總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株種類對玉米單倍體愈傷組織侵染力的影響

相同菌株條件下，改58-2單倍體愈傷組織的GUS瞬時表達率均明顯高于自交系A(chǔ)220和A218（圖1），表明侵染力在不同的玉米基因型之間存在差異。相同玉米基因型條件下，EHA105菌株的侵染力均＞LBA4404菌株，且使用EHA105菌株侵染的愈傷組織表面的藍斑面積明顯大于使用LBA4404菌株侵染（圖2），表明使用EHA105菌株侵染轉(zhuǎn)移到玉米愈傷組織中的T-DNA量大于使用LBA4404菌株侵染。但是，EHA105菌株侵染在提高瞬間表達率的同時，也有可能對玉米單倍體愈傷組織造成的傷害比使用LBA4404菌株侵染要大。因此，在后期的共培養(yǎng)中，應(yīng)嚴格控制共培養(yǎng)環(huán)境，避免農(nóng)桿菌過度生長。

圖1 菌株種類對玉米單倍體愈傷組織侵染力的影響Fig.1 Effects of infectivity of different agrobacterium strains to maize haploid callus

圖2 不同菌株侵染的玉米單倍體愈傷組織的藍斑面積Fig.2 The area of blue spot of maize haploid callus infected by different agrobacterium strains

2.2 侵染濃度和侵染時間對玉米單倍體愈傷組織侵染力的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，侵染過程直接影響到轉(zhuǎn)化成功與否。侵染時間為10 min時，GUS染色率隨著菌液OD600的增大而逐漸提高；侵染時間為20和30 min時，GUS染色率均隨菌液OD600的增大呈先升高后降低的變化趨勢，且均以菌液OD600=0.7時最大。侵染時間為20 min條件下，菌液OD600=0.7時的GUS染色率（最大值） 為55.86%，菌液OD600=0.8時GUS染色率較菌液OD600=0.7時略有下降；侵染時間為30 min條件下，菌液OD600=0.7時的GUS染色率（最大值） 為65.31%，菌液OD600=0.8時GUS染色率下降到55.26%。表明菌液濃度過高、侵染時間過長會引起農(nóng)桿菌過度生長而抑制愈傷組織的正常生長，致使染色出現(xiàn)下降。

表1 侵染時間和侵染濃度對玉米單倍體愈傷組織侵染力的影響Tabel 1 Effects of different infection time and concentration on the infectivity of maize haploid callus

2.3 繼代時間對玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響

抗性愈傷組織率隨著愈傷組織繼代天數(shù)的增加呈先上升后降低的變化趨勢，且不同繼代天數(shù)處理的差異較大（圖3）。表明胚性愈傷組織狀態(tài)的差異直接影響遺傳轉(zhuǎn)化的效果。其中，繼代8 d的抗性愈傷組織率最高，達到了60.7%；當(dāng)繼代10 d后再進行侵染，其抗性愈傷組織率下降到55.2%；繼代12和15 d的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織率分別為38.1%和14%，明顯低于繼代8 d的抗性愈傷率?？梢钥闯?，繼代8 d后的胚性愈傷組織最適宜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

圖3 繼代時間對抗性愈傷組織率的影響Fig.3 Effect of subculture time on resistant callus rate

3 結(jié)論與討論

以單倍體為轉(zhuǎn)基因受體，得到的陽性植株經(jīng)染色體加倍便可得到純合的二倍體植株，避免了基因沉默、基因丟失等現(xiàn)象的發(fā)生。因此，以單倍體為受體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注。但農(nóng)桿菌介導(dǎo)單倍體的遺傳轉(zhuǎn)化是一個復(fù)雜過程，受多種因素的影響。因此，需要對轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，以使其達到最好的轉(zhuǎn)化效果。以玉米單倍體的幼胚作為受體，針對影響轉(zhuǎn)化的因素進行了研究。重點是利用毒力較強的EHA105菌株在合適的菌液濃度和侵染時間條件下侵染處于生長高峰的愈傷組織，以提高GUS基因的瞬時表達率和抗性愈傷組織率。研究結(jié)果顯示，相同玉米基因型條件下，EHA105菌株的GUS染色率高于LBA4404菌株，侵染的愈傷組織的藍斑面積也較LBA4404菌株大，這與Rashid等[20]和Huang等[21]的研究結(jié)果相同。這可能是由EHA105所攜帶的Ti質(zhì)粒pTiBo542決定的[22]。由于EHA105菌株毒力高，所以在后期的共培養(yǎng)中，應(yīng)嚴格控制共培養(yǎng)環(huán)境，避免農(nóng)桿菌過度生長。

侵染階段是影響單倍體遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要階段，因為單倍體愈傷組織的細胞壁較二倍體厚，所以農(nóng)桿菌的侵染濃度和侵染時間較二倍體會有所不同，需要進一步摸索。本研究結(jié)果表明，單倍體愈傷組織在OD600=0.7的菌液中侵染30 min條件下侵染效果最理想。

Vasil等[23]研究顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織的再生能力會逐漸下降。袁鷹等[24]研究結(jié)果表明，農(nóng)桿菌侵染繼代5 d左右的愈傷組織效果最佳；侵染繼代時間過短或過長，侵染效果均不理想。狀態(tài)優(yōu)良的愈傷組織是進行侵染的關(guān)鍵時期。本研究條件下，在繼代過程中愈傷組織在繼代培養(yǎng)的第8天左右出現(xiàn)長勢的小高峰，是進行侵染的最好時期。

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