1株Lodderomyceselongisporus酵母對濃香型白酒發(fā)酵的影響

游玲，李美華，王陟垚，梅伶俐，孫雪琴，余麗辰，王濤*

1(宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓，644000) 2(宜賓學(xué)院，固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實驗室，四川 宜賓，644000)

1株Lodderomyceselongisporus酵母對濃香型白酒發(fā)酵的影響

游玲1,2，李美華1，王陟垚1，梅伶俐1，孫雪琴1，余麗辰1，王濤1,2*

1(宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓，644000) 2(宜賓學(xué)院，固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實驗室，四川 宜賓，644000)

為探究1株Lodderomyceselongisporus酵母對濃香型白酒發(fā)酵的影響，通過強(qiáng)化接種該酵母到固態(tài)發(fā)酵糟醅中發(fā)酵50 d，分析糟醅的理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)含量以及微生物區(qū)系的變化。結(jié)果顯示，該酵母可使糟醅中還原糖含量顯著增加，氨基態(tài)氮顯著減少，乙縮醛、己酸生成量顯著增加；且該酵母菌株大幅降低糟醅中真菌群體豐富度和多樣性，強(qiáng)化接種的L.elongisporus取代原有優(yōu)勢真菌Zygosaccharomyces成為新的優(yōu)勢真菌，同時該酵母對細(xì)菌群體多樣性影響相對較小，優(yōu)勢細(xì)菌Lactobacillus屬豐度增加，Pseudomonas屬豐度減少。結(jié)果表明,強(qiáng)化接種L.elongisporus酵母菌將改變濃香型白酒風(fēng)味，且可對續(xù)糟發(fā)酵產(chǎn)生不可預(yù)知的持續(xù)影響。

Lodderomyceselongisporus；濃香型白酒；強(qiáng)化接種；影響；微生物區(qū)系

白酒釀造是原料、微生物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物相互作用的結(jié)果，酵母菌是主要的產(chǎn)酒功能菌，同時在香氣物質(zhì)形成方面也起著重要作用[1]，如產(chǎn)酯酵母有助于形成濃香型白酒的特征風(fēng)味[2]。已有研究表明，不同香型白酒的釀造酵母區(qū)系有著明顯差異[3]，但多數(shù)報道主要集中在酵母，特別是釀酒酵母在純培養(yǎng)條件下的產(chǎn)酒精、產(chǎn)酯能力研究[4-5]。近年來的研究表明，酵母與多種風(fēng)味物質(zhì)的生成關(guān)系密切[6]，不同酵母菌對白酒風(fēng)味有不同的影響[7]，并且酵母菌與細(xì)菌、真菌之間還存在廣泛的相互作用[8]。因此，在濃香型白酒釀造這種典型混菌發(fā)酵體系中，酵母群體不僅可通過自身代謝產(chǎn)物，也可通過與其他微生物的相互作用來影響濃香型白酒的產(chǎn)量及風(fēng)味，但目前仍缺乏相應(yīng)的實驗證據(jù)。

Lodderomyces酵母作為一種發(fā)酵效率較低，但對風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的非釀酒酵母，雖不能分泌麥芽糖水解酶，不能發(fā)酵麥芽糖和麥芽三糖，但能發(fā)酵部分葡萄糖、果糖以及全部的蔗糖[9-10]，在啤酒釀造中，Lodderomyces酵母產(chǎn)生的酒精僅為啤酒酵母的1/6，且酸類物質(zhì)、酯類物質(zhì)及酯類和正丙醇生成量較少，對口感沒有明顯影響[11]。在白酒釀造中該屬酵母的研究、應(yīng)用均較少，而作為宜賓濃香型白酒中四大優(yōu)勢酵母之一[12]，L.elongisporus酵母很可能與濃香型白酒風(fēng)味形成有關(guān)。

因此，本研究以濃香型白酒糟醅中分離到的1株可在YPD培養(yǎng)基中產(chǎn)酯的L.elongisporus酵母為研究對象，通過接種該菌株到混菌固態(tài)發(fā)酵糟醅中，檢測其對濃香型白酒主要風(fēng)味物質(zhì)生成的影響，以及對釀造微生物生態(tài)的影響，來探究該酵母菌株在濃香型白酒發(fā)酵過程中的作用，并評估其可能的應(yīng)用價值，為后續(xù)用于濃香型白酒生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

分離自濃香型白酒窖房的酵母菌株，編號Z8Y-91，鑒定為Lodderomyceselongisporus(現(xiàn)保存于四川省固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實驗室)。

1.2 發(fā)酵試驗

入窖糟醅取自四川宜賓某知名多糧濃香型白酒企業(yè)，黃水為取糟醅的窖池上一輪發(fā)酵黃水。

斜面菌種以YPD 培養(yǎng)基活化并擴(kuò)培后，3 000 r/min離心5 min去掉上清液，加入無菌水調(diào)整濃度為108個/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

混菌處理：在濃香型白酒釀造車間，入窖糧糟中加入體積分?jǐn)?shù)為1%的黃水混勻后，分裝入1 L的玻璃壇，每壇(0.83±0.05) kg，每個玻璃壇接種50 mL菌懸液，充分混勻后，自內(nèi)向外依次以丟糟、窖皮泥、保鮮膜、牛皮紙封口。

純菌對照：添加黃水的糟醅裝入玻璃壇后，1×105Pa滅菌30 min，冷卻至35 ℃左右接種50 mL菌懸液，其余操作同混菌處理。

空白對照：除以等體積的無菌水代替50 mL菌懸液接種未滅菌的糟醅外，其余操作同混菌處理。處理和對照均設(shè)3個重復(fù)。

1.3 總DNA提取

采用Omega細(xì)菌及真菌基因組提取試劑盒(E.Z.N.A)提取混菌發(fā)酵及空白糟醅DNA，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.4 風(fēng)味物質(zhì)以及乳酸檢測

將固液態(tài)發(fā)酵樣品加入200 mL的去離子水，蒸餾得到100 mL的蒸餾液，所有的蒸餾液均過濾備用。

采用FFAP色譜柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent USA)和LZP-930色譜柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm，鄭州普析)通過安捷倫氣相色譜(Agilent 7890A)檢測有機(jī)酸及其他主要風(fēng)味物質(zhì)[13]；采用C18柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)通過安捷倫液相色譜(Agilent 1220)檢測乳酸含量[14]。

1.5 理化指標(biāo)檢測

(1)淀粉含量：依據(jù)GB/T 5009.9—2008，采用酶水解法來測定淀粉含量[15]。

(2)還原糖含量：依據(jù)GB/T 5009.7—2008，采用斐林試劑滴定法來測定還原糖含量[15]。

(3)酸度：依據(jù)GB/T 9736—2008，采用滴定分析法來測定酸度[16]。

(4)氨基態(tài)氮：依據(jù)GB 12143.2，采用甲醛值法來測定氨基態(tài)氮含量[16]。

2 結(jié)果與分析

發(fā)酵50 d后，所有處理及對照均氣味正常，表面無肉眼可見的雜菌污染，強(qiáng)化接種Z8Y-91菌株的混菌發(fā)酵糟醅保持了與對照一致的濃香風(fēng)味，但其糟香較空白略淡，而純菌發(fā)酵的風(fēng)味與混菌發(fā)酵差別較大。以下分別討論該酵母對糟醅中碳氮源轉(zhuǎn)化、風(fēng)味物質(zhì)生成及微生物區(qū)系構(gòu)成的影響。

2.1 Z8Y-91對糟醅中的碳氮源轉(zhuǎn)化的影響

從圖1可知，接種Z8Y-91的混菌發(fā)酵糟醅淀粉、還原糖、乙醇含量高于接種該菌株的純菌發(fā)酵糟醅，可能是因為糟醅滅菌后，其中的微生物及酶活性被滅活，導(dǎo)致整個發(fā)酵體系中原有的糖化酶不再起作用，而外加的糖化酶糖化效果較差，導(dǎo)致由淀粉生成的還原糖量較少，因此產(chǎn)酒精也較少。混菌發(fā)酵糟醅中的氨基態(tài)氮略高于未添加蛋白酶的滅菌糟醅，也證實了高溫對蛋白酶的滅活作用，但總體上滅菌與否對糟醅碳、氮源轉(zhuǎn)化均沒有顯著影響。

圖1 Z8Y-91對糟醅中的碳氮源轉(zhuǎn)化的影響(乙醇的單位是mg/10L，淀粉、還原糖的單位是mg/100g，氨基態(tài)氮的單位是g/kg；a、b分別表示與空白對照、純菌發(fā)酵糟醅的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，下同。) Fig.1 Influence on the degradation of carbon and nitrogen in fermentative grains caused by Z8Y-91(The unit of ethanol is mg/10L, mg/100g for the starch and reduced sugar, and g/kg for the amino nitrogen; a, b means P<0.05 compared with the control and the pure culture respectively, and the same below)

與空白相比，接種Z8Y-91菌株的混菌發(fā)酵糟醅中淀粉、還原糖含量較高，乙醇含量、氨基態(tài)氮較低，可能是因為強(qiáng)化接種Z8Y-91后雖然使發(fā)酵體系的淀粉轉(zhuǎn)化率提高，還原糖顯著增加，但是整個發(fā)酵體系的發(fā)酵力減弱，因此產(chǎn)酒精較少?；炀l(fā)酵醩醅中的氨基態(tài)氮顯著低于空白對照，可能是因為接種Z8Y-91后蛋白酶活性降低，轉(zhuǎn)化生成較少的氨基態(tài)氮。

2.2 Z8Y-91對糟醅中風(fēng)味物質(zhì)生成的影響

2.2.1 Z8Y-91對糟醅中的醛類物質(zhì)生成的影響

從圖2可知，接種Z8Y-91菌株的滅菌糟醅中乙縮醛含量極顯著地高于混菌發(fā)酵糟醅，而混菌糟醅乙縮醛生成量又極顯著地高于空白對照，表明該酵母菌株對乙縮醛的生成有重要影響，混菌發(fā)酵糟醅中的其他微生物可顯著抑制該酵母產(chǎn)乙縮醛，而該酵母在乙醇、乙醛含量較低的糟醅中生成的乙縮醛較多，說明該酵母可促進(jìn)乙縮醛縮合。同時，該酵母菌株在混菌發(fā)酵糟醅中的乙醛生成量高于純菌發(fā)酵糟醅，可能是由于純菌糟醅乙醇含量較低，由乙醇氧化生成的乙醛也較少。

中國水利：隨著中國國際地位和影響的日益提升，水利也將面臨新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇，請問2014年國際合作與科技的重點(diǎn)是什么？

另外，該酵母菌株對異丁醛、生成糠醛的影響也與乙縮醛類似，但不顯著，但該酵母仍傾向于增加異丁醛、糠醛的生成，可能對白酒產(chǎn)生不良風(fēng)味。

圖2 Z8Y-91對糟醅中醛類物質(zhì)的影響(異丁醛的單位是mg/mL，乙醛、糠醛、乙縮醛的單位是mg/100mL；A、B分別表示與空白對照、純菌發(fā)酵糟醅的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，下同。)Fig.2 Fluctuation of aldehydes in fermentative grains caused by Z8Y-91( The unit of iso-butyl aldehyde is mg/mL, and mg/100mL for the acetaldehyde, furfural, acetal; A, B means P<0.01 compared with the control and the pure culture respectively, and the same below.)

2.2.2 Z8Y-91對糟醅中高級醇生成的影響

從表1可知，接種Z8Y-91的混菌發(fā)酵糟醅中正丁醇含量顯著高于純菌發(fā)酵醩醅，除乙醇外的總醇生成量明顯高于純菌發(fā)酵糟醅，可能是因為醩醅滅菌后整個發(fā)酵體系的發(fā)酵力降低，而酵母是影響高級醇生成的重要因素。

表1 Z8Y-91對糟醅中醇含量的影響 單位：mg/100mL

與空白相比，接種Z8Y-91的混菌發(fā)酵糟醅中除乙醇外的醇類物質(zhì)含量高于空白對照，說明Z8Y-91對混菌體系中醇類物質(zhì)生成有一定影響，雖未達(dá)到顯著水平，但多輪次發(fā)酵累積后可能會最終增加濃香型白酒的高級醇含量。并且，該菌株還可能增加甲醇的生成量，體現(xiàn)在接種該菌株的純菌及混菌發(fā)酵糟醅中的甲醇含量均高于空白糟醅，但3種發(fā)酵體系中甲醇生成量均低于國標(biāo)限量(≤ 0.6 g/L)[17]。

2.2.3 Z8Y-91對糟醅中有機(jī)酸、酯類物質(zhì)生成的影響

從表2可知，與接種酵母菌株的滅菌糟醅相比，混菌發(fā)酵糟醅的酸度基本沒有變化，但4種主要有機(jī)酸總含量及其對應(yīng)酯的總生成量均較高，原因可能是糟醅滅菌后導(dǎo)致產(chǎn)酸菌減少，酯化酶被滅活，且滅菌過程中酸、醇揮發(fā)損失也減少了酯的生成量。

表2 Z8Y-91對糟醅中有機(jī)酸和酯生成的影響 單位：mg/100mL

與空白對照相比，混菌發(fā)酵糟醅中己酸含量顯著增加，但己酸乙酯含量卻略有降低，可能是因為Z8Y-91削弱了己酸菌的酯化力?；炀l(fā)酵糟醅與空白對照酸度非常接近，但4種主要有機(jī)酸、酯總含量較低，說明Z8Y-91可在一定程度上削弱糟醅濃香風(fēng)味。

2.3.1 Z8Y-91對糟醅中真菌區(qū)系的影響

如表3所示，2個樣本高通量測序的序列覆蓋率均超過97%，能夠很好地反映菌群真實情況。接種Z8Y-91后有效序列條數(shù)增加了79.3%，但OTU數(shù)量減少了77.3%，同時香農(nóng)指數(shù)和ACE指數(shù)表明該酵母降低了糟醅中真菌的多樣性及豐富度，對種屬數(shù)量的統(tǒng)計也證實了這一點(diǎn)，接種該酵母菌株后，糟醅中的真菌屬從96個下降到54個，種從150個下降到67個。

表3 Z8Y-91對真菌區(qū)系多樣性的影響

從圖3可以看出，接種L.elongisporus菌株Z8Y-91后，該酵母豐度達(dá)97.5 %，表明該菌株對混菌發(fā)酵糟醅適應(yīng)能力較強(qiáng)，對糟醅中原有酵母種屬具有一定的生態(tài)優(yōu)勢，同時對糟醅真菌區(qū)系影響較大，表現(xiàn)在優(yōu)勢酵母Zygosaccharomyces屬大幅度減少，Chloridium、Fusarium、Lecythophora等屬的豐度也不同程度的降低。

圖3 Z8Y-91對糟醅中真菌區(qū)系構(gòu)成的影響Fig.3 Influence on fungus flora in fermentative grains caused by Z8Y-91

2.3.2 Z8Y-91對糟醅細(xì)菌區(qū)系的影響

由表4可知，2個樣本高通量測序的序列覆蓋率在90%左右，能夠較好地反映菌群真實情況。接種Z8Y-91后糟醅中有效序列條數(shù)增加了3.6%，但OTU數(shù)量減少了33%，同時細(xì)菌群體多樣性降低，細(xì)菌屬從593個減少到400個，減少了32.5%，種從520個減少到272個，減少了47.7%。

從圖4可以看出，接種L.elongisporus菌株Z8Y-91后優(yōu)勢屬Lactobacillus的豐度上升至81.77%，而Pseudomonas屬明顯減小，豐度<1%的屬(other)減少，這與表6中細(xì)菌屬的個數(shù)從593個降低到400個是一致的，說明該菌株可促進(jìn)Lactobacillus優(yōu)勢屬的生長，但會通過抑制某些非優(yōu)勢種屬細(xì)菌生長來降低群體多樣性。

表4 Z8Y-91對細(xì)菌區(qū)系多樣性的影響

圖4 Z8Y-91對糟醅中細(xì)菌區(qū)系構(gòu)成的影響Fig.4 Influence on bacteria flora in fermentative grains caused by Z8Y-91

3 結(jié)論與討論

自然混菌固態(tài)發(fā)酵的影響因素和不確定因素較多，且其發(fā)酵基質(zhì)不均勻，因此其微生物發(fā)酵機(jī)理的研究一直較為滯后，本研究通過強(qiáng)化接種1株L.elongisporus酵母到混菌發(fā)酵糟醅中，來探究該酵母菌在濃香型白酒發(fā)酵過程中可能的作用，并評價其潛在的應(yīng)用價值及應(yīng)用風(fēng)險，在本實驗條件下，可得出以下結(jié)論：

(1)強(qiáng)化接種該酵母不影響淀粉糖化，但對糟醅發(fā)酵力有一定影響，同時顯著抑制蛋白質(zhì)分解；

(2)該酵母傾向于增加乙縮醛、己酸、糠醛、異丁醛、乙縮醛、甲醇的生成，其中乙縮醛、己酸達(dá)到顯著水平；

(3)該酵母在混菌發(fā)酵糟醅中具有很好的生態(tài)優(yōu)勢，強(qiáng)化接種后可降低糟醅真菌多樣性和豐富度，對細(xì)菌多樣性也有不利影響。

綜合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，盡管該分離自濃香型白酒糟醅的酵母菌株與濃香型白酒風(fēng)味的形成有一定關(guān)聯(lián)(增加乙縮醛、己酸的生成)，但其對釀造微生物生態(tài)環(huán)境可能造成不利影響，要將其用于生產(chǎn)，尚需在多家白酒企業(yè)的多輪次生產(chǎn)中跟蹤驗證，并通過調(diào)整酵母的接種量、接種方式等優(yōu)化應(yīng)用方案，趨利避害，改善濃香型白酒風(fēng)味。

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DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703003

Influences of aLodderomyceselongisporusstrain on fermentation of strong-flavored liquor

YOU Ling1,2,LI Mei-hua1,WANG Zhi-yao1,MEI Ling-li1, SUN Xue-qin1,YU Li-chen1,WANG Tao1,2*

1(College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China) 2(Key Laboratory of Sichuan Province for the Utilization of Solid State Fermentation Resources, Yibin University, Yibin 644000, China)

In order to explore the role of aLodderomyceselongisporusyeast in the strong-flavored liquor fermentation, the strain was inoculated to fermentation grains, the fluctuation of physicochemical indexes, flavor substances and microflora in fermented grains were then analyzed after fermentation for 50d. It was found that the addition of this yeast strain significantly increased the content of reducing sugar and decreased the amino-N, and promoted the formation of acetal and hexanoic acid. Furthermore, the fungus diversity in fermentative grains considerably reduced when enhanced by the yeast strain,L.elongisporusbecame dominant strains instead ofZygosaccharomyce. Meanwhile, bacteria diversity was slightly influenced, as the dominant genus, the frequencies ofLactobacillusincreased while Pseudomonas decreased. The results indicated thatL.elongisporuscould change the flavor of Strong -flavored liquor, and might result in unpredictable sustained influences on continuous fermentation.

Lodderomyceselongisporus; strong-flavored liquor; enhancement; influences; microflora

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703002

博士，助理研究員(王濤教授為通訊作者,E-mail：289615848@qq.com)。

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實驗室項目(2015GTC001)；宜賓學(xué)院博士啟動項目(2016QD09)；大學(xué)生創(chuàng)新項目(201510641015)

2016-08-19,改回日期：2016-09-29