可可種質(zhì)抗黑果病離體鑒定方法研究

桑利偉++高圣風(fēng)++劉愛(ài)勤++孟倩倩++孫世偉++王政++茍亞峰

摘 要 利用可可離體葉片和離體果實(shí)鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的方法。結(jié)果表明：接種方法、接種物濃度、葉齡或果齡等因素影響離體葉片、果實(shí)黑果病發(fā)生程度；離體葉片接種鑒定方法最適條件是采用針刺法接種、接種物濃度3 × 107 個(gè)/mL、葉齡50～60 d；離體果實(shí)接種鑒定方法最適條件為采用滴接法、接種物濃度為3×105 個(gè)/mL、果齡2～3個(gè)月。采用離體葉片接種和離體果實(shí)接種方法均能鑒定出可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的差異，鑒定結(jié)果與田間成株期的抗病性表現(xiàn)基本一致。

關(guān)鍵詞 可可 ；黑果病 ；離體抗病性鑒定

中圖分類號(hào) S435.71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.011

In vitro Identification of Cacao Germplasm with Black Pod Resistance

SANG Liwei GAO Shengfeng LIU Aiqin

MENG Qianqian SUN Shiwei WANG Zheng GOU Yafeng

（Spice and Beverage Crops Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533）

Abstract The detached leaves and pods of cacao were used as materials to identify resistance of black pod disease in vitro from cacao germplasm resources. The results showed that the infection severity of black pod disease in the leaves and pods were influenced by the factors like inoculating methods， inoculum concentrations， and leaf and pod age. The optimum conditions for disease resistance identification through detached leaf inoculation were puncture inoculation， inoculum concentration 3×107 units/mL and leaf age 50～60 days. The optimum conditions for disease resistance identification through detached pod inoculation were dripping inoculation， inoculum concentration 3×105 units/mL and pod age 2～3 months. The difference of cacao germplasm in resistance to black pod disease were identified by both the detached leaf and pod inoculations， and the identification results were basically consistent with the field performance of the mature cacao in resistance to black pod disease.

Keywords Cacao ； black pod disease ； In vitro identification of disease resistance

可可（Theobroma cacao L.）是世界三大飲料之一，用于制作巧克力和高級(jí)飲料等，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015年，中國(guó)可可豆需求量約16萬(wàn)t，幾乎全部依賴進(jìn)口。海南省東南部適宜可可種植[1]，目前，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（簡(jiǎn)稱“香飲所”）已在海南省萬(wàn)寧、瓊海、保亭、陵水、三亞、東方等市縣推廣種植可可66.7 hm2。黑果病是為害可可的首要病害，廣泛分布于世界各可可種植區(qū)，導(dǎo)致每年全世界可可產(chǎn)量減少約30%，部分為害嚴(yán)重地區(qū)減產(chǎn)達(dá)90%[2]，選育和推廣抗病品種是防控該病的有效措施。香飲所可可種質(zhì)圃已收集可可種質(zhì)資源90份，經(jīng)田間自然發(fā)病鑒定，不同可可種質(zhì)間對(duì)黑果病抗性存在差異。國(guó)外有關(guān)于采用離體葉片接種[3]和離體果實(shí)接種[4]方法鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的報(bào)道，而國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。研究利用可可離體葉片和離體果實(shí)鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的方法，明確了2種鑒定方法的最適條件，為抗病育種中的親本選擇提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

誘發(fā)黑果病的柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora R. et E. Smith）[5]，由香飲所在萬(wàn)寧興隆可可種植園分離獲得。

1.1.2 供試品種

選擇連續(xù)3年田間自然發(fā)病鑒定、抗黑果病表現(xiàn)穩(wěn)定的品種：ZYP2-7（抗病品種）、ZYP3-6（感病品種）、ZYP5-20（高感品種），均由香飲所可可種質(zhì)圃提供。

1.2 方法

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理10片葉或10個(gè)果，用 0.5%的KMnO4溶液進(jìn)行表面消毒15 min，無(wú)菌水沖洗干凈，3次重復(fù)[6]。

1.2.1 離體葉片接種鑒定

（1）接種方法。選取葉齡50～60 d的葉片，采用血球計(jì)數(shù)法[7]配制的3 × 107 個(gè)/mL游動(dòng)孢子懸浮液進(jìn)行接種，接種方法為離體葉片滴接法和離體葉片針刺法。離體葉片滴接法：將洗好的葉片放入經(jīng)滅菌且?guī)V紙的托盤內(nèi)，濾紙用無(wú)菌水保濕；吸取孢子懸浮液0.2 mL滴接于葉片表面中心，以滴接無(wú)菌水為對(duì)照。離體葉片針刺法：葉片處理同上，用一束針捆在一起，沾取孢子懸浮液刺于葉片中心，每刺一片葉沾一次菌液，以無(wú)菌水為對(duì)照；覆膜保濕并置于26℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日早晨在濾紙上滴加無(wú)菌水；接種7 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病級(jí)別，計(jì)算病情指數(shù)，進(jìn)行抗病性劃分。

可可黑果病葉片病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，葉片表面沒(méi)有病斑；1級(jí)，葉片表面病斑面積占葉片總面積的1%以下；2級(jí)，葉片表面病斑面積占葉片總面積的1%～10%；3級(jí)，葉片表面病斑面積占葉片總面積的11%～20%；4級(jí)，葉片表面病斑面積占葉片總面積的21%～50%；5級(jí)，葉片表面病斑面積占葉片總面積的 50%以上。

病情指數(shù)計(jì)算公式：

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高一級(jí)代表值）×100。

抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)：免疫，病情指數(shù)為0；高抗，病情指數(shù)在10以下；抗病，病情指數(shù)在11～30；感病，病情指數(shù)在31～50；高感，病情指數(shù)在 51 以上。

（2）接種物濃度的影響試驗(yàn)。將配制好的3個(gè)不同濃度梯度（即3 × 105 、3 × 107 和3 × 109 個(gè)/mL）的游動(dòng)孢子懸浮液，采用離體葉片針刺法接種在葉齡50～60 d的葉片上，以無(wú)菌水為對(duì)照；接種7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，方法同1.2.1-（1），確定最適接種物濃度。

（3）接種葉齡的影響試驗(yàn)。在3個(gè)不同葉齡（即20～30、50～60和80 d以上）的葉片上，采用離體葉片針刺法接種濃度為3 × 107個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液，以無(wú)菌水為對(duì)照；接種7 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，方法同1.2.1-（1），確定最適接種葉齡。

1.2.2 離體果實(shí)接種鑒定

（1）接種方法。選取果齡2～3個(gè)月的可可果，以3×105個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液為接種物，接種方法為離體果實(shí)滴接法和離體果實(shí)針刺法，具體步驟同1.2.1-（1）。

可可黑果病果實(shí)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，果實(shí)表面沒(méi)有病斑；1級(jí)，果實(shí)表面病斑面積占果實(shí)總面積的1%以下；2級(jí)，果實(shí)表面病斑面積占果實(shí)總面積的1%～10%；3級(jí)，果實(shí)表面病斑面積占果實(shí)總面積的11%～20%；4級(jí)，果實(shí)表面病斑面積占果實(shí)總面積的21%～50%；5級(jí)，果實(shí)表面病斑面積占果實(shí)總面積的50%以上。

病情指數(shù)計(jì)算公式：

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病果數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總果數(shù)×最高一級(jí)代表值）×100。

抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)：免疫，病情指數(shù)為0；高抗：病情指數(shù)在10以下；抗病，病情指數(shù)在11～30；感?。翰∏橹笖?shù)在31～50；高感，病情指數(shù)在51以上。

（2）接種物濃度的影響試驗(yàn)。將游動(dòng)孢子懸浮液配成3×103、3×105和3×107個(gè)/mL等3個(gè)不同濃度梯度，采用離體果實(shí)滴接法接種在果齡2～3個(gè)月的可可果上，以無(wú)菌水為對(duì)照；接種7 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，方法同1.2.2-（1），確定最適接種濃度。

（3）接種果齡的影響試驗(yàn)。果齡設(shè)1個(gè)月以內(nèi)、2～3個(gè)月和4～5個(gè)月等3個(gè)處理，每個(gè)處理采用離體果實(shí)滴接法，接種濃度為3 × 105個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液，以無(wú)菌水為對(duì)照；接種7 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，方法同1.2.2-（1），確定最適接種果齡。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體葉片接種鑒定

2.1.1 最適接種方法

由表1可知，采用離體葉片滴接法，各供試品種發(fā)病普遍較輕，病情指數(shù)雖依次增大，但差異小，無(wú)法區(qū)分抗性類別；采用離體葉片針刺法，各供試品種的病情指數(shù)差異明顯，抗性表現(xiàn)與田間自然發(fā)病鑒定結(jié)果一致。因此，針刺法是離體葉片鑒定的最適接種方法。

2.1.2 最適接種物濃度

表2結(jié)果表明，3種接種物濃度對(duì)供試品種發(fā)病情況影響不同，接種物濃度與病情指數(shù)呈正相關(guān)，接種物濃度越大，發(fā)病程度越嚴(yán)重。當(dāng)接種物濃度為3×105個(gè)/mL時(shí)，各供試品種發(fā)病較輕，高感品種和感病品種差異不明顯，不能準(zhǔn)確區(qū)分；當(dāng)接種物濃度為3×107個(gè)/mL時(shí)，各供試品種間病情指數(shù)差異明顯，能將抗病、感病和高感很好地區(qū)分，并且同田間自然發(fā)病鑒定結(jié)果一致；當(dāng)接種物濃度為3×109個(gè)/mL時(shí)，各供試品種發(fā)病普遍嚴(yán)重，抗病品種和感病品種不能很好地區(qū)分，無(wú)法真實(shí)反映供試品種的抗性類別。因此，最適的接種物濃度為3×107個(gè)/mL。

2.1.3 最適接種葉齡

不同葉齡對(duì)各供試品種發(fā)病情況影響不同。由表3可知，當(dāng)葉齡為20～30 d時(shí)，各供試品種發(fā)病程度較高，雖然可以區(qū)分供試品種的抗性類別，但是感病品種和高感品種的病情指數(shù)差異小，區(qū)分度不高；當(dāng)葉齡為50～60 d時(shí)，各供試品種病情指數(shù)差異顯著，可以將供試品種明確地歸類為抗病、感病和高感3類，并與田間自然發(fā)病鑒定結(jié)果一致；當(dāng)葉齡為80 d以上時(shí)，各供試品種發(fā)病程度較輕，抗病品種和感病品種病情指數(shù)差異不明顯，無(wú)法顯著區(qū)分，不能真實(shí)反映供試品種抗病情況。因此，采用離體葉片接種法的最適葉齡為50～60 d。

綜上所述，采用離體葉片接種方法鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的最適條件是接種方法采用針刺法接種、接種物濃度為3 × 107 個(gè)/mL、葉齡50～60 d。

2.2 離體果實(shí)接種鑒定

2.2.1 最適接種方法

由表4可知，采用離體果實(shí)滴接法時(shí)，各供試品種間病情指數(shù)差異明顯，抗病、感病和高感品種可以被明顯區(qū)分，且與田間抗性表現(xiàn)一致；采用離體果實(shí)針刺法時(shí)，各供試品種病情發(fā)生嚴(yán)重，經(jīng)田間自然發(fā)病鑒定表現(xiàn)穩(wěn)定的抗性品種被歸類為感病品種，不能準(zhǔn)確體現(xiàn)供試品種的抗病特性。因此，最適接種方法為離體果實(shí)滴接法。

2.2.2 最適接種物濃度

各供試品種發(fā)病程度隨接種物濃度增加而越來(lái)越嚴(yán)重（表5）。當(dāng)接種物濃度為3×103個(gè)/mL時(shí)，供試品種發(fā)病程度較輕，病情指數(shù)差異不明顯，抗病品種和感病品種不能被明確區(qū)分；當(dāng)接種物濃度為3×105個(gè)/mL時(shí)，各供試品種的病情指數(shù)差異明顯，抗病、感病和高感品種病情區(qū)分度高，適宜品種抗性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果與田間自然發(fā)病鑒定結(jié)果一致；當(dāng)接種物濃度為3×107個(gè)/mL時(shí)，各供試品種發(fā)病情況嚴(yán)重，病情指數(shù)普遍較高，不能真實(shí)反映供試品種抗病特性，與田間自然發(fā)病鑒定結(jié)果不一致?？梢?jiàn)，最適接種物濃度為3×105個(gè)/mL。

2.2.3 最適接種果齡

表6結(jié)果表明，當(dāng)果齡為1個(gè)月以內(nèi)時(shí)，各供試品種發(fā)病情況嚴(yán)重，病情指數(shù)普遍偏高，不能客觀反映供試品種抗病性，在田間表現(xiàn)穩(wěn)定的抗病品種會(huì)出現(xiàn)感病品種的發(fā)病癥狀；當(dāng)果齡為2～3個(gè)月時(shí)，各供試品種病情指數(shù)差異顯著，供試品種被歸類為不同的抗性類別，并且與其田間抗病性表現(xiàn)一致，適宜用于抗性鑒定；當(dāng)果齡為4～5個(gè)月時(shí)，各供試品種發(fā)病程度較輕，病情指數(shù)偏小，感病品種和高感品種抗病性區(qū)分度不高，會(huì)出現(xiàn)與田間自然發(fā)病鑒定結(jié)果不一致情況。因此，最適接種果齡為2～3個(gè)月。

綜上所述，采用離體果實(shí)接種法鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的最適條件是接種方法采用滴接法、接種物濃度為3×105個(gè)/mL、果齡為2～3個(gè)月。

3 討論與結(jié)論

對(duì)于離體葉片接種法，采用滴接法接種，各可可品種發(fā)病程度較輕，對(duì)于田間表現(xiàn)為感病的品種可能被歸類為抗病品種；采用針刺法接種，抗病、感病和高感品種間區(qū)分度高，鑒定結(jié)果與田間抗病性表現(xiàn)一致。接種物濃度會(huì)影響葉片的發(fā)病程度和保綠時(shí)間，接種量過(guò)少，葉片發(fā)病程度普遍偏輕；接種量過(guò)大，葉片發(fā)病程度偏嚴(yán)重，保綠時(shí)間短，都不能真實(shí)反映品種抗病性，適宜的接種物濃度為3×107個(gè)/mL。幼嫩葉片保綠時(shí)間短，老化葉片品種抗病性普遍偏弱，均不適宜抗病性鑒定，最適葉齡為50～60 d。采用離體葉片接種方法鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的最適條件是采用針刺法接種、接種物濃度為3×107個(gè)/mL、葉齡為50～60 d。對(duì)于離體果實(shí)接種法，采用針刺法時(shí)，各品種病情發(fā)生偏嚴(yán)重，適宜的接種方法是滴接法。接種物濃度對(duì)果實(shí)發(fā)病程度有明顯影響，接種量過(guò)少或過(guò)大均不能真實(shí)反映品種抗病性，適宜的接種物濃度為3×105個(gè)/mL。幼果保存時(shí)間短，接種后病情偏嚴(yán)重；老齡果，品種發(fā)病程度偏輕，最適接種果齡為2～3個(gè)月。采用離體果實(shí)接種法鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的最適條件為采用滴接法接種、接種物濃度為3×105個(gè)/mL、果齡為2～3個(gè)月。

關(guān)于可可種質(zhì)抗黑果病鑒定方法的研究在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)外學(xué)者將離體葉片接種法作為可可抗黑果病早期鑒定的方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，以選取未木質(zhì)化的枝條上或葉齡在50～60 d的葉片為宜，一般苗圃里可可苗的葉片比田間生長(zhǎng)植株上的葉片鑒定效果更好，接種游動(dòng)孢子濃度為3×105 個(gè)/mL的病原菌，5～7 d后觀察結(jié)果，該方法能快速準(zhǔn)確地反映不同可可種質(zhì)對(duì)黑果病的抗性[3，8]。 也有專家采用離體果實(shí)接種法進(jìn)行了可可種質(zhì)抗黑果病鑒定[4]，其鑒定結(jié)果與連續(xù)3年以上的田間觀察數(shù)據(jù)具有顯著的相關(guān)性，該方法有助于實(shí)現(xiàn)抗黑果病可可種質(zhì)的早期快速篩選?？煽蓪?duì)黑果病的抗性能夠穩(wěn)定地遺傳給后代[9-10]。葉片接種是早期可可抗黑果病鑒定的最合適方法，按照標(biāo)準(zhǔn)化的方式，在最適條件下，該方法可解釋可可種質(zhì)抗黑果病遺傳變異的75%～90%[11-12]。

本研究結(jié)果表明，采用離體葉片接種方法鑒定可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的最適接種物濃度是3×107個(gè)/mL，而采用離體果實(shí)接種方法的最適接種物濃度是3×105個(gè)/mL，同Nyassé等[3]和Iwaro等[4]研究結(jié)果不同，原因可能是病原菌致病性不同。綜上所述，采用離體葉片接種法和離體果實(shí)接種法均能鑒定出不同可可種質(zhì)對(duì)黑果病抗性的差異，鑒定結(jié)果與田間抗病性表現(xiàn)基本一致。但是不同接種方法、接種物濃度和接種葉齡對(duì)鑒定結(jié)果有影響。為提高可可種質(zhì)抗黑果病鑒定的準(zhǔn)確性，應(yīng)采取離體鑒定與田間自然發(fā)病鑒定相結(jié)合的方法。

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