槲皮素對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經(jīng)再生的影響

楊青麗陳彥鋒

1.漯河市中心醫(yī)院NICU，2.漯河醫(yī)學高等?？茖W?；A(chǔ)醫(yī)學部（河南漯河 462000）

槲皮素對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經(jīng)再生的影響

楊青麗1，2陳彥鋒2

1.漯河市中心醫(yī)院NICU，2.漯河醫(yī)學高等?？茖W?；A(chǔ)醫(yī)學部（河南漯河 462000）

目的探討槲皮素對缺氧缺血性腦損傷（HIBD）的神經(jīng)保護機制。方法48只7日齡新生SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、HIBD組、Que組，每組16只。HIBD組和Que組經(jīng)右頸總動脈結(jié)扎并缺氧制作HIBD模型，假手術(shù)組僅分離右頸總動脈。Que組在造模后即刻予腹腔注射槲皮素（40 mg/kg），每日1次，連續(xù)7 d；假手術(shù)組和HIBD組在同一時間點予等量生理鹽水腹腔注射。各組大鼠在末次給藥1 h后行神經(jīng)功能評分，28日齡行Morris水迷宮檢測空間學習記憶能力。水迷宮實驗結(jié)束后斷頭取腦，HE染色觀察海馬病理學改變，免疫組織化學法檢測海馬CA1區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長相關(guān)蛋白（GAP-43）表達情況。結(jié)果三組大鼠的神經(jīng)功能缺陷評分和學習記憶能力差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HIBD組神經(jīng)功能缺陷評分最高，學習記憶能力最差。病理檢查顯示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整；HIBD組海馬結(jié)構(gòu)疏松紊亂，且出現(xiàn)神經(jīng)元丟失；Que組與HIBD組比較，結(jié)構(gòu)疏松紊亂較輕，神經(jīng)元數(shù)量有所增多。三組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43陽性表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HIBD組均低于Que組和假手術(shù)組，Que組低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論槲皮素可以通過上調(diào)海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43表達，促進神經(jīng)再生，改善HIBD新生大鼠的遠期學習記憶能力，發(fā)揮腦保護作用。

缺氧缺血性腦損傷； 槲皮素； 神經(jīng)再生； 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子； 神經(jīng)生長相關(guān)蛋白

Key words:hypoxic-ischemic brain damage; Quercetin; neural regeneration; brain derived neurotrophic factor; nerve growth associated protein

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是由于圍生期缺氧、窒息導致的新生兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病，致死率和致殘率較高，幸存者常伴有后遺癥，如腦癱、癲癇、認知障礙等，嚴重影響患兒的生存質(zhì)量和身心健康，給患兒家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔[1]。目前HIE的發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床上也缺乏針對性的特效治療藥物,因此探討缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）的發(fā)病機制，有效治療HIBD是目前神經(jīng)科學家研究的熱點之一。

槲皮素（Quercetin）的分子式為C15H10O7，是一種天然的黃酮類化合物，具有清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)等藥理活性作用[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡，改善HIBD大鼠的學習記憶能力[5]。突觸可塑性是學習記憶的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)，而損傷腦區(qū)的神經(jīng)再生是重建突觸聯(lián)系的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6]，槲皮素對HIBD大鼠學習記憶能力的改善是否和神經(jīng)再生有關(guān)，目前國內(nèi)外少見報道。本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)再生相關(guān)蛋白腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神經(jīng)生長相關(guān)蛋白（growth-associated protein，GAP-43）的表達變化，探討大鼠HIBD發(fā)病機制及槲皮素對HIBD大鼠神經(jīng)再生的影響，從而為槲皮素更合理有效的應(yīng)用于臨床治療HIBD提供實驗依據(jù)和理論指導。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

健康7日齡新生SD大鼠（清潔級，母鼠帶養(yǎng)）48只，購于河南省實驗動物中心（合格證號: SCXK豫2014-0002），體質(zhì)量12～16 g，雌雄不拘，在光照—黑暗各12 h交替條件下，由母鼠自由喂養(yǎng)。隨機分為假手術(shù)組、HIBD組和Que組，每組16只。采用改良Rice法制備HIBD模型[7]。具體步驟：大鼠經(jīng)無水乙醚吸入麻醉后，75%乙醇消毒頸部，頸正中線切開皮膚，分離右側(cè)頸總動脈，絲線結(jié)扎，并離斷血管，以造成缺血損傷，縫合切口；將進行缺血手術(shù)的大鼠放回窩休息2 h后置于37℃恒溫水浴的缺氧箱（30 cm×40 cm×50 cm的密閉有機玻璃箱）中，以2 L/min速度輸入氧氮混合氣體（8% O2+ 92% N2），持續(xù)2 h，以造成缺氧損傷，取出后放回原籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠只分離頸總動脈，不進行結(jié)扎和缺氧處理。Que組在造模后即刻給予腹腔注射槲皮素（40 mg/kg），每日1次，連續(xù)7 d；假手術(shù)組和HIBD組分別在同一時間點給予等量生理鹽水腹腔注射。各組大鼠術(shù)后放回原籠，母鼠飼養(yǎng)。末次給藥1 h后各組大鼠行神經(jīng)功能缺陷評分，28日齡時各組大鼠行Morris水迷宮檢測空間學習記憶能力。水迷宮實驗結(jié)束后斷頭取腦，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察海馬病理學改變，免疫組織化學法檢測海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43的表達情況。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)功能評分 各組大鼠末次給藥1 h后，采用Bederson法進行神經(jīng)功能評分[8]，評分標準如下：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，抓大鼠鼠尾提起，大鼠不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，大鼠前肢對對側(cè)推力的抵抗能力下降；3分，大鼠出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象。

1.2.2 空間學習記憶能力檢測 于28日齡時對各組大鼠行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮水池中置放一個直徑10 cm的圓形平臺，平臺在水面以下2 cm，池中倒入適量墨汁，使水池不透明（以避免視覺干擾），水溫保持在22℃～23℃。將大鼠面向池壁放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為逃避潛伏期，歷時5 d，然后求得每只大鼠5 d的平均逃避潛伏期。第6 天去除平臺，測其120 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)，即為穿環(huán)次數(shù)。

1.2.3 腦標本制備 Morris水迷宮實驗結(jié)束后，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，0.9%生理鹽水行心臟灌流5 min，然后4%多聚甲醛灌流固定約10 min，斷頭取出腦組織，4%多聚甲醛中室溫固定至少24 h，經(jīng)酒精梯度脫水（各10 min），二甲苯透明，石蠟包埋后備用。

1.2.4 腦標本HE染色 取石蠟包埋好的腦組織，以海馬部位為標志，行冠狀面切片，切片厚度為5 μm，經(jīng)烤片、貼片，HE染色2～3 min，純乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理學變化。

1.2.5 海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43蛋白表達檢測采用免疫組織化學法。取石蠟包埋好的腦組織，以海馬部位為標志，行冠狀面切片，切片厚度為5 μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟脫水，0.01 mol PBS漂洗5 min×3次，枸櫞酸鈉抗原修復液微波加熱修復，置于0.3% H2O2中室溫避光孵育10 min，PBS漂洗同前，分別滴加一抗（兔抗大鼠BDNF多克隆抗體，1:500，Abcam公司，ab108319；兔抗大鼠GAP-43多克隆抗體，1:500，Abcam公司，ab12274），濕盒中4℃過夜，PBS漂洗同前，辣根酶標記山羊抗兔IgG（1:1 000，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，ZB2301）室溫孵育30 min，PBS漂洗同前，DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色，雙蒸水適時停止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片、鏡檢。黃色或棕黃色細胞為免疫陽性細胞，利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定積分光密度值（IOD）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

實驗前各組大鼠行為正常，呼吸規(guī)律。實驗后，假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)明顯異常行為，無死亡。缺氧5 min后，HIBD組和Que組大鼠均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安，呼吸加深加快，站立不穩(wěn)；缺氧30 min以上后，呼吸變淺變慢，活動明顯減少；1 h后出現(xiàn)嗜睡、昏迷、眼瞼下垂、反應(yīng)遲鈍等狀況。Que組注射槲皮素24 h后以上癥狀開始逐漸得到緩解，72 h后接近假手術(shù)組，于缺氧后2 h死亡1只。HIBD組72 h后以上癥狀開始緩解，1周后接近假手術(shù)組，于缺氧后6 h、1 d各死亡1只。

2.2 大鼠神經(jīng)功能缺陷評分

三組大鼠間神經(jīng)功能評分的差異有統(tǒng)計學意義（F=306.10，P＜0.01）；假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺陷，神經(jīng)功能缺陷評分由低到高依次為假手術(shù)組、Que組和HIBD組，HIBD組大鼠神經(jīng)功能缺陷最嚴重，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 （±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 （±s）

注：1)與假手術(shù)組比較，P＜0.01；2)與HIBD組比較，P＜0.01

組 別只數(shù)神經(jīng)功能評分假手術(shù)組160±0 HIBD組142.76±0.491)Que組151.48±0.241)2)F值306.10 P＜0.001

2.3 大鼠學習記憶能力

Morris水迷宮實驗顯示，三組大鼠間平均逃避潛伏期的差異有統(tǒng)計學意義（F=57.22，P＜0.001）；逃避潛伏期由短到長依次為假手術(shù)組、Que組和HIBD組，HIBD組大鼠學習能力最差，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

去除平臺后，三組大鼠間穿環(huán)次數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義（F=71.14，P＜0.001）；穿環(huán)次數(shù)由多到少依次為假手術(shù)組、Que組和HIBD組，HIBD組大鼠對原平臺的記憶能力最差，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠學習記憶能力比較 （±s）

表2 各組大鼠學習記憶能力比較 （±s）

注：1)與假手術(shù)組比較，P＜0.01；2)與HIBD組比較，P＜0.01

組 別只數(shù)逃避潛伏期/s穿環(huán)次數(shù)假手術(shù)組1646.35±6.2715.48±3.71 HIBD組1475.44±8.581)2)4.36±1.251)Que組1558.03±7.491)2)8.14±2.061)2)F值57.2271.14 P＜0.001＜0.001

2.4 各組大鼠海馬病理學改變

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊緊密；HIBD組海馬結(jié)構(gòu)疏松紊亂，且出現(xiàn)神經(jīng)元丟失；Que組與HIBD組比較，結(jié)構(gòu)疏松紊亂較輕，神經(jīng)元數(shù)量有所增多。見圖1。

2.5 海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43蛋白表達

海馬CA1區(qū)BDNF陽性細胞呈棕黃色表達，各組大鼠腦組織中均可見BDNF陽性細胞。三組間差異有統(tǒng)計學意義（F=143.20，P＜0.001）；組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，Que組BDNF陽性表達較HIBD組顯著增高，但仍低于假手術(shù)組；HIBD組顯著低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

海馬CA1區(qū)GAP-43陽性細胞呈棕黃色表達，各組大鼠腦組織中均可見GAP-43陽性細胞。三組間差異有統(tǒng)計學意義（F=127.10，P＜0.001）；Que組GAP-43陽性表達較HIBD組顯著增高，但仍低于假手術(shù)組；HIBD組顯著低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43免疫組化圖像（×400）

表3 各組海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43陽性表達比較 （±s）

表3 各組海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43陽性表達比較 （±s）

注：1)與假手術(shù)組比較，P＜0.01；2)與HIBD組比較，P＜0.01

F值143.20127.10 P＜0.001＜0.001

3 討論

學習記憶障礙是HIE幸存患兒常有的后遺癥，海馬區(qū)尤其是海馬CA1區(qū)是學習記憶儲存和啟動的關(guān)鍵腦區(qū)，而缺氧、缺血最易造成海馬結(jié)構(gòu)損傷，導致海馬神經(jīng)元變形或丟失[9]。因此海馬區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生病理學改變是驗證HIBD的標志性指標。本研究采用國際上比較認可的改良Rice法建立新生大鼠HIBD模型，通過Bederson法評估大鼠的神經(jīng)功能缺陷，經(jīng)典的Morris水迷宮實驗檢測大鼠的學習記憶能力，HE染色觀察海馬CA1區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，造模后大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺陷，學習記憶能力明顯下降，海馬CA1區(qū)發(fā)生了明顯的病理學改變，與以往報道一致[10]，提示HIBD大鼠造模成功。給予槲皮素處理后，大鼠癥狀有所改善，提示槲皮素對HIBD大鼠具有一定的神經(jīng)保護作用。

神經(jīng)再生是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸重建的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間接觸的部位，承擔信息傳遞作用，易受其他因素的影響而發(fā)生可塑性變化[11]。突觸可塑性是指突觸在形態(tài)和功能上發(fā)生改變的特性，是學習記憶的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)。因而缺氧缺血造成腦損傷區(qū)域的神經(jīng)再生是改善認知障礙的關(guān)鍵靶點。為進一步明確槲皮素對HIBD大鼠的神經(jīng)保護作用機制，本研究通過免疫組織化學方法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)再生相關(guān)蛋白BDNF和GAP-43的表達水平。

BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是海馬、大腦皮層等與認知密切相關(guān)的腦區(qū)，能夠營養(yǎng)神經(jīng)元，促進神經(jīng)元的分化、增殖和成熟，通過與其特異性受體酪氨酸激酶B（TrkB）結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)突觸發(fā)生、維護突觸功能等神經(jīng)可塑性功能，是神經(jīng)元再生的重要指標[12]。研究表明，在腦缺血損傷后，腦組織內(nèi)的BDNF表達水平下降，而在給予神經(jīng)保護劑（一些具有神經(jīng)保護的藥物）干預(yù)后可以逆轉(zhuǎn)BDNF表達的下降，改善腦損傷癥狀[13,14]。

神經(jīng)生長相關(guān)蛋白（GAP-43）是與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)再生、突觸重建關(guān)系密切的一種突觸前膜蛋白[15]。腦組織輕度損傷時，GAP-43水平升高，促進損傷部位神經(jīng)元的生長發(fā)育，引導軸突生長，調(diào)節(jié)軸突之間形成新的突觸聯(lián)系，起到修復損傷腦組織的作用。當損傷時間延長或者損傷超過一定程度后，GAP-43水平下降，對腦組織的代償功能喪失[16]。研究表明，能夠改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷的中草藥大多能夠促進腦組織GAP-43的表達，進而促進神經(jīng)再生，起到神經(jīng)保護劑作用[17,18]。因此GAP-43通常被作為神經(jīng)再生和突觸重塑的標志性蛋白。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血后大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43表達明顯下降，而給予槲皮素處理后，兩者表達均明顯增加。提示槲皮素可能通過上調(diào)海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43表達，促進神經(jīng)再生，增加突觸聯(lián)系，進而改善HIBD大鼠的認知障礙。

綜上所述，槲皮素對缺氧缺血性腦損傷大鼠具有神經(jīng)保護作用，其機制不僅與抑制細胞凋亡有關(guān)，還可能與上調(diào)海馬CA1區(qū)BDNF和GAP-43表達，促進神經(jīng)再生有關(guān)。本研究為新生兒缺氧缺血性腦損傷后的治療提供了一定的實驗依據(jù)和臨床治療參考。

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Effects of Quercetin on nerve regeneration in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage

YANG Qingli1,2, CHEN Yanfeng2
(1. NICU, Luohe Central Hospital，2. Department of Basic Medical Sciences, Luohe Medical College, Luohe 462000, Henan, China)

ObjectiveTo explore the protective effects of Quercetin on hypoxic ischemic brain damage (HIBD).MethodsForty-eight 7-day-old SD rats were randomly divided into sham-operation group, HIBD group and Que treatment group, 16 rats each. HIBD group and Que treatment group were treated by ligation of right common carotid artery to make anoxia and build HIBD model; sham-operation group had the separation of the right common carotid artery only. Que treatment group were injected intraperitoneally with quercetin (40 mg/kg) once a day for 7 days immediately after modeling while sham-operation group and HIBD group received equivalent normal saline at the same time. The rats in each group were scored of neurological function at 1 h after the last administration, and the ability of spatial learning-memory was tested by Morris water maze at the age of 28 days. After performing the test above, all rats were decapitated and the brains were taken. Pathological changes of hippocampus were observed by HE staining; the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and nerve growth associated protein (GAP-43) in hippocampus CA1 area were detected by immunohistochemistry.ResultsThere were significant differences in neurological deficit score and learning-memory ability among the three groups (P＜0.01), and neurological deficit score was the highest and the learning-memory ability was the lowest in HIBD group. Pathological examination showed that the structure of hippocampal neurons was intact in sham-operation group. It was loose and disorder, and even loss of neurons in HIBD group. Compared with the HIBD group, the loose in the structure of hippocampal was lighter, and the number of neurons was increased in the Que treatment group. There was statistical difference in the positive expression of BDNF and GAP-43 in the hippocampal CA1 area among the three groups (P＜0.01), with those in HIBD group being lower than in Que treatment group and sham-operation group and those in treatment group being lower than in sham-operation group (P＜0.01).ConclusionsQuercetin can enhance the expression of BDNF and GAP-43 in hippocampal CA1 region, promote nerve regeneration, improve the longterm learning-memory ability of HIBD neonatal rats, and protect the brain.

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.03.016

2016-10-08)

(本文編輯：蔡虹蔚)

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