GC法測(cè)定市售動(dòng)物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類(lèi)藥物的殘留量

王鵬思，李嘉欣，石上梅，薛 健*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；2. 國(guó)家藥典委員會(huì)，北京 100061)

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GC法測(cè)定市售動(dòng)物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類(lèi)藥物的殘留量

王鵬思1，李嘉欣1，石上梅2*，薛 健1*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；2. 國(guó)家藥典委員會(huì)，北京 100061)

為了建立柱前衍生-GC-ECD法同時(shí)測(cè)定市售動(dòng)物源性中藥材地龍、水蛭中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素3種氯霉素類(lèi)抗生素殘留量的方法，樣品經(jīng)乙酸乙酯超聲提取，旋轉(zhuǎn)蒸干后，提取物溶于4%氯化鈉溶液，經(jīng)正己烷去脂，液液分配凈化。再加BSTFA-TMCS衍生化反應(yīng)后氮?dú)獯蹈?，正己烷定容進(jìn)樣分析，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在0.1～20 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.9989；空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)表明，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在1、5、10 μg/kg這3個(gè)添加水平下的回收率為62.9%～100.8%，RSD<16%，其檢出限分別為 0.05、0.1、0.1 μg/kg。該方法簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確度和精密度高，適用于地龍、水蛭中氯霉素類(lèi)藥物的殘留測(cè)定。

中藥材；地龍；水蛭；氯霉素類(lèi)藥物；殘留量；氣相色譜

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)、氟甲砜霉素(又稱(chēng)氟苯尼考，F(xiàn)lorfenicol，F(xiàn)F)同屬于氯霉素類(lèi)廣譜抗生素，在畜牧業(yè)、漁業(yè)中廣泛應(yīng)用。但研究發(fā)現(xiàn)氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，可引起人類(lèi)的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、新生兒和早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性[1]。甲砜霉素是氯霉素的類(lèi)似物，被稱(chēng)為第二代氯霉素，氟甲砜霉素是甲砜霉素的氟化衍生物，被稱(chēng)為第三代氯霉素，這兩種藥物有效地克服了氯霉素導(dǎo)致再生障礙性貧血的缺陷[2]。但甲砜霉素有比氯霉素強(qiáng)5倍的免疫抑制作用，且抗菌效果不及氯霉素和氟甲砜霉素，因此限制了它的臨床使用[3]。氟甲砜霉素的毒副作用較小，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛[4]。

目前，對(duì)以上3種藥物殘留量的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法[5-12]等，檢測(cè)對(duì)象主要包括肉類(lèi)、乳制品、水產(chǎn)品、禽畜飼料、土壤及禽畜糞[5-12]等。由于地龍主食發(fā)酵的雞糞、豬糞、牛羊糞和生活垃圾[13]，水蛭主食螺螄、河蚌、青蝦、龜鱉、蚯蚓、草蝦以及哺乳類(lèi)動(dòng)物的血液[14]，故地龍、水蛭體內(nèi)也可能有氯霉素類(lèi)藥物殘留。加之目前對(duì)動(dòng)物源性中藥材中氯霉素類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)選取地龍、水蛭兩味中醫(yī)臨床常用且療效顯著的中藥材，測(cè)定其中氯霉素類(lèi)藥物的殘留量，這既可保障人民用藥安全，亦對(duì)兩味藥材的進(jìn)出口貿(mào)易意義重大。

1 材 料

1.1 儀器與設(shè)備 Agilent 7890A氣相色譜儀(配μ-ECD檢測(cè)器)，色譜柱為毛細(xì)管色譜柱(Agilent HP-5，30 m×0.32 mm ×0.25 μm)，載氣為高純氮?dú)?純度≥99.999%，北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司)；HGC-12A氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；HEI-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國(guó)海道夫)；HH-22恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；TP-150超聲波清洗機(jī)(北京天鵬電子新技術(shù)有限公司)；SHB-B循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；80-2型高速離心機(jī)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))；WH-1渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠(chǎng))；PL203/01電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Eppendorf單通道可調(diào)移液槍(10～100μL、20～200μL、100～1000μL)；C18固相萃取小柱(1000 mg/6 mL填料，德國(guó)CNW公司)；Florisil固相萃取小柱(1000 mg/6 mL填料，美國(guó)Agilent公司)等。

1.2 藥品與試劑 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)：純度98%，阿拉丁試劑；三甲基氯硅烷(TMCS)：純度98%，國(guó)藥集團(tuán)；色譜純甲醇(4 L/瓶，F(xiàn)isher公司)；分析純甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、乙醚、吡啶、甲苯、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉(北京化工廠(chǎng))等。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制 參照農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-14-2007《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法》配制100 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，10 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，0.2 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，4%氯化鈉溶液及BSTFA-TMCS(體積比為99∶1)衍生化試劑。

2.2 樣品前處理

2.2.1 樣品的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL乙酸乙酯，超聲提取30 min，靜置，過(guò)濾，濾渣重復(fù)上述操作一次，合并兩次濾液至100 mL茄形瓶中，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入5 mL 4%的氯化鈉溶液超聲，將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞玻璃試管中，加入5 mL正己烷，渦旋，將試管置離心機(jī)中，以3000 r/min離心10 min，取出試管，棄掉正己烷層，以去除脂肪，重復(fù)操作一次。

2.2.2 樣品的凈化 向除去脂肪、蛋白質(zhì)的氯化鈉水溶液中加入5 mL乙酸乙酯渦旋，靜置分層，吸取有機(jī)相至10 mL具塞玻璃試管中，再分別用3、2 mL乙酸乙酯提取兩次，合并有機(jī)相，過(guò)裝有5 g無(wú)水硫酸鈉的小柱，以除去水分，再用5 mL乙酸乙酯洗滌無(wú)水硫酸鈉的小柱，合并洗脫液至50 mL茄形瓶中，40 ℃水浴濃縮至近干，加入1 mL乙酸乙酯溶解茄形瓶中的殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至5 mL刻度試管中，再用2 mL乙酸乙酯清洗茄形瓶，清洗液亦轉(zhuǎn)移至5 mL刻度試管中，50 ℃下氮?dú)獯蹈纱苌?/p>

2.2.3 樣品的衍生化 取上述吹干后待衍生化的殘?jiān)尤?00 μL衍生化試劑BSTFA-TMCS與100 μL反應(yīng)介質(zhì)吡啶，70 ℃水浴加熱60 min進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)完成后氮?dú)獯蹈?，放至室溫用正己烷定容? mL，轉(zhuǎn)移至2 mL進(jìn)樣小瓶中，待GC檢測(cè)。

2.3 色譜測(cè)定條件 Agilent HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：80 ℃保持1 min，50 ℃/min升溫至200 ℃，20 ℃/min升溫至260 ℃保持5 min，5 ℃/min升溫至280 ℃；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氮?dú)?，流? mL/min；檢測(cè)器溫度為300 ℃；進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

B.地龍空白樣品色譜圖;C.地龍加標(biāo)樣品色譜圖圖1 氯霉素類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)和地龍樣品(B、C)氣相色譜圖

B.水蛭空白樣品色譜圖;C.水蛭加標(biāo)樣品色譜圖圖2 氯霉素類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)和水蛭樣品(B、C)氣相色譜圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 用2.1.3混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別配制出0.1、1、5、10、20 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按2.2.3項(xiàng)下衍生化后，按2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行GC-ECD測(cè)定。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以試樣濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行回歸計(jì)算，得氯霉素的回歸方程為：Y=103.92X-57.791，r2=0.9993，氟甲砜霉素的回歸方程為：Y=32.945X+31.982，r2=0.9989，甲砜霉素的回歸方程為：Y=81.725X-249.37，r2=0.9990。表明本方法氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素在0.1～20 μg/L濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。2.5 準(zhǔn)確度和精密度考察 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取空白本底的地龍、水蛭樣品2.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入濃度分別為1、5和10μg/L的3種氯霉素類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL(精密量取)，充分混勻，放置過(guò)夜。使空白樣品中氯霉素類(lèi)藥物的添加水平為1、5、10 μg/kg 3個(gè)水平(每個(gè)水平3個(gè)平行)。按照2.2樣品前處理及2.3色譜測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在1、5、10 μg/kg 3個(gè)添加水平下的回收率為62.9%～100.8%，RSD<16%，符合氯霉素類(lèi)藥物殘留測(cè)定的要求。

表1 地龍、水蛭中三種不同濃度氯霉素類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加回收率(n=3)

2.6 檢出限和定量限的確定 分別取地龍、水蛭空白樣品，按照樣品前處理程序處理后上機(jī)測(cè)定，另取多份空白樣品，分別加入不同的較低濃度的氯霉素類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照樣品前處理程序處理后上機(jī)測(cè)定，對(duì)比兩者，S/N=3時(shí)的藥物濃度即為檢出限，S/N=10時(shí)的藥物濃度即為定量限。本試驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法測(cè)得氯霉素的檢出限和定量限分別為0.05、0.17 μg/kg，甲砜霉素、氟甲砜霉素的檢出限和定量限分別為0.1、0.33 μg/kg。

2.7 樣本測(cè)定結(jié)果 從北京10家藥店隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)樣本10份，均未檢出氯霉素類(lèi)藥物。

3 討論與分析

3.1 提取溶劑的選擇 氯霉素類(lèi)藥物為弱極性物質(zhì)，微溶于水，易溶于乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，甲醇、乙腈這兩種溶劑對(duì)人體毒性較大，而且乙腈在揮干時(shí)容易冒泡，揮干時(shí)間較長(zhǎng)[5，15-16]，參考《GB/T 22338-2008 動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量測(cè)定》中氣相色譜-質(zhì)譜法，本試驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取劑。

3.2 凈化方式的選擇 李鵬等[7]測(cè)定動(dòng)物組織中氯霉素類(lèi)藥物殘留量時(shí)采用Florisil柱凈化，農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-14-2007《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法》采用C18固相萃取柱凈化，吳明媛[6]、冷凱良等[17]采用乙酸乙酯反萃取凈化。本試驗(yàn)對(duì)3種凈化方法均進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果顯示采用Florisil SPE柱凈化時(shí)氯霉素類(lèi)藥物的回收率比較低，采用C18 SPE柱和乙酸乙酯液液萃取凈化時(shí)氯霉素類(lèi)藥物的回收率均在75%以上。綜合樣品凈化的回收率結(jié)果、操作的簡(jiǎn)便性和耗材費(fèi)用等方面的因素，確定地龍藥、水蛭藥材中3種氯霉素類(lèi)藥物殘留測(cè)定方法中樣品的凈化方法為：用10 mL乙酸乙酯分3次(5 mL+3 mL+2 mL)萃取凈化。

3.3 藥材樣本的測(cè)定 在對(duì)10批地龍、水蛭樣本的測(cè)定中，未檢出氯霉素類(lèi)藥物的殘留，參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)公告《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》中的規(guī)定：氯霉素為禁止使用的藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出；甲砜霉素最大殘留限量為50 μg/kg；氟甲砜霉素在其他動(dòng)物的肌肉中的最大殘留限量為100 μg/kg。本批樣本氯霉素類(lèi)藥物的殘留符合規(guī)定。但值得注意的是，研究著重于建立一種測(cè)定動(dòng)物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類(lèi)藥物殘留量的方法，所測(cè)的地龍、水蛭樣本數(shù)量不足，因此要想全面了解地龍、水蛭中氯霉素類(lèi)藥物的殘留情況，還需增加對(duì)不同品種、不同地區(qū)和不同炮制方式等更多樣本的測(cè)定。

4 小 結(jié)

建立了GC-ECD法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類(lèi)藥物殘留量的方法，本法靈敏度高，氯霉素的檢出限可達(dá)到0.05 μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素的檢出限可達(dá)到0.1 μg/kg。該方法前處理步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，處理后雜質(zhì)干擾少，具有較強(qiáng)的適用性。

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(編輯：陳希)

Determination of 3 Chloramphenicols Medicine Residuesin Animal-origin Chinese Medicinal Materials Pheretima and Hirudoin the Retailer by Gas Chromatography

WANG Peng-si1，LI Jia-xin1，SHI Shang-mei2*，XUE Jian1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.ChinesePharmacopoeiaCommission，Beijing100061，China)

Pre-column derivatization GC-ECD method was established to simultaneously determine the residues of chloramphenicol(CAP)，thiamphenicol(TAP) and florfenicolin(FF) in animal-original Chinese medicinal materials pheretima and hirudo in the retailer．The samples were extracted with ethylacetate by ultrasound assistance and evaporated to dry．The extracts were dissolved in 4% sodium chloride solution，defatted with n-hexane，and cleaned up by liquid-liquid partition．The purified extracts were derivatized with BSTFA-TMCS and derivatization solution was dried under nitrogen．The final targets were dissolved with n-hexane and quantitatived by external standard method．The results indicated that the calibration curves of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol were linear in the ranges of 0.1～20 μg/L，with correlation coefficients not less than 0.9989.Recoveries of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol spiked in blank samples at three levels of 1，5，10 μg/kg were 62.9%～100.8%，and the relative standard deviation(RSD) was less than 16%，the limits of detection(LODs)were 0.05，0.1，0.1 μg/kg respectively．With the advantages of simplicity，rapidity，high accuracy and precision，this method could be suitable for the detection of chloramphenicols medicine residues in pheretima and hirudo．

Chinese medicinal materials；pheretima；hirudo；chloramphenicols medicine；residues；gas chromatography

王鵬思，碩士研究生，從事中藥質(zhì)量方面研究。

石上梅，E-mail:ssm@chp.org.cn；薛健，E-mail:xuejian200@sina.com

2016-10-28

A

1002-1280 (2017) 03-0065-05

S853.7