泡菜中生物轉(zhuǎn)化共軛脂肪酸的植物乳桿菌

楊波，王奧紀東，張灝，陳永泉，陳海琴，陳衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

泡菜中生物轉(zhuǎn)化共軛脂肪酸的植物乳桿菌

楊波，王奧紀東，張灝，陳永泉，陳海琴*，陳衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

共軛脂肪酸是指一類含共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸的總稱，包括共軛亞油酸(conjugated linoleic acid ,CLA)，共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid,CLNA)和共軛十八碳四烯酸(conjugated stearidonic acid ,CSA)。CLA和CLNA分別是由亞油酸和亞麻酸衍生所得的多種位置與幾何異構(gòu)體的總稱，具有多種生理功能，如抗癌、抗動脈粥樣硬化、提高機體免疫力和減肥等，已成為功能性脂質(zhì)的研究熱點。采用GC-MS(gas chromatography-mass spectrometry)法分析了篩選自泡菜的22株植物乳桿菌轉(zhuǎn)化共軛脂肪酸的能力。結(jié)果顯示，CCFM47和CCFM232兩株菌具有極高的共軛亞油酸和共軛亞麻酸轉(zhuǎn)化能力，其中亞油酸的轉(zhuǎn)化率均超過30%，發(fā)酵液中CLA總濃度分別達到0.166 4 mg/mL和0.151 4 mg/mL，而對α-亞麻酸的轉(zhuǎn)化率高達60%，發(fā)酵液中CLNA總濃度分別達到0.196 4 mg/mL和0.172 1 mg/mL。

共軛亞油酸；共軛亞麻酸；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測；植物乳桿菌；轉(zhuǎn)化率

共軛脂肪酸因其對人體健康的有益作用，一直是功能脂質(zhì)領(lǐng)域的研究重點[1]。共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一類含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱，是亞油酸(linoleic acid，LA)的幾何和位置異構(gòu)體[2]。CLA主要存在于乳制品及反芻動物的肉中[1,3]，已被確認是一種癌癥抑制劑、抗氧化劑、膽固醇抑制劑、動脈粥樣硬化抑制劑及促生長因子。在共軛亞油酸的異構(gòu)體中，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA被公認為最具生物活性的異構(gòu)體[4-5]。共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid，CLNA)是3個共軛雙鍵的十八碳三烯酸的幾何和位置異構(gòu)體的總稱。相比于CLA，CLNA天然存在于特定的植物種籽中[1]，如桐籽油、石榴籽油、梓樹種籽油中，CLNA占到總脂肪酸含量的40%～80%[6]。一些研究表明，用α-亞麻酸或種子植物油制備的CLNA堿性異構(gòu)化混合物具有一些生理功能，包括抗腫瘤、抗炎、減肥以抗糖尿病等活性[7-8]。

由于這兩種共軛脂肪酸在人們?nèi)粘ｏ嬍持械臄z取量相對較少，因此如何利用其他來源增加共軛脂肪酸的攝取量，以滿足人類健康的要求是亟待研究的[8]。此前一些研究表明在特殊的培養(yǎng)基、脫脂乳或全脂乳中，許多雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌和鏈球菌可分別利用LA、LNA為底物產(chǎn)生CLA和CLNA。如植物乳桿菌AKU1009a可將亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的共軛脂肪酸[9]，而雙歧桿菌、乳桿菌、丙酸桿菌等也可利用亞麻酸產(chǎn)生CLNA，其中一些菌可將80%甚至90%的底物轉(zhuǎn)化為CLNA[10]。

泡菜中富含豐富的乳酸菌，特別是植物乳桿菌，本團隊先前研究結(jié)果表明一批源自泡菜的植物乳桿菌普遍具有良好的轉(zhuǎn)化共軛脂肪酸的潛力[13]。在前期建立的分析方法的基礎(chǔ)上，本研究對一批篩選自泡菜的植物乳桿菌進行了共軛脂肪酸轉(zhuǎn)化能力的評估，從而獲得高效生物轉(zhuǎn)化共軛脂肪酸的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株

所使用的菌株篩選自泡菜，由江南大學食品生物技術(shù)中心菌種庫保存(CCFM)。

1.2 主要試劑與儀器

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨(10 g)，牛肉膏(10 g)，葡萄糖(20 g)，乙酸鈉(5 g)，酵母提取物(5 g)，檸檬酸二胺(2 g)，K2HPO4(2 g)，MgSO47H2O(0.1g)，MnSO4H2O(0.05 g)，水(1 L)，pH6.5。MRS固體培養(yǎng)基：1 L MRS液體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂。

主要儀器：DG250 厭氧工作站，英國Don Whitley Scientific；GCMS-QP2010 Ultra SYSTEM氣質(zhì)聯(lián)用儀，島津；ND100-2氮吹儀，四川匯巨儀器設(shè)備有限公司；GENIUS 3漩渦振蕩混合器，IKA；ST40R型冷凍離心機，Thermo Scientific。

1.3 菌株活化與培養(yǎng)

將植物乳桿菌劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，厭氧，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種至MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧，37 ℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接活化3代。

將活化好的菌液按照2%(v/v)接種量分別接種至含LNA(0.3 mg/mL，含2% Tween-20)和含LA(0.5 mg/mL)的10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧，37 ℃培養(yǎng)72 h。

1.4 脂肪酸提取

將培養(yǎng)后的菌液移至離心管中，5 000 r/min，離心5 min；取2份3 mL發(fā)酵液至干凈離心管中。向發(fā)酵液中添加十七烷酸(C17∶0)作為內(nèi)標至終濃度為0.202 5 mg/mL，后添加2 mL異丙醇，充分振蕩30 s；再添加3 mL正己烷，充分振蕩30 s；5 000 r/min，離心3 min，吸收正己烷層至干凈提脂瓶，氮氣吹干[11]。

1.5 脂肪酸甲酯化

向氮氣吹干后的樣品加入400 μL甲醇，充分振蕩混勻，后添加適量重氮甲烷進行直接甲酯化，氮氣吹干后用1 mL正己烷回溶，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心2 min，吸取潔凈上清液800 μL至氣相瓶，待進行GC-MS檢測[12]。

靠窗一張大書案，上面很亂，堆著宣紙。硯臺里的墨還很新鮮，墨跡沿著斜放在上面的毛筆已經(jīng)延伸到了書案上，墨色從書案上的一張宣紙上浸出來一團。宣紙上是一幅未完成的女人肖像畫。夏冰用槍輕輕將畫紙攤平，畫上的女人是雪螢。

1.6 GC-MS檢測

脂肪酸甲酯采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀進行檢測[13]。島津氣相色譜儀(GC 2010 plus)，氣相柱Rtx-wax(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，質(zhì)譜儀(島津Ultra QP2010)。程序升溫條件：初始170 ℃，保持3min，以10 ℃/min的速率升溫至190 ℃，保持3 min，后以5 ℃/min升溫至220 ℃，保持1min，以2 ℃/min升溫至230 ℃，保持18 min。采用分流進樣，進樣量1 μL，分流比10∶1，氦氣為載氣。進樣器溫度和檢測器溫度均為240 ℃。離子源220 ℃，強度為70 eV。根據(jù)文獻中共軛亞油酸和共軛亞麻酸的質(zhì)譜碎片進行定性，以十七烷酸為內(nèi)標，采用內(nèi)標法對脂肪酸進行定量[11,13-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的能力分析

游離脂肪酸對細菌具有一定的毒害或抑制作用，COAKLEY等人[11]發(fā)現(xiàn)某些菌株會受亞油酸的抑制，對于短雙歧桿菌的最小抑制濃度為0.2～1.5 mg/mL。而本實驗所分析菌株在含有亞油酸的培養(yǎng)基中生長良好，并未出現(xiàn)COAKLEY等人發(fā)現(xiàn)的有些菌株受游離脂肪酸抑制而不生長的情況。

所有植物乳酸菌在含有LA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，分別對其的發(fā)酵液中的脂肪酸進行了GC-MS檢測，與空白對照相比，培養(yǎng)基中實際亞油酸的濃度為0.46 mg/mL，且本實驗中GC-MS檢測僅檢出了CLA1(c9,t11-CLA)和CLA2(t9,t11-CLA)2個峰(圖1)，其他異構(gòu)體在本實驗條件下未檢測到，故對植物乳酸菌發(fā)酵液中的c9,t11-CLA和t9,t11-CLA的含量以及轉(zhuǎn)化率進行了計算，結(jié)果見表1。若c9,t11-CLA和t9,t11-CLA兩種脂肪酸的轉(zhuǎn)化率之和超過10%，則初步認為該菌株可產(chǎn)共軛亞油酸，當轉(zhuǎn)化率達到30%及以上時可認為其是高產(chǎn)菌株[15]。

圖1 CCFM47和JXJ6-12在含有亞油酸的培養(yǎng)基中生長后發(fā)酵液脂肪酸組成Fig.1 Fatty acid profiles of the supernatant from CCFM47 and JXJ6-12 cultured in the medium with linoleic acid

生物轉(zhuǎn)化CLA的能力有較顯著的菌株差異性，同一種屬不同菌株生物轉(zhuǎn)化CLA的性狀也有較大的差異，本實驗的結(jié)果也表明了該性狀的菌株特異性。根據(jù)c9,t11-CLA和t9,t11-CLA兩種共軛亞油酸異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率之和可認定RS44-1(9.67%)、CCFM47(37.18%)、CCFM184(13.61%)、CCFM185(11.84%)和CCFM232(33.87%)具有轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的能力，而其余17株植物乳桿菌均不具備轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的能力。CCFM47、CCFM232可將30%以上的亞油酸轉(zhuǎn)化為CLA，為高產(chǎn)CLA的菌株，這2株菌所產(chǎn)異構(gòu)體c9,t11-CLA和t9,t11-CLA的比例接近1∶1。

表1 在含LA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)酵液的脂肪酸組成

注：CLA1：c9,t11-CLA；CLA2：t9,t11-CLA；N.D.：未檢出。

2.2 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的能力分析

本實驗所分析的菌株在含有游離亞麻酸的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)內(nèi)標的濃度與峰面積計算出只添加LNA的空白對照中LNA的實際濃度為0.25 mg/mL，并以此作為計算共軛亞麻酸轉(zhuǎn)化率時的底物濃度。所有菌株在含有LNA培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，分別對其發(fā)酵液中的脂肪酸進行GC-MS檢測，根據(jù)GC-MS碎片及文獻報道[8,14]得出，本實驗中乳酸菌所產(chǎn)CLNA僅有3種異構(gòu)體(圖2)，其他異構(gòu)體在本實驗條件下未檢出。對CLNA1、CLNA2、CLNA3三種脂肪酸的含量以及轉(zhuǎn)化率進行計算，結(jié)果見表2。

圖2 CCFM47和JXJ6-12在含有亞麻酸的培養(yǎng)基中生長后發(fā)酵液脂肪酸組成Fig.2 Fatty acid profiles of the supernatant from CCFM47 and JXJ6-12 cultured in the medium with linolenic acid

根據(jù)CLNA1、CLNA2、CLNA3三種共軛亞麻酸異構(gòu)體的濃度之和可發(fā)現(xiàn)總轉(zhuǎn)化率達到或超過10%僅有CCFM47、CCFM184、CCFM185、CCFM186和CCFM232五株菌，而其余所有17株菌均不具備轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的能力。

CCFM47、CCFM232這2株菌對亞麻酸的轉(zhuǎn)化率均超過了60%，分別高達77.67%和68.82%[8]，是典型的高產(chǎn)菌株。進一步分析這2株菌所產(chǎn)CLNA的異構(gòu)體可以發(fā)現(xiàn)， CLNA1和CLNA2占絕對主體，這2種異構(gòu)體濃度之和分別達到0.187 4 mg/mL和0.164 6 mg/mL，占總CLNA的96.4%和95.6%。其中CLNA1為c9,t11,c15-CLNA，CLNA2為t9,t11,c15-CLNA，而CLNA3是之前文獻中從未報道過的，系本研究中首次發(fā)現(xiàn)，但其具體共軛雙鍵位置以及雙鍵的順反結(jié)構(gòu)等待后續(xù)進一步研究確認。

綜合表1和表2可知，該批菌株轉(zhuǎn)化共軛亞油酸與轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的性狀基本一致，即可轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的植物乳桿菌同樣具有轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的能力，高產(chǎn)共軛亞油酸的菌株也是高產(chǎn)共軛亞麻酸的菌株，且共軛亞麻酸的轉(zhuǎn)化率更高，這與先前的文獻報道也基本一致[8,14]。

3 結(jié)論

在前期基礎(chǔ)上[13, 15]，本研究通過GC-MS檢測法成功從22株菌株中篩選出較高產(chǎn)共軛亞油酸和共軛亞麻酸的菌株。CCFM47、CCFM232可分別將30%以上的亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸，所得共軛亞油酸為c9,t11-CLA和t9,t11-CLA。此外，這2株菌可將60%以上的亞麻酸轉(zhuǎn)化為c9,t11,c15-CLNA和t9,t11,c15-CLNA，以及痕量的CLNA3，前2種異構(gòu)體可達總CLNA的95%以上。鑒于共軛脂肪酸對健康的益處以及益生菌對人體健康的改善調(diào)節(jié)作用，高效轉(zhuǎn)化共軛脂肪酸的益生菌具有很大的研究價值和市場潛力。

表2 在含LNA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后乳酸菌發(fā)酵液的脂肪酸組成

注：CLNA1：c9,t11,c15-CLNA；CLNA2：t9,t11,c15-CLNA；N.D.：未檢出。

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Conjugated fatty acids production byLactobacillusplantarumfrom Paocai

YANG Bo, WANG Ao-ji-dong, ZHANG Hao, CHEN Yong-quan,CHEN Hai-qin*, CHEN Wei

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122,China)

Conjugated fatty acids refers to a group of positional and geometric isomers of polyunsaturated fatty acids, including conjugated linoleic acid (CLA), conjugated linolenic acid (CLNA) and conjugated stearidonic acid (CSA). CLA and CLNA were derived from linoleic acid and linolenic acid, respectively, with a variety of healthy-associated functions, such as anti-cancer, anti-atherosclerotic, immunity improvement and anti-obese, which have become a hot research topic in functional lipids. In this paper, twenty-two ofLactobacillusplantarumisolated from Paocai were analyzed for conjugated fatty acids production via GC-MS. The results indicated that CCFM47 and CCFM232 had high conversion capability of both CLA and CLNA. Further analysis showed that the two strain convert over 30% linoleic acid to CLA, total CLA in the supernatant fluid reached 0.1664 mg/mL and 0.1514 mg/mL. Additionally, the two strains could convert over 60% of α-linolenic acid to CLNA, with total CLNA 0.1964 mg/mL and 0.1721 mg/mL in the supernatant fluid, respectively.

conjugated linoleic acid; conjugated linolenic acid; gas chromatography-mass spectrometry；Lactobacillusplantarum; conversion ratio

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703006

博士，助理研究員(陳海琴教授為通訊作者,E-mail：haiqinchen@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31571810)；江蘇省自然科學基金青年基金(BK20150141)

2016-10-20，改回日期：2016-11-03