茵陳水提物對(duì)牛血清白蛋白誘導(dǎo)的肝損傷大鼠的保護(hù)作用研究

吳 軍，尚 瑞

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

茵陳水提物對(duì)牛血清白蛋白誘導(dǎo)的肝損傷大鼠的保護(hù)作用研究

吳 軍，尚 瑞

目的 研究茵陳水提物對(duì)牛血清白蛋白所致肝纖維化大鼠的保護(hù)作用。方法將90只SD大鼠隨機(jī)平均分為正常組、模型組、秋水仙堿組、大劑量（200 mg·kg-1）、中等劑量（100 mg·kg-1）和小劑量（50 mg·kg-1）茵陳水提物處理組。在造模成功后除對(duì)照組和模型組外，給予藥物灌胃。在末次給藥后取各組大鼠血清和肝組織，檢測(cè)血清Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、層粘連蛋白（LN）和透明質(zhì)酸酶（HA）及肝組織羥脯氨酸含量，觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果大劑量藥物處理組動(dòng)物血清ALT、AST、PC-Ⅲ、Ⅳ-C膠原、LN、HA及肝組織羥脯氨酸含量分別為（103.78±19.83）IU/L、（246.53±36.67）IU/L、（30.34±2.52）ng/ml、（29.54±2.65）ng/ml、（45.34±1.45）ng/ml、（232.51±23.66）ng/ml及（0.85±0.22）μg/mg，中劑量組分別為（124.59±24.41）IU/L、（277.23±36.45）IU/L、（34.57±2.34）ng/ml、（34.90±2.45）ng/ml、（52.13±2.34）ng/ml、（283.14±23.75）ng/ml及（0.96±0.26）μg/mg，均明顯低于模型組【分別為（161.24±26.23）IU/L、（382.45±39.45）IU/L、（41.78±3.12）ng/ml、（42.34±3.25）ng/ml、（65.14±3.81）ng/ml、（383.53±39.35）ng/ml及（1.43±0.17）μg/mg，P均＜0.05】；大和中劑量組ALB水平分別為（35.66±2.85）g/L和（35.78±2.64）g/L，均明顯高于模型組【（31.32±2.15）g/L，P均＜0.05】；大和中劑量組重度纖維化發(fā)生率均為13.3%，均明顯低于模型組的93.3%（P均＜0.05）；肝組織病理學(xué)檢查顯示，與模型組比，大和中劑量組大鼠肝細(xì)胞水腫、變性和壞死情況均顯著減輕。結(jié)論茵陳水提物具有一定的抗肝纖維化作用，值得進(jìn)行深入研究。

肝纖維化；茵陳；牛血清白蛋白；免疫性肝損傷；大鼠

保肝作用是茵陳水提物最重要的活性之一[1～6]，其對(duì)黃疸型肝炎等具有顯著的治療療效[7，8]。我們采用牛血清白蛋白（BSA）誘導(dǎo)大鼠肝損傷，觀察了茵陳水提物的抗肝纖維化作用，旨在為茵陳水提物的抗肝纖維化研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥物和試劑 AN-7型全自動(dòng)生化分析儀（美國安捷倫公司）；OP-721型和OP-752c型紫外分光光度計(jì)（常州第一分析儀器廠）；L-530型多管架自動(dòng)離心機(jī)（上海市第一儀器有限公司）；DF-9型立式壓力蒸汽滅菌器（沈陽市醫(yī)療設(shè)備廠）；JG-01型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市第一儀器有限公司）。菊科蒿屬植物茵陳購于河北省安國市安國中藥材交易中心，經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院王文教授鑒定。茵陳水提取物由中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室制備，取藥材粉末，加入10倍藥材當(dāng)量的純凈水，于100℃煮沸3次，合并各次提取液，減壓蒸餾，配制成1.2 g/ml的水提浸膏。BSA（羅氏制藥出品，由上海源聚生物科技有限公司分裝，批號(hào)：09023124）；秋水仙堿（武漢人福制藥股份有限公司，批號(hào)：2014021321）；福氏不完全佐劑和檢測(cè)肝組織羥脯氨酸試劑盒（美國Sigma公司，批號(hào)分別為98030821和98120690）；檢測(cè)Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白（LN）和透明質(zhì)酸酶（HA）所需放免試劑盒（武漢博士德有限公司，批號(hào)分別為2014120 934、2014112432、2014120133和2015010289）。

1.2 免疫性肝纖維化大鼠模型的建立 90只雄性SD大鼠，體質(zhì)量為（120±10）g，購于江蘇省疾控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院藥理學(xué)教研室飼養(yǎng)。將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組、茵陳水提物大、中和小劑量組，每組15只。采用文獻(xiàn)介紹的方法[9]，在除正常組外的大鼠，取溶有BSA的生理鹽水（9 g/L）與等量福氏不完全佐劑相互混勻，制備造模用乳懸液，取0.5 ml，給予大鼠皮下注射，第1次與第2次注射時(shí)間間隔為14 d，以后間隔7 d，共注射5次。在第5次注射后7 d，給予BSA 0.2 mg/0.5 ml尾靜脈注射，2次/w，以后給予0.4 mg/0.5 ml尾靜脈注射，2次/w，共計(jì)注射15次。造模組大鼠造模時(shí)間為35 d。在大鼠造模成功后，分別給予秋水仙堿0.1 mg·kg-1、茵陳水提取物200 mg·kg-1、100 mg·kg-1和50 mg·kg-1灌胃，1次/d，干預(yù)80 d；在正常組和模型組，則給予大鼠同等量生理鹽水灌胃。在最后一次給藥3 h后，采用乙醚麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，制備血清。采血完成后，處死大鼠并取肝組織20 mg，置于福爾馬林溶液中固定，采用HE染色，行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)文獻(xiàn)[10]，將肝組織肝纖維化程度分為5期：Ⅳ期即肝組織全小葉纖維結(jié)締組織彌漫性增生，同時(shí)伴有假小葉形成；Ⅲ期即纖維結(jié)締組織主要出現(xiàn)于大鼠肝小葉中央靜脈周圍；Ⅱ期即纖維結(jié)締組織增生情況不超過小葉面積的2/3；Ⅰ期即纖維結(jié)締組織僅存在于大鼠肝臟匯管區(qū)；0期即大鼠肝組織無纖維化。其中Ⅳ期和Ⅲ期肝纖維化病變?yōu)橹囟雀卫w維化。

1.3 檢測(cè) 采用試劑盒分別檢測(cè)肝組織羥脯氨酸含量和血清PC-Ⅲ、Ⅳ-C膠原、LN和HA水平；常規(guī)檢測(cè)血清生化指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間差異采用LSD法進(jìn)行比較，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較 與模型組比，秋水仙堿組、大、中劑量藥物組大鼠血清ALT和AST水平均顯著降低（P＜0.05），而ALB和TP水平則均有顯著升高（P＜0.05）；小劑量組大鼠上述指標(biāo)與模型組比，則無顯著性相差（P＞0.05，表1）。

2.2 各組大鼠血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的比較 與正常組比，模型組大鼠血清PC-Ⅲ、Ⅳ-C膠原、HA和LN均顯著升高；與模型組比，秋水仙堿組、大劑量和中劑量組大鼠血清上述指標(biāo)均明顯降低（P＜0.05），而小劑量組與模型組比，無顯著性相差（P＞0.05，表2）。

2.3 各組大鼠肝組織羥脯氨酸含量比較 正常組、秋水仙堿組、大劑量和中劑量茵陳水提物組大鼠肝組織羥脯氨酸含量分別為（0.73±0.15）μg/mg、（0.79±0.20）μg/mg、（0.85±0.22）μg/mg和（0.96± 0.26）μg/mg，均明顯低于模型組 [（1.43±0.17）μg/mg，P＜0.05]；小劑量茵陳水提物組大鼠肝組織羥脯氨酸含量為（1.34±0.33）μg/mg，與模型組比無顯著性相差（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 模型組和小劑量藥物組大鼠肝組織主要呈Ⅲ～Ⅳ級(jí)纖維化，且多伴肝細(xì)胞脂肪變性及灶性壞死；秋水仙堿組、大劑量和中劑量組肝組織主要呈0～Ⅱ級(jí)纖維增生，其重度纖維化發(fā)生率均顯著低于模型組（P＜0.05，表3、圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，400×）

表1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)（±s）比較

表1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 ALT（IU/L） AST（IU/L） ALB（g/L） TP（g/L）正常組 15 55.35±7.31 193.25±37.13 35.48±2.72 77.94±3.94模型組 15 161.24±26.23① 382.45±39.45① 31.32±2.15① 62.93±3.11①秋水仙堿 15 115.86±21.55② 255.67±36.31② 35.53±2.76② 70.35±3.31②大劑量組 15 103.78±19.83② 246.53±36.67② 35.66±2.85② 72.16±3.12②中劑量組 15 124.59±24.41② 277.23±36.45② 35.78±2.64② 65.78±3.13小劑量組 15 154.70±26.02 368.45±35.23 32.23±3.13 63.72±3.01

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)（±s）比較

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 PC-Ⅲ（ng/ml） Ⅳ-C膠原（ng/ml） LN（ng/ml） HA（ng/ml）正常組 15 23.34±2.45 21.80±2.56 40.95±2.22 115.45±16.12模型組 15 41.78±3.12① 42.34±3.25① 65.14±3.81① 383.53±39.35①秋水仙堿 15 32.45±2.23② 30.21±3.34② 46.67±2.67② 245.72±21.53②大劑量組 15 30.34±2.52② 29.54±2.65② 45.34±1.45② 232.51±23.66②中劑量組 15 34.57±2.34② 34.90±2.45② 52.13±2.34② 283.14±23.75②小劑量組 15 37.34±3.45 37.33±3.67 62.34±3.10 351.42±32.24

表3 各組大鼠肝組織纖維化分期（%）比較

3 討論

現(xiàn)代藥學(xué)研究證實(shí)，茵陳水提取物可有效改善膽汁的郁結(jié)，加速膽汁的正常排泄，還可能增加膽汁中膽紅素、固體物及膽酸的排出量[11～14]。此外，該藥物中香豆素等主要活性成分還可有效保護(hù)肝細(xì)胞膜，防止正常肝臟細(xì)胞壞死，改善肝臟微循環(huán)，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，同時(shí)還能夠通過葡萄糖醛酸酶的抑制活性來增強(qiáng)肝臟的解毒功能，最終起到保護(hù)肝臟的作用[15-16]。

盡管茵陳的藥理活性已研究得十分廣泛且深入，但國內(nèi)關(guān)于其治療BSA所致大鼠肝纖維化的研究卻較少[17～20]。本研究通過檢測(cè)肝纖維化大鼠血清ALB、TP、ALT和AST等肝功能指標(biāo)的變化情況來判斷大鼠的肝損傷情況。檢測(cè)PC-Ⅲ、Ⅳ-C膠原、LN和HA等肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)來判斷茵陳水提取物對(duì)于肝纖維化大鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)與模型組比，大中劑量的茵陳水提物處理大鼠血清ALB、TP、ALT和AST、PC-Ⅲ、Ⅳ-C膠原、LN、HA及肝組織羥脯氨酸水平均出現(xiàn)明顯改善（P＜0.05）。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織多呈Ⅲ～Ⅳ期纖維化，且伴肝細(xì)胞脂肪變性及灶性壞死，而大劑量和中劑量藥物組肝組織主要呈0～Ⅱ級(jí)纖維增生，其重度纖維化的發(fā)生率均顯著低于模型組。上述結(jié)果提示，茵陳水提物能夠有效改善肝纖維化大鼠的肝臟損傷，對(duì)于疾病的緩解具有重要的意義。

盡管本研究得到了較為客觀的結(jié)果，但是仍存在檢測(cè)指標(biāo)較少、具體的治療機(jī)制尚不明確等諸多問題。后續(xù)研究還需通過擴(kuò)大檢測(cè)指標(biāo)范圍，深入探討茵陳的具體作用機(jī)制。茵陳水提取物對(duì)BSA所致的大鼠肝纖維化具有較好的治療作用，值得進(jìn)行深入研究。

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（收稿：2016-08-04）

（本文編輯：陳從新）

Protective effects of YinChen water extract in rats with bovine serum albumin-induced hepatic fibrosis

Wu Jun，Shang Rui.Department of Gastroenterology，Affiliated People’sHospital，Hubei Medical College，Shiyan 442000，Hubei Province，China

ObjectiveTo study the therapeutic effect of YinChen water extracts in rats with bovine serum albumin-induced liverfibrosis.Methods 90 SD ratswere randomly divided into normalcontrol，model，colchicines，and large（200 mg·kg-1），middle（100 mg·kg-1）and low（50 mg·kg-1）dose of YinChen water extracts intervened groups.The medicine and herbal medicine were intragastricly administered after the model had been successfully established.Serum PC III，IV-C collagen，LN，HA and hepatic hydroxyproline content were detected. The liver histopathological changes were also observed.Results The levels of serum ALT，AST，PC-Ⅲ，Ⅳ-C，LN，HA and liver tissue hydroxyproline content were（103.78±19.83）IU/L，（246.53±36.67）IU/L，（30.34±2.52）ng/ml，（29.54±2.65）ng/ml，（45.34±1.45）ng/ml，（232.51±23.66）ng/ml and（0.85±0.22）μg/mg in the large dose YinChen water extracts group，and they were（124.59±24.41）IU/L，（277.23±36.45）IU/L，（34.57±2.34）ng/ml，（34.90±2.45）ng/mL，（52.13±2.34）ng/ml，（283.14±23.75）ng/ml and（0.96±0.26）μg/mg in the middle dose group，much lower than in the model group[（161.24±26.23）IU/L，（382.45±39.45）IU/L，（41.78±3.12）ng/ml，（42.34±3.25）ng/ml，（65.14±3.81）ng/ml，（383.53±39.35）ng/ml and（1.43±0.17）μg/mg，P<0.05]；serum levels of albumin in large and middle groups were（35.66±2.85）g/L and（35.78±2.64）g/L，significantly higher than in the model group[（31.32± 2.15）g/L，P<0.05]；Pathological examination showed that hepatic cells edema，degeneration and necrosis in colchicines，large and middle dose of YinChen water extract groups appeared significantly improved as compared with in the model group.Conclusion The YinChen waterextracts has a certain therapeuticeffect on liver fibrosis，and it is worth to be further studied.

Liver fibrosis；Herbal medicine；Bovine serum albumin；Immunological liver injuries；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.014

442000湖北省十堰市 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科

吳軍，男，33歲，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。主要從事消化系統(tǒng)腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：jun189356@sina.com

尚瑞，E-mail：pupuchuchun@163.com