恩諾沙星注射液在豬體內的殘留消除研究

黃耀凌，劉智宏，白玉惠，王鶴佳，李丹，趙琪，張玉潔，吳辰斌，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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恩諾沙星注射液在豬體內的殘留消除研究

黃耀凌，劉智宏，白玉惠，王鶴佳，李丹，趙琪，張玉潔，吳辰斌，徐士新*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為研究恩諾沙星在豬體內的殘留消除規(guī)律，驗證休藥期，以2.5 mg/kg體重肌內注射10%恩諾沙星注射液，每日2次，連續(xù)3 d。在最后一次給藥后0、3、5、7、10 d時間點，采集肌肉、肝臟、腎臟、脂肪和注射部位肌肉，HPLC法測定組織中的恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星的殘留量，并用WT1.4軟件計算休藥期。結果顯示，恩諾沙星在豬肌肉、肝臟、腎臟、脂肪和注射部位肌肉的休藥期分別是5.6、13.4、8.2、3.0、5.5 d。為保證獸藥使用安全、消費者健康和食品安全，推薦恩諾沙星注射液在豬的休藥期為14 d。

恩諾沙星；豬；殘留；休藥期

恩諾沙星是動物專用的氟喹諾酮類抗菌藥，具有抗菌譜廣、殺菌力強、作用迅速、體內分布廣、副作用小等特點，廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖[1]。由于恩諾沙星在動物體內可不同程度代謝成環(huán)丙沙星，因此可食性組織中的藥物殘留標示物為恩諾沙星和代謝物環(huán)丙沙星。這類藥物對動物骨骼生長發(fā)育有不良影響，禁用于幼齡動物和孕畜，同時對胃腸道、中樞神經(jīng)、肝細胞均有一定的危害[2]。因此我國農業(yè)部發(fā)布了恩諾沙星在豬組織中的最高殘留限量(MRL)：肌肉100 μg/kg、肝臟200 μg/kg、腎臟300 μg/kg和脂肪100 μg/kg[3]，并在農業(yè)部278號公告中規(guī)定了豬在使用恩諾沙星注射液后的休藥期為10 d[4]。本實驗通過對市售恩諾沙星注射液在豬體內殘留消除規(guī)律的研究，計算恩諾沙星在豬不同組織的休藥時間，以期為安全使用獸藥和正確執(zhí)行休藥期規(guī)定提供科學的依據(jù)和建議。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑 10%恩諾沙星注射液：批號1603002，山東獸藥生產(chǎn)廠家提供；恩諾沙星對照品：含量99.9%，批號H0081206，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；鹽酸環(huán)丙沙星對照品：含量99.8%，批號H101310，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；Bond Elut-C18固相萃取柱：100 mg/mL，安捷倫公司；甲醇、乙腈、正己烷：色譜純；檸檬酸、乙酸銨、磷酸、三乙胺、磷酸二氫鉀，均為分析純。

1.2 儀器設備 Agilent1260高效液相色譜儀(配熒光檢測器)；固相萃取裝置；pH計；高速冷凍離心機；Milli—Q超純水儀。

1.3 溶液配制 0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4 mL，用水稀釋至1000 mL，用三乙胺調pH值至2.4。檸檬酸/乙酸銨緩沖液：取檸檬酸10.56 g，乙酸銨7.87 g，用水溶解并稀釋至1000 mL，混勻。磷酸鹽緩沖溶液(用于肌肉、脂肪組織)：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水溶解并稀釋至500 mL，用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至7.0。磷酸鹽溶液(用于肝臟、腎臟組織)：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水溶解并稀釋至500 mL，混勻。洗脫液：取乙腈20 mL，用0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液稀釋至100 mL，混勻。

1.4 試驗動物 三元雜交健康豬30頭，雌雄各半，體重為53±6.6 kg，購自北京某豬場。其中對照組5頭，給藥組25頭。試驗前7 d，自由采食飲水，飼喂不添加任何抗菌藥物的全價配合飼料，試驗前后各組飼養(yǎng)條件相同。

1.5 給藥與樣品采集 給藥組以2.5 mg/kg體重劑量進行臀部肌內注射恩諾沙星注射液，每日2次，連續(xù)給藥3 d，分兩側注射。最后一次給藥后0、3、5、7和10 d分別隨機宰殺5頭，采集背長肌、肝臟、腎臟、脂肪和注射部位肌肉，于-20 ℃保存。

1.6 試驗方法 采用實驗室自建殘留檢測方法[5]對樣品進行測定。

1.6.1 樣品前處理 取(2±0.05)g樣品，置50 mL離心管中，肌肉、脂肪試樣加磷酸鹽緩沖溶液10.0 mL，肝臟、腎臟試樣加磷酸鹽溶液20.0 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min。15000 r/min離心10 min，取上清液于另一離心管中。肌肉、脂肪試樣殘渣中再加磷酸鹽緩沖溶液10.0 mL；肝臟、腎臟試樣殘渣中再加磷酸鹽溶液 20.0 mL，重復提取一遍。合并兩次上清液，充分混勻，備用。

取腎臟上清液10 mL于另一50 mL離心管中，加5 mL正己烷，中速振蕩5 min。5000 r/min離心5 min，取下層清液，混勻，備用。

固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL預洗。取備用液3.0 mL過柱，水1 mL淋洗，擠干。用洗脫液1.0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液。經(jīng)濾膜過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜法測定。

1.6.2 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液+乙腈(82+18,V/V)，使用前經(jīng)微孔濾膜過濾(測肌肉和脂肪組織用)；檸檬酸/乙酸銨溶液+乙腈(82+18,V/V)，使用前經(jīng)微孔濾膜過濾(測肝臟和腎臟組織時用)；流速0.8 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長450 nm；柱溫40 ℃；進樣量40 μL。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在0.5 ～ 800 ng/mL濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，其曲線方程分別為y= 3.6034x+ 0.5218和y= 7.4225x+ 1.0125，相關系數(shù)(R2)均為0.9999，標準溶液和組織色譜圖見圖1和圖2。

2.2 組織中藥物殘留 按實驗室檢測方法對采集的注射部位、背長肌、脂肪、肝臟及腎臟樣品進行測定。按檢測方法的殘留量計算公式，計算樣品中恩諾沙星及代謝物環(huán)丙沙星的殘留量，并用同時測定的陽性添加樣品的回收率進行折算，以折算結果作為樣品中恩諾沙星及代謝物環(huán)丙沙星的殘留量。分別計算每個時間點5頭豬的注射部位、肌肉(背長肌)、脂肪、肝臟及腎臟樣品中恩諾沙星和代謝物環(huán)丙沙星(表1)和總殘留量(表2)。

表1和表2結果顯示，藥物在停藥0 d的注射部位濃度最高，其次為肝臟、腎臟和背長肌，脂肪組織中的藥物濃度最低。藥物在組織中的代謝較快，在停藥后第3天，肌肉(背長肌)、脂肪和腎臟中的藥物濃度已低于MRL，分別為46.6 μg/kg、92.5 μg/kg和24.1 μg/kg；注射部位在停藥后第5 天低于MRL，為5.7 μg/kg；肝臟在第7 天低于MRL，為180.9 μg/kg。五種組織中的藥物平均總殘留量在停藥后第7 天時均已降低至MRL之下。

2.3 休藥期計算 采用WT1.4軟件計算休藥期，確保有95%的可信限使99%的殘留低于MRL。10%規(guī)格恩諾沙星制劑在豬組織中的休藥期計算和結果見表3，殘留消除擬合圖見圖3。

結果顯示，10%規(guī)格制劑在豬組織中的休藥期分別為注射部位5.5 d、肌肉(背長肌)5.6 d、肝臟13.4 d、腎臟8.2 d和脂肪3.0 d，其中肝臟的休藥期時間最長。為了確保消費者健康安全，建議10%規(guī)格恩諾沙星注射液在豬的休藥期為14 d。

圖1 恩諾沙星及環(huán)丙沙星混合標準溶液(30 ng/mL)

圖2 豬肝中殘留的恩諾沙星及環(huán)丙沙星色譜圖(休藥后第0 天)

組織停藥時間/d不同編號豬組織中恩諾沙星殘留量不同編號豬組織中環(huán)丙沙星殘留量1234512345注射部位011422.99128.46949.616001.56487.6329.2441.2440.0587.8485.93183.771.2128.9388.8111.47.2ND10.015.26.45NDND5.317.16.2NDNDNDNDND711.4NDNDNDNDNDNDNDNDND10NDNDNDNDNDNDNDNDNDND肌肉(背長肌)03998.32906.94650.23780.74971.5503.5593.7603.8672.6709.4391.47.846.946.86.812.7ND11.29.5ND55.35.45.611.18.2NDNDNDNDND78.6NDNDNDNDNDNDNDNDND10NDNDNDND5.3NDNDNDNDND肝臟04596.33687.05994.44194.66044.5746.81075.91092.81336.41395.13262.2185.2335455.1233.2NDND12.412.4ND581.2110.8162.3489.2174.6NDNDNDNDND7287.4181.3110.2209.3116.1NDNDNDNDND10110.9101.899.2176.186.7NDNDNDNDND腎臟04439.14752.16589.87846.77402.0872.41142.91379.02153.51930.53125.128129.2128.915.7NDND25.410.3ND5NDND22.633.827.3NDNDNDNDND728.810.011.3ND13.9NDNDNDNDND1012.312.0NDND20.4NDNDNDNDND脂肪0937.1461.5968.9922.41158.745.337.790.899.984.1322.251.419.618.29.2NDNDNDNDND5NDNDND6.7NDNDNDND6.7ND7NDNDNDNDNDNDNDNDNDND10——————————

注：ND為未檢出；“—”為未檢測

表2 不同時間點恩諾沙星和環(huán)丙沙星在豬各組織中的總殘留量 μg/kg

注：ND為未檢出；“—”為未檢測

圖3 恩諾沙星注射液的組織殘留消除擬合圖

動物組織10%規(guī)格制劑的休藥期/d注射部位5.5肌肉(背長肌)5.6肝臟13.4腎臟8.2脂肪3.0

3 討論與小結

通過市售恩諾沙星注射液在豬的殘留消除試驗，發(fā)現(xiàn)這種市售注射液在豬組織中的殘留消除規(guī)律與其他文獻報道相近，代謝消除較快[6-8]，與文獻報道相比，都是肝臟和腎臟殘留濃度較高，并迅速消除。但從組織殘留濃度看，與劉小艷等[7]試驗結果比較，本試驗的藥物總殘留濃度較高，因為劉小艷報道其制劑在停藥第5天后，各組織中未檢測到藥物殘留。與仲鋒等[6]試驗結果比較，注射部位、肝臟、腎臟和脂肪在停藥后第10天的殘留濃度比較接近，本試驗在停藥后第10天的殘留濃度分別為注射部位為未檢出、肝臟為116.0 μg/kg、腎臟為8.9 μg/kg、脂肪為未檢出；仲鋒報道的殘留濃度，注射部位為未檢出、肝臟為95.2 μg/kg、腎臟為122 μg/kg、脂肪為未檢出。這是因為肝臟和腎臟分別是恩諾沙星的代謝和排泄器官，休藥后第10天藥物殘留濃度在肝臟和腎臟仍高于肌肉和脂肪。本試驗中藥物殘留在組織中含量與文獻不一致，可能是藥物制劑生產(chǎn)工藝差異等因素造成的。

本試驗的休藥期計算中采用的經(jīng)回收率折算后的樣品殘留濃度數(shù)據(jù)來進行。經(jīng)WT1.4軟件分析，采用回收率折算數(shù)據(jù)計算的休藥期在肌肉和肝臟較未折算回收率的休藥期時間略長。未折算回收率數(shù)據(jù)計算的休藥期分別是注射部位5.4 d、肌肉4.6 d、肝臟12.6 d、腎臟8.2 d和脂肪3.8 d。這可能是采用回收率折算得到的恩諾沙星總殘留濃度相對較高，因而計算得到的休藥期時間更長，但這更能保證畜產(chǎn)品的安全、消費者的健康。

表3的結果表明，豬肌肉、腎臟、脂肪和注射部位的休藥期符合農業(yè)部278號公告中恩諾沙星注射液休藥期10 d的規(guī)定，但肝臟的休藥期結果，與公告規(guī)定不一致?？倸埩魯?shù)據(jù)經(jīng)WT1.4軟件計算，肝臟的休藥期超過10 d，為14 d(13.4 d)。這可能是因為動物之間存在差異。雖然，在停藥后10 d，5頭動物肝臟中的藥物殘留都已低于MRL，但本試驗數(shù)據(jù)采用WT1.4軟件處理，在統(tǒng)計學上考慮了不同動物之間殘留濃度的差異，確保有95%的可信限使99%的殘留低于MRL，使計算得到的肝臟休藥期數(shù)據(jù)超過了10 d。而其他文獻報道，均根據(jù)殘留濃度低于MRL的停藥時間點來確定休藥期[6～8]。

試驗中市售恩諾沙星注射液在豬的休藥期與農業(yè)部278號公告規(guī)定不一致，可能是動物間差異、休藥期計算方式不同，也可能是制劑本身生產(chǎn)工藝不同等原因引起。因此，為了保證畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，科學用藥，遵守獸藥制劑的休藥期規(guī)定，保障動物性產(chǎn)品的質量和消費者的食品安全，應進一步增加對市售獸藥制劑休藥期的驗證研究，并對農業(yè)部公告上的休藥期規(guī)定進行梳理。

[1] 丁麗玲，魯曉旭，李銀生，等. 蚯蚓體內恩諾沙星殘留的檢測方法研究[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報，2016，3：(2)：403-408．

[2] 郭建華，李天真，苗剛，等. 乳酸環(huán)丙沙星等對金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗[J]. 畜禽業(yè)，2011，6：59-60．

[3] 中華人民共和國農業(yè)部公告235號. 動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[4] 中華人民共和國農業(yè)部公告278號：獸藥休藥期規(guī)定[S].

[5] 張玉潔，李倩，汪霞，等. 高效液相色譜法檢測多種動物組織中氟喹諾酮類藥物殘留量的研究[J]. 中國獸藥雜志，2012，46(7)：18-22．

[6] 仲鋒，郭筱華，黃齊頤，等. 恩諾沙星在豬組織中殘留消除規(guī)律研究[J]. 中國獸藥雜志，2005，39(2)：6-9．

[7] 劉小艷，吳海坤，方炳虎，等. 恩諾沙星混懸液在豬體內殘留消除規(guī)律研究[J]. 動物醫(yī)學進展，2011，32(5)：89-93．

[8] 羅雅勁，孫永學，李小娜，等. 恩諾沙星微囊劑在豬體內殘留消除規(guī)律研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(2)：129-131．

(編輯：侯向輝)

Residue Depletion Study of Enrofloxacin Injection in Swine

HUANG Yao-ling，LIU Zhi-hong，BAI Yu-hui，WANG He-jia，LI Dan，ZHAO Qi，ZHANG Yu-jie，WU Chen-bin，XU Shi-xin*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

The residue depletion of enrofloxacin injection in the swine was studied. The preparation of 10% concentration was administrated intramuscularly at a dose of 2.5 mg/kg twice daily for 3 days. Tissue samples were collected at 0, 3, 5, 7 and 10 day after the last administration. The concentrations of residues including enrofloxacin and ciprofloxacin in tissues were analyzed and the withdrawal time was calculated by WT1.4 software. The result recommended that the withdrawal time of the 10% enrofloxacin injection in swine would be 14 days.

enrofloxacin; swine; residue; withdrawal time

2016年度國家農產(chǎn)品質量安全風險評估項目計劃(GJFP201600705)

黃耀凌，副研究員，從事獸藥安全評價研究。

徐士新。E-mail：xushixin@ivdc.org.cn

2016-11-09

A

1002-1280 (2017) 03-0048-07

S859.796