公豬受精能力相關(guān)的生物標(biāo)記

張 濤，衛(wèi)恒習(xí)，李 莉，梁 杰，張守全

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

高繁殖力一直是畜牧工作者追求的目標(biāo)，在養(yǎng)豬業(yè)尤顯其重要，因?yàn)榕浞N和妊娠相關(guān)的生產(chǎn)成本與窩產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)。因此，提高豬群繁殖力是提高豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益的重要手段。人工授精技術(shù)在規(guī)模化豬場(chǎng)的廣泛應(yīng)用后，公豬在整個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的重要性越來(lái)越明顯[1]，如何準(zhǔn)確地評(píng)估公豬的繁殖性能和受精能力，淘汰繁殖力較低的公豬是降低養(yǎng)豬效益的重要因素?？梢?，準(zhǔn)確評(píng)定公豬精液受精能力是提高豬場(chǎng)生產(chǎn)水平關(guān)鍵之一。

不同的公豬和其精液的受精能力具有差異，目前，在生產(chǎn)上人們檢查公豬精液品質(zhì)仍采用觀察精子活率、精子密度、精子畸形率等常規(guī)指標(biāo)[2], 這些評(píng)估參數(shù)和公豬受精能力有部分的相關(guān)性，其中以精子活率較準(zhǔn)確，但它是質(zhì)量指標(biāo)而不是數(shù)量指標(biāo)，即它可將精液區(qū)分為“好”或“壞”2種[3]。但也有一些研究者人為，雖然這些數(shù)據(jù)很重要，但是不能準(zhǔn)確判斷雄性個(gè)體的繁殖能力，生產(chǎn)實(shí)際中，一些公豬精液的上述評(píng)定指標(biāo)皆正常，但配種或輸精后卻有較多的發(fā)情正常的母豬返情[4]；不少豬場(chǎng)約有5%～8%母豬窩產(chǎn)仔數(shù)僅3～5頭，使豬群的窩均產(chǎn)仔數(shù)下降（內(nèi)部資料）?？梢姡@些常規(guī)評(píng)估方法不能客觀評(píng)價(jià)公豬精液受精能力，而僅僅是檢查精液品質(zhì)的優(yōu)劣。因此，雖然這些常規(guī)評(píng)定方法已經(jīng)得到廣泛利用，但是由于這些傳統(tǒng)精液品質(zhì)鑒定方法的局限性，還不能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)健康公豬的精液是否達(dá)到了正常工業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)相關(guān)公畜受精能力因素的功能性和分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，這些影響受精能力的因素可區(qū)分為可補(bǔ)償和不可補(bǔ)償因素[5]?？裳a(bǔ)償因素是能夠通過(guò)增加授精劑量的方式克服的，而不可補(bǔ)償因素是不能夠通過(guò)增加授精量來(lái)克服的性狀。在生產(chǎn)中，常常利用提高輸精劑量，和廣泛運(yùn)用的混合精液來(lái)掩蓋了相關(guān)公豬低受精能力的影響，以期提高母豬繁殖性能。由于不同精液之間精子受精能力存在差異，通過(guò)混合精液（混合精液指2 頭或2 頭以上公豬精液混合后輸精）的方法，達(dá)到提高母豬分娩率和產(chǎn)仔數(shù)的目的，也可提高精液處理的效率。但有時(shí)2 頭公豬精液混合后，受精能力可能降低，這可通過(guò)觀察混合后精液的活力是否下降進(jìn)行判斷，且出現(xiàn)這一現(xiàn)象比例較低[6]?，F(xiàn)在很多證據(jù)顯示，生產(chǎn)中有些公豬的精液常規(guī)品質(zhì)鑒定正常，然而其受精能力和繁殖性狀表現(xiàn)較差，雖然采用混合精液可以掩蓋這部分公豬的受精能力的缺陷，但需要加大輸精劑量。采用提高授精劑量和采用混合精液輸精的方式來(lái)掩蓋相關(guān)公豬受精能力低的影響，不僅造成了生產(chǎn)成本的浪費(fèi)，還影響了高水平公豬精液的有效利用。如果能有效地淘汰這些低受精能力的公豬，就可以提高公豬利用效率，減少公豬飼養(yǎng)成本，提高豬肉生產(chǎn)效率。

當(dāng)前的精子質(zhì)量的評(píng)定方式常常不能有效地預(yù)測(cè)公豬的繁殖和受精性能，所以，就需要發(fā)展一些具有準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)性的評(píng)定方法，能夠準(zhǔn)確地評(píng)定公豬受精能力和淘汰繁殖效率低下的公豬。最近的一些研究顯示，在其他家畜上運(yùn)用的一些生物標(biāo)記能夠準(zhǔn)確評(píng)估公畜受精能力和淘汰低繁殖性能較差公畜，在公豬上也有相關(guān)的研究報(bào)道，本文主要是對(duì)受精能力相關(guān)精清蛋白、精子附著蛋白和受精能力相關(guān)遺傳因素作為潛在的受精能力的生物標(biāo)記綜述。

1 精清蛋白

精清是精液的重要組成部分，主要是由雄性附性腺和附睪分泌的，含有一些特殊的有機(jī)和無(wú)機(jī)的影響精子質(zhì)量的成分，在精子獲能和受精過(guò)程中扮演著重要角色，同時(shí)也保護(hù)了精子免受損傷和維持精子壽命的作用。隨著研究的深入，人們希望在精清中尋找某些成份作為判定動(dòng)物精液受精能力的指標(biāo)。例如，牛精清中胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)可增加精子活率、精清中血小板激活因子(PAF)和血小板。激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)、牛精清中脂類和抗氧化物、牛精清中肝素結(jié)合蛋白、豬精清蛋白(PSP)可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)免疫力、異種動(dòng)物精清蛋白對(duì)綿羊精子有影響、狨精液中促受精多肽[8]、豬精清中精子黏合素AWN-1、豬精清中透明帶結(jié)合蛋白、豬精清中精子活率抑制因子(SMIF)、豬精清中頂體素抑制因子[9]、肝磷脂結(jié)合蛋白(HBP)在附睪的精液中含量很少但在體外的精液中含量較高、肝磷脂結(jié)合蛋白在預(yù)冷凍階段可以促使膽固醇的釋放提高精液的活力。對(duì)公豬精清蛋白質(zhì)的分析[10]，發(fā)現(xiàn)了一些重要的精清蛋白，包括骨橋蛋白(osteopontin 55 ku)；及一類精子黏附素家族蛋白包括：豬精清蛋白PSP, 精清精子黏合素AWN-1, AQN。

1993年，Killian等[11]用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，首次發(fā)現(xiàn)牛精清中存在與精液受精能力相關(guān)的4種蛋白，2種精清蛋白(seminal protein, SP)SP26（26 ku，pI 6.6）、SP55(55 ku, pI 4.5)含量高，精液受精能力高，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.89。SP26、SP55含量在高受精能力牛精液中分別是低受精能力精液的3.5倍和2.6倍,稱“受精能力”蛋白（fertility proteins）；另外2種精清蛋白（16 ku,pI 4.1和16 ku,pI 6.7）含量高，牛精液受精能力低，稱“抗受精能力”蛋白（antifertility proteins）。不同采精頻率，公牛精清中SP26含量不同，連續(xù)幾次采精后，檢測(cè)不到精清中SP26的存在。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)牛精清中SP55為糖基化蛋白，而不是磷酸化蛋白；牛精清中SP26被確定為脂類促成素型PGD合酶(lipocalin-Type prostaglandin D synthase)，也存在于腦脊髓中；在人精液中也發(fā)現(xiàn)類似SP26的物質(zhì)（27 ku）存在。Flowers[12]首次在豬精液中發(fā)現(xiàn)“受精能力”蛋白SP26、SP55，但未對(duì)這2種蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量測(cè)定，也未發(fā)現(xiàn)“抗受精能力”蛋白，以SP26、SP55含量相對(duì)高的公豬精液和含量相對(duì)低的公豬精液等精子數(shù)混合輸精，90%(45/50)的仔豬為前者的后代，因該試驗(yàn)未說(shuō)明輸精所用精液的精清來(lái)源，且試驗(yàn)數(shù)據(jù)較少，尚缺乏說(shuō)服力。豬精清中SP26、SP55影響豬精液受精能力的作用機(jī)理的研究尚未見報(bào)道，該領(lǐng)域的深入研究，以豬精清中SP26、SP55含量作為指標(biāo)準(zhǔn)確評(píng)定豬精液受精能力將成為可能。

精清黏附素家族蛋白在精子成熟過(guò)程中包裹在精子表面，引起精子表面膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響精卵融合，精子黏附素被認(rèn)為有利于維持精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)精子-輸卵管相互作用[13]，精子獲能和精-卵相互作用。對(duì)公豬精清中PSP-1進(jìn)行分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)它可能具有阻止精子提前成熟和頂體反應(yīng)的作用，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)它還具有免疫調(diào)節(jié)的活性。另一個(gè)重要的精子黏附素AWN-1，主要是在睪丸網(wǎng)、前列腺、精囊腺和雌性生殖道中合成，可能會(huì)影響精子與透明帶附著的活性，對(duì)于精子的獲能有相關(guān)作用。

考慮這些精清蛋白能否作為受精能力相關(guān)的標(biāo)記物時(shí)，需要采用常規(guī)精液品質(zhì)分析正常公豬的精液，為了消除劑量補(bǔ)償作用，在實(shí)驗(yàn)中常把輸精劑量降低到15億個(gè)/頭份，然后結(jié)合每頭公豬的繁殖指數(shù)進(jìn)行分析，以此來(lái)確定這些特殊蛋白與受精能力之間的關(guān)系。Novak(2011)等人通過(guò)對(duì)受精能力高和受精能力低的公豬群進(jìn)行精清蛋白分析，發(fā)現(xiàn)蛋白PSP-Ⅰ（22-ku）與總產(chǎn)仔數(shù)和稀釋精液7 d活力負(fù)相關(guān)，以前一些研究也發(fā)現(xiàn)PSP蛋白與精子的壽命有關(guān)，但是Novak(2011)等人發(fā)現(xiàn)如果精清中此蛋白過(guò)量或精子暴露其中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能會(huì)造成受精能力降低；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)25 ku的抗氧化酶（GPX-5），被認(rèn)為有保護(hù)精子膜免受氧化損傷，可能與妊娠率和繁殖指數(shù)正相關(guān)。鑒于精清中這些特殊蛋白的重要作用，可以進(jìn)行其更深入的研究，使之成為公豬受精能力和繁殖性能的標(biāo)記物。

2 精子附著蛋白

由于一個(gè)卵子只和一個(gè)精子結(jié)合，所以在輸入的大量精子中只有少量的精子參與受精并形成胚胎，對(duì)于一個(gè)卵子的成功受精需要很適宜和有序的條件。從精子形成到成功受精的過(guò)程中，需要各種適宜的環(huán)境，這就涉及到許多生物因素的參與。就目前對(duì)于公豬繁殖力的生物標(biāo)記的研究，主要是集中在精清中特殊蛋白質(zhì)的分析，同時(shí)對(duì)于一些影響精子形成和在受精過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)也引起了越來(lái)越多的關(guān)注。在公馬上，鑒定出4個(gè)精子膜蛋白與繁殖力有關(guān)，包括：SNARE 蛋白, Caveolin-1, NSF和檸檬酸合成酶；在公牛上也發(fā)現(xiàn)了精子附著類DNA酶Ⅰ與公牛高繁殖能力相關(guān)，以及OPN定位于精子膜上，也與公牛的繁殖力有關(guān)。對(duì)繁殖性能高和低的公牛精子提取物分析發(fā)現(xiàn)，蛋白CCT5和CCT8、ELSPBP1、BSP1、AK1、PEBP1蛋白的含量有顯著的差異。目前對(duì)于精子附著類蛋白質(zhì)作為公豬受精能力標(biāo)記的報(bào)道還比較少，這需要進(jìn)一步探索。

3 遺傳因素

一直以來(lái)，由于繁殖性狀的遺傳力較低，一般不會(huì)作為遺傳育種的參考性狀。生產(chǎn)中常常采用的是通過(guò)雜交和人為的環(huán)境控制來(lái)提高種畜的繁殖性能。在豬生產(chǎn)中，也是采用雜交技術(shù)和繁殖技術(shù)提高種豬的繁殖性能。目前，隨著分子生物和基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，利用相關(guān)的遺傳信息，找出一些準(zhǔn)確和有預(yù)見性的基因組標(biāo)記物，能有效地評(píng)估公畜繁殖力。在公馬上，編碼富含半胱氨酸的分泌蛋白3 (CRISP3) 的編碼基因上具有單核苷酸多態(tài)，CRISP3在精清中大量表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證明它與低受精能力有關(guān)，同時(shí)也報(bào)道了抑制素βA（INHBA）的單核苷酸多態(tài)與妊娠率有關(guān)。在豬上，目前對(duì)于與公豬受精能力相關(guān)的遺傳因素也有一些報(bào)道。Lin等人(2006）[14]對(duì)可能影響公豬受精能力相關(guān)的基因進(jìn)行檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GnRH受體（GnRHR）與MOT、PDR、ASR有明顯的正相關(guān)性，抑制素βA（INHBA）與原生質(zhì)滴和畸形率有明顯關(guān)聯(lián)，抑制素βB（INHBB與精子密度有較強(qiáng)的相關(guān)性。CD9分子在公豬的附睪中表達(dá)，對(duì)精子的發(fā)育成熟有相關(guān)作用，CD9基因的第6內(nèi)含子上存在一個(gè)SNP，其多態(tài)性與精子的畸形率、活力和原生質(zhì)滴率有明顯的相關(guān)性。雌激素在雄性動(dòng)物血液中含量很低，但是在精液中的含量卻較高，雌激素受體主要是ESR1和ESR2，其中ESR1在輸精管、附睪中大量表達(dá)，在輸精管中主要參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)和液體重吸收的過(guò)程，在附睪中主要是維持滲透壓和pH的作用。缺乏ESR1的雄性個(gè)體表現(xiàn)繁殖力嚴(yán)重受損，說(shuō)明它對(duì)雄性生殖性能有重要的影響，對(duì)公豬ESR1基因檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，ESR1基因上存在2個(gè)SNP，位于外顯子1上單核苷酸多態(tài)與精子活力和原生質(zhì)滴殘留率有關(guān)，位于內(nèi)含子1上非編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)則與受胎率有關(guān)。目前在公豬上對(duì)于與受精能力相關(guān)的SNP的研究還較少，也不夠深入。現(xiàn)在的大規(guī)模測(cè)序技術(shù)，需要檢測(cè)群體足夠大，并且檢測(cè)費(fèi)用較多，這些可能是限制其更深入研究的因素。

遺傳信息作為受精能力標(biāo)記是一個(gè)比較有前景的方法，目前的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)于大規(guī)模的SNP檢測(cè)有很大幫助，可能會(huì)促進(jìn)公豬受精能力相關(guān)SNP的研究。但是這就需要收集大量公豬的DNA和SNP基因型信息，只有這樣才能有效的確定公豬繁殖力在基因組上的標(biāo)記。

雖然這些已有的蛋白質(zhì)和基因組標(biāo)記與公豬繁殖力有相關(guān)性，但是由于其重復(fù)性和實(shí)踐運(yùn)用的限制，通過(guò)這些標(biāo)記鑒定公豬繁殖力高低還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。只有借助于結(jié)合大規(guī)模已有公豬群繁殖性能指數(shù)，獲得相關(guān)的回歸模型和簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，才能發(fā)現(xiàn)更準(zhǔn)確和更具預(yù)測(cè)性的生物標(biāo)記?？傊?，相信不久的將來(lái)，人們將會(huì)借助生物標(biāo)記，建立簡(jiǎn)單高效評(píng)定方法，可在生產(chǎn)中準(zhǔn)確評(píng)估個(gè)體公豬的受精能力的高低。

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