HPLC法同時(shí)測定食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的含量

李莎,王銀花, 葉麟，申光輝 , 張志清*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶，401120) 3(四川省內(nèi)江市隆昌縣食品藥品監(jiān)督管理局，四川 隆昌，642150)

HPLC法同時(shí)測定食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的含量

李莎1 2,王銀花1,3, 葉麟1，申光輝1, 張志清1*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶，401120) 3(四川省內(nèi)江市隆昌縣食品藥品監(jiān)督管理局，四川 隆昌，642150)

建立了同時(shí)檢測食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O兩種非食用色素HPLC方法。樣品經(jīng)V(甲醇)∶V(水)=70∶30超聲提取，經(jīng)C18小柱凈化后上樣。色譜條件采用Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=50∶50溶液,流速1.0 mL/min,檢測波長450 nm, 柱溫35℃。結(jié)果表明：酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O在進(jìn)樣濃度2.5～12.5 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Y=2×106X-1 240.1(r=0.999 9)，Y=7×106X-5 284.2(r=0.999 6)，二者檢出限分別為0.120和 0.032 mg/kg，在5類食品中的加標(biāo)回收率分別為80.33%～90.47%和80.17%～102.64%。經(jīng)方法學(xué)評價(jià)和抽樣分析，該方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為食品安全檢測中同時(shí)檢測酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O參考方法。

食品安全；酸性橙Ⅱ；堿性嫩黃O；HPLC

工業(yè)色素與食用色素有著本質(zhì)上的區(qū)別，是絕對禁止在食品中添加使用，但某些生產(chǎn)商在食品生產(chǎn)過程中為了降低成本、賦予食品穩(wěn)定而誘人的外觀色澤而違法使用非食用色素，國家衛(wèi)生部公布的首批17種食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單中就有蘇丹紅、玫瑰紅B、堿性橙Ⅱ(王金黃、塊黃)、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ、美術(shù)綠等6種工業(yè)色素[1]。酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O比其他水溶性染料更易染色且不易褪色，但是目前尚無這2種非食用色素的國家標(biāo)準(zhǔn)(推薦)分析方法，因此食品安全檢測機(jī)構(gòu)往往缺乏有效方法進(jìn)行檢測。

目前國內(nèi)外對食品中非食用色素的檢測方法主要有電離質(zhì)譜法[2]、薄層色譜掃描法[3-5]、HPLC方法[6-7]、UPLC-MS[8]質(zhì)譜聯(lián)用方法、示波極譜法[9-10]、毛細(xì)管電泳法[11]、分子印跡技術(shù)[12]、酶聯(lián)免疫法[13-14]、熒光光譜法[15]等。其中，高效液相色譜法(HPLC)應(yīng)用于食品中合成色素與非食用色素的測定最為廣泛。由于食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O檢測時(shí)往往受到其他組分的干擾,且被檢測物性質(zhì)差異較大，需要采用梯度洗脫，分段檢測波長等技術(shù)手段。本研究的目的是優(yōu)化樣品處理方式和色譜條件，建立同時(shí)快速檢測食品中酸性橙Ⅱ、堿性嫩黃O這兩類非食用色素的HPLC方法，并對市場上的部分食品樣品進(jìn)行抽檢，以確定建立的HPLC檢測方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉制品(雞爪、鹵制品)、豆制品(豆腐皮、腐竹)、榨菜、黃魚、調(diào)味品(辣椒粉，豆瓣醬，辣椒油)等，購自四川省雅安市本地市場；酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O對照品，購自上海金穗生物科技有限公司(CAS號分別為633-96-5 2465-27-2，純度≥95.0%)；甲醇、乙腈(色譜純)，PRC公司；其他試劑為分析純，成都市科龍化工試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-10A高效液相色譜儀，日本島津制作所；UV-3100紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Milli-Q型純水儀，美國Millipore公司；CP225D型電子天平，德國Sartorius公司；MICROMAX型臺式離心機(jī)，美國Thermo公司；HS6150D型超聲清洗器，恒奧科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合對照品配制

準(zhǔn)確稱取酸性橙Ⅱ、堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品各0.052 6 g，分別置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為1.0 g/L的對照儲備液。分別吸取酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O各1 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液到50 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成20 mg/L的混合對照儲備液，于-4℃避光保存，檢測時(shí)用流動相稀釋成所需濃度的混合對照溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取200 g樣品，破碎均勻，然后稱取5.00 g置于50 mL容量瓶中，加入20.0 mL(V(甲醇)∶V(水)=70∶30)提取劑，超聲提取2次，每次20 min,中間間隔5 min 冷卻，超聲結(jié)束用提取液定容至50 mL；溶液轉(zhuǎn)移至離心管中以5 000 r/min，20 ℃，離心10 min，上清液過C18小柱凈化，然后用0.45 μm濾膜過濾后上樣。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相為V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=50∶50;流速∶1.0 mL/min；檢測波長450 nm；柱溫35 ℃, 進(jìn)樣量10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性分析

分別對不同樣品提取液和相應(yīng)混合標(biāo)準(zhǔn)液，按優(yōu)化方案進(jìn)行測定，分別確定相應(yīng)的酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O與臨近峰的分離度R和拖尾因子。精確吸取10 μL一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和處理好的3種加標(biāo)樣品(腐竹、黃魚、辣椒粉)在上述優(yōu)化好的色譜條件下檢測，結(jié)果如圖1。

圖1 HPLC同時(shí)測定酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of simultaneous determination of Acid Orange II and Auramine O

表1 HPLC同時(shí)測定酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O色譜條件下的系統(tǒng)適應(yīng)性

此時(shí)堿性嫩黃O、酸性橙II的理論塔板數(shù)分別為2 808.680、4 017.508；分離度R分別為4.700、6.284，不對稱度分別為1.534、1.174(圖1，表1)。雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰分離度較好，此外實(shí)驗(yàn)中為確保樣品中的2種色素能與樣品其他成分分離，對加標(biāo)樣品也進(jìn)行的色譜分析[圖1(b)～(d)]。說明該色譜條件下能夠有效的檢測并分離出食品中違法添加的酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O。

2.2 線性關(guān)系考察

分別吸取25 mL的2種對照儲備液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即配成0.5 mg/mL的對照工作液，再分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 2種對照貯備液置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即配成2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列后等體積(10 μL)上機(jī)，根據(jù)其中一種色素的峰面積Y(mAU·min)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的線性回歸方程(表2)。酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O在2.5～12.5 μg/mL內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r均大于0.999 8。

以空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb以及校準(zhǔn)曲線的斜率b計(jì)算出酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的方法測定以3倍S/N計(jì)算檢出限，堿性嫩黃O的方法測定檢出限為0.032 mg/kg，酸性橙Ⅱ的方法測定的檢出限為0.120 mg/kg。

表2 兩種非食用色素的線性范圍，回歸方程，相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

將配制的0.1 μg/mL堿性嫩黃O和0.2μg/mL酸性橙II標(biāo)準(zhǔn)品混合液10 μL注入HPLC系統(tǒng)。按1.3.3色譜條件連續(xù)反復(fù)進(jìn)樣6次(n=6)，結(jié)果表明酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O含量RSD分別為1.10%和1.19%，均小于1.2%，說明在該色譜條件下實(shí)驗(yàn)設(shè)備具有良好的可靠性。

2.4 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取5種樣品的5.0 g空白樣品(腐竹、黃魚、榨菜、雞肉、辣椒粉)添加2種非食用色素標(biāo)準(zhǔn)混合液，標(biāo)準(zhǔn)混合液濃度依次為堿性嫩黃O為5.00、7.50、10.00 mg/kg，酸性橙Ⅱ?yàn)?.00、8.00、10.00 mg/kg，每個(gè)添加量平行3份，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3所示。

表3 不同食品中2種非食用色素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

結(jié)果表明，3份平行樣品中，2種非食用色素在5類食品樣品中的平均加標(biāo)回收率均大于80%，變幅分別為80.33%～90.47%(酸性橙Ⅱ)和80.17%～102.64%(堿性嫩黃O)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%～3.7%之間，該方法測定的結(jié)果比較準(zhǔn)確。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

抽取5類樣品添加適量混標(biāo)(腐竹、黃魚、榨菜、雞肉、辣椒粉)，分別每份取樣5次，按1.3.2方法進(jìn)行樣品處理制備樣品溶液，各進(jìn)樣10 μL測定，以酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O兩種色素的含量考察重復(fù)性，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%(表4)。證明該方法具有良好的重復(fù)性，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取0.1 μg/mL堿性嫩黃O和0.2 μg/mL酸性橙II的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定，結(jié)果如表5所示。2種色素的RSD均小于1.2%，表明該HPLC方法用于食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的檢測在8h內(nèi)測定結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定。

表5 日內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用2.3的方法對市售的豆制品(包括腐竹、豆干等)、肉制品(雞爪、真空包裝雞肉等)、鮮活類制品(黃魚、真空包裝黃魚等)、調(diào)味品(包括辣椒粉、豆瓣醬等)共40份樣品(見表6)中的非食用色素進(jìn)行了檢測。

表6 不同食品中2種非食用色素的抽檢結(jié)果

注：“-”表示:未檢出。

結(jié)果在市售的辣椒粉中檢測到酸性橙Ⅱ含量為0.56 mg/kg，在市售的小黃魚中檢測到堿性嫩黃O含量0.81 mg/kg，其余樣品中未檢測出非食用色素。分析結(jié)果表明，建立的HPLC同時(shí)測定食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O方法在20 min內(nèi)即可完成2種非食用色素的同時(shí)檢測。本方法具有快速、簡便、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。

3 討論

3.1 不同提取條件的優(yōu)化

提取溶劑的選擇對提取結(jié)果的影響至關(guān)重要。考慮各種溶劑的理化性質(zhì)以及參考文獻(xiàn)[1,5-6,8]，選擇了V(甲醇)∶V(水)=70∶30、V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=55∶45(流動相)、乙腈、無水乙醇作為超聲波提取溶劑。對比結(jié)果表明，甲醇水溶液進(jìn)行提取時(shí)回收率最高(其中腐竹中堿性嫩黃O由流動相進(jìn)行提取時(shí)最高，雞肉的堿性嫩黃O回收率由乙腈進(jìn)行提取時(shí)最高)，但是流動相和乙腈作為提取劑時(shí)所提取的雜質(zhì)也較多，而且甲醇水溶液提取時(shí)2種非食用色素的總提取率最高，因此選擇甲醇水溶液作為樣品前處理?xiàng)l件中的提取劑。利用超聲波的空化效應(yīng)輔助可為加快提取速度，實(shí)驗(yàn)表明，萃取時(shí)間在15～20 min內(nèi)能將不同類型的食品中2種非食用色素提取出來。隨著時(shí)間的增加，非食用色素提取效率有所降低，所以超聲萃取時(shí)間控制在20 min以內(nèi)，同時(shí)超聲2次提取后提取量不再增加。而超聲溫度對食品中堿性嫩黃O和酸性橙Ⅱ 2種非食用色素的提取影響并不顯著，說明2種非食用色素十分穩(wěn)定。雖然采用甲醇水溶液在提取效率上較高，但是有的食品基質(zhì)(如辣椒粉)中其他組分的干擾依然比較多,因此本方法將提取液上樣于SPE固相萃取小柱，效果十分明顯，有效去除了干擾雜質(zhì)。此法利用SPE小柱中填料對提取液中成分的選擇性吸附或分配，并伴有分子篩效應(yīng)，能夠很好的凈化和富集復(fù)雜樣品，類似于進(jìn)行了一次色譜分析，故在食品樣品預(yù)處理中得到了廣泛應(yīng)用[7-8]。

3.2 最佳吸收波長的選擇

對于2種非食用色素而言，其在對照品溶液中的最大吸收波長是不一樣的，紫外可見分光光度計(jì)對其對照品溶液和混合對照溶液進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)，堿性嫩黃O在430 nm處吸光值最高，酸性橙Ⅱ在480 nm時(shí)吸光度值最高，混合對照溶液在430 nm處達(dá)到最高。由于在色譜分析中的最佳吸收波長還受到流動相極性及pH等影響，可能發(fā)生紅移或藍(lán)移，因此在確定了最佳流動相后，再次在甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液為溶劑下調(diào)節(jié)檢測波長(435、440、445、450、455、460、465 nm)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨著波長的增加，堿性嫩黃O和酸性橙Ⅱ的總峰面積不斷減少，但是酸性橙Ⅱ的峰面積不斷增加，考慮到酸性橙Ⅱ的響應(yīng)值較低，因此在滿足2種非食用色素總峰面積最大的同時(shí)，也應(yīng)盡量滿足酸性橙Ⅱ的峰面積較大。堿性嫩黃O在450 nm之后，峰面積減少幅度較大，總峰面積減少幅度也較大，綜合考慮2種非食用色素的總峰面積以及單色素的峰面積，最終確認(rèn)檢測波長為450 nm[16]。

3.3 流動相的選擇

對比V(甲醇)∶V(20 mmol/L乙酸銨)=(75∶25,70∶30,65∶35,60∶40,50∶50)，V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=(75∶25,70∶30,65∶35,60∶40,55∶45,50∶50)，V(乙腈)∶V(10 mmol/L乙酸銨)=(75∶25,70∶30,65∶35,60∶40,55∶45)3種流動相不同比例進(jìn)行洗脫發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用甲醇-20 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時(shí)，調(diào)節(jié)流動相比例，酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O無法有效分離。在混合對照品進(jìn)行分析時(shí)，在保留時(shí)間6.765 min左右始終有一雜質(zhì)色譜峰出現(xiàn)，無法消除，可能與選用的對照品純度僅95%有關(guān)。當(dāng)選用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時(shí)，堿性嫩黃O對照品溶液中的雜質(zhì)還會形成多個(gè)色譜峰，雜質(zhì)峰與堿性嫩黃O的峰分離難度增加，而且在此流動相條件下，酸性橙Ⅱtm提前難以分離；當(dāng)選用甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時(shí)，發(fā)現(xiàn)其體積比為50∶50時(shí)，對照品雜質(zhì)峰與酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O可以有效分離，而體積比比為55∶45時(shí)，酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O出峰時(shí)間相對較早，易導(dǎo)致樣品雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰的重疊，因此選用流動相為V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=50∶50，在此條件下，峰型正常，無拖尾現(xiàn)象，且能與其他組分分離，理論塔板數(shù)和分離度均符合要求[16]。雖然梯度洗脫可以很好的解決多種組分分離的問題，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多次優(yōu)化仍然可以采用等度洗脫達(dá)到相同的效果，也提供了新的選擇。

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HPLC simultaneous determination of acid orange Ⅱ and auramine O in foods

LI Sha1，2,WANG Yin-hua1,3,YE Lin1,SHEN Guang-hui1,ZHANG Zhi-qing1*

1(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014，China) 2(Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401120,China) 3(Sichuan Longchang Food and Drug Administration, Longchang 642150,China)

A method of HPLC simultaneous determination of acid orange Ⅱ and auramine O in foods was established and optimized. The samples were ultrasonic extracted with solution of methanol: water (70∶30), and cleaned by C18SPE column. The chromatographic conditions was Kromasil C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm), mobile phase methanol-50mmol/L ammonium acetate (50∶50).The flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was 450 nm, column temperature 35 ℃. The results showed the acid orange Ⅱand auramine O has a good linear relationship in the of 2.5-12.5 μg/mL, and the linear equations wasY=2×106X-1 240.1(r=0.999 9)andY=7×106X-5 284.2(r=0.999 6), with the limit of detection of 0.120 mg/kg and 0.032 mg/kg, respectively. The sample recoveries of five type food were 80.33%-90.47% and 80.17%-102.64%, respectively. Through the methodology evaluation and samples test. The method is simple and accurate with a good reproducibility. It can be used for simultaneous determination of acid orange Ⅱ and auramine O in foods.

food safety; acid orange Ⅱ; auramine O; HPLC

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703041

碩士研究生(張志清教授為通訊作者,E-mail:zqzhang 721@163.com.)。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科雙支計(jì)劃(03572107)

2016-06-23，改回日期：2016-08-26