不同地理種群白紋伊蚊線粒體基因COI的遺傳多樣性分析

張瑞玲，姚廣琴，潘曉倩，馬德珍，趙愛(ài)華，張 忠

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不同地理種群白紋伊蚊線粒體基因COI的遺傳多樣性分析

張瑞玲1,2，姚廣琴2，潘曉倩2，馬德珍3，趙愛(ài)華3，張 忠1,2

目的 探討白紋伊蚊不同地理種群間的進(jìn)化關(guān)系和遺傳分化情況，為白紋伊蚊防制和蚊媒病防控提供基礎(chǔ)資料。方法 在廣泛采集樣品的基礎(chǔ)上，通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序獲取線粒體基因COI片段，并從GenBank下載了部分序列，比對(duì)、剪切后的598 bp用于后續(xù)分析。結(jié)果 系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明所有白紋伊蚊的COI序列聚成一支，沒(méi)有明顯的遺傳差異；60條COI序列分屬于19個(gè)單倍型，其中4個(gè)為共享單倍型；單倍型多樣性(Hd)為0.737，核苷酸多樣性(π)為0.20%；海南的白紋伊蚊種群與絕大部分地理種群間出現(xiàn)了明顯的分化(P<0.05)；H1和H6形成了2個(gè)輻射中心，是較為原始的單倍型。結(jié)論 我國(guó)的白紋伊蚊種群正處于擴(kuò)張的趨勢(shì)，海南的白紋伊蚊種群與其它地理種群間出現(xiàn)了明顯分化。

白紋伊蚊；地理隔離；瓶頸效應(yīng)；蚊媒病

白紋伊蚊(Aedesalbopictus)又稱“亞洲虎蚊”，隸屬于雙翅目，蚊科，伊蚊屬，是中國(guó)常見(jiàn)蚊種之一。白紋伊蚊是登革熱、黃熱病、基孔肯雅熱、西尼羅熱等多種病毒的重要傳播媒介。近些年來(lái)，蚊媒病在全球的流行呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)，其中許多是傳播力強(qiáng)、流行面廣、發(fā)病率高、危害性大的疾病，已經(jīng)成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。當(dāng)前，由于登革熱等蚊媒病尚無(wú)特效藥物和疫苗，對(duì)傳播媒介白紋伊蚊的防制是預(yù)防和控制蚊媒病疫情的主要手段。

蚊蟲(chóng)傳播病原體的能力受其遺傳因素的影響，研究證據(jù)表明地理來(lái)源不同的白紋伊蚊種群和個(gè)體對(duì)登革熱病毒的易感性和傳播能力有所不同[2-3]。因此，不同白紋伊蚊種群遺傳背景的深入了解將對(duì)蚊媒病的防控具有重要的意義。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，受到環(huán)境選擇壓力、突變、遺傳漂變等因素的影響，不同地理種群的蚊蟲(chóng)間在基因交流、遺傳多樣性方面都會(huì)出現(xiàn)變化。利用分子生物學(xué)的方法，結(jié)合生態(tài)、分布格局、種群動(dòng)態(tài)和遺傳多樣性等多個(gè)方面的資料，探討白紋伊蚊不同地理種群間的分化，不僅有助于闡明不同地理種群間的遺傳結(jié)構(gòu)和擴(kuò)散動(dòng)態(tài)，還可以了解它們傳播疾病能力之間的差異，是用于制定合理高效防控措施的可靠理論依據(jù)[4]。

我國(guó)研究人員已開(kāi)展了大量相關(guān)研究，但多局限于某一地區(qū)種群遺傳結(jié)構(gòu)的探討[5-7]。本文基于前期在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛采樣的基礎(chǔ)上，利用線粒體基因COI(Cytochrome C Oxidase Subunit I)初步分析了我國(guó)不同地區(qū)白紋伊蚊的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為蚊媒病有效防治策略的制定提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 本研究所用樣品的采集信息見(jiàn)表1。所有標(biāo)本浸泡于95%無(wú)水乙醇中于-20 ℃保存?zhèn)溆?。基于形態(tài)學(xué)特征對(duì)采集樣本進(jìn)行物種鑒定。

1.2 DNA 提取、基因擴(kuò)增及測(cè)序 取單頭個(gè)體，使用組織/細(xì)胞 DNA 快速提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù))，按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行提取，提取到的DNA于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。PCR上游引物為L(zhǎng)CO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；下游引物為HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。擴(kuò)增體系為30 μL，其中DNA模板2 μL；TaqDNA聚合酶0.4 μL；正反向引物各0.6 μL；10 × buffer，3 μL；dNTPs，2.4 μL；ddH2O，21 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，45 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠(2%)上，置于電泳槽中電泳(120 V，30 min)檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TAE。同時(shí)，電泳過(guò)程中選用DNA Marker 進(jìn)行目的基因長(zhǎng)度的確認(rèn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析 所得雙向測(cè)序結(jié)果利用DNAStar 7.1(DNASTAR, Inc. 1996)軟件包中的Seqman程序進(jìn)行序列拼接和編輯，確定序列的方向，然后將這些序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，以確保所得到的是目標(biāo)序列。序列在MEGA 5.0軟件[4]中進(jìn)行編輯和比對(duì)，包括：1)位點(diǎn)的手工篩查和糾正；2)將DNA序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，以檢查序列內(nèi)是否有終止密碼子的存在；3)堿基組成分析，變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)及保守位點(diǎn)的計(jì)算。

系統(tǒng)發(fā)育分析選用三帶喙庫(kù)蚊(Culextritaeniorhynchus)(GenBank登錄號(hào)：KJ012246、KJ768093、KT358420)作為外群。采用 PAUP*4.0[8]構(gòu)建最大似然樹(shù)(Maximum Likelihood, ML)。用DnaSP 5.0[9]計(jì)算單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)。使用Arlequin 3.5[10]估算種群間的分化系數(shù)Fst(F-statistics)。使用Network 4.6.1.3軟件[11]基于Median-joining方法構(gòu)建了單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析 本研究測(cè)得以及GenBank下載獲得的白紋伊蚊COI序列共計(jì)60條，比對(duì)處理后用于后續(xù)分析的序列長(zhǎng)度為598 bp，無(wú)插入和缺失突變。共檢測(cè)到579個(gè)保守位點(diǎn)和19個(gè)可變信息位點(diǎn)，利用DnaSP分析共定義19個(gè)單倍型，其中有4個(gè)共享單倍型(shared haplotype)，15個(gè)私有單倍型(singletons)(表1)。該物種的單倍型多樣性(Hd)為0.737，核苷酸多樣性(π)為0.20%。不同地理種群?jiǎn)伪缎投鄻有圆町惷黠@，其中四川(Hd=0.504，π=0.08%)、廣西(Hd=1.000，π=0.25%)、廣東(Hd=0.454，π=0.11%)、臺(tái)灣(Hd=1.000，π=0.33%)和北京(Hd=0.833，π=0.26%)，山東、浙江和海南的種群多樣性較低。

表1 白紋伊蚊樣品信息和單倍型分布

*：數(shù)字表示用于分析的序列總數(shù)，括號(hào)內(nèi)表示自NCBI下載序列的序列號(hào)

**：下劃線標(biāo)示共享單倍型

*：Arabic numeral represents total sequences used for analysis, and accession number of downloaded sequences was showed in bracket

**：Shared haplotype was marked with underline

以三帶喙庫(kù)蚊為外群，構(gòu)建的ML樹(shù)顯示所有白紋伊蚊的COI序列聚成一支，支持率為100%，表明不同地理種群間沒(méi)有明顯的分化(圖1)。

2.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 種群分化系數(shù)(Fst)常用來(lái)表示種群間的分化程度，F(xiàn)st接近于0時(shí)，說(shuō)明種群間沒(méi)有發(fā)生遺傳分化。根據(jù)種群間兩兩比對(duì)的結(jié)果可以看出(表2)，山東、四川、廣西、廣東、浙江和臺(tái)灣的白紋伊蚊種群間沒(méi)有明顯的分化(P>0.1)；北京和四川、廣東之間的分化系數(shù)分別為0.307和0.395，但分化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。海南的白紋伊蚊種群與其他7個(gè)種群間的分化系數(shù)介于0.593～1.000之間，且除與臺(tái)灣種群的分化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與其他6個(gè)種群間的分化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 基于COI序列的白紋伊蚊地理種群間遺傳分化系數(shù)(Fst)

*：P< 0.05

圖1 基于線粒體基因COI構(gòu)建的ML樹(shù)Fig.1 Maximum likelihood tree constructed based on mitochondrial gene COI

從單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，單倍型H1和H6處于中間的位置，形成2個(gè)輻射中心，是比較原始的單倍型(圖2)。H1是分布最廣的單倍型，包括了山東、陜西、四川、云南、廣西、廣東、湖南、浙江、江蘇和北京的樣品，并輻射進(jìn)化出12個(gè)單倍型，說(shuō)明H1是較為古老的單倍型。北京和廣西的部分樣品組成了以H6為原始單倍型的星狀網(wǎng)絡(luò)圖。

3 討 論

白紋伊蚊具有擴(kuò)散能力強(qiáng)、環(huán)境可塑性高等特點(diǎn)，且與人類關(guān)系密切，分布區(qū)易于受到人為因素的影響，攜帶有蚊卵和幼蟲(chóng)的廢舊輪胎及金屬容器等是其向潛在適生區(qū)擴(kuò)散的常見(jiàn)方式。頻繁的貨物運(yùn)輸和人員往來(lái)促進(jìn)了白紋伊蚊的擴(kuò)散和流動(dòng)，所以不同地理種群的白紋伊蚊樣品在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上聚成一支(圖1)。該物種的單倍型多樣性(Hd)為0.737，核苷酸多樣性(π)僅為0.20%，較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性表明不同地理種群可能經(jīng)歷過(guò)“瓶頸效應(yīng)”，之后伴隨著種群快速增長(zhǎng)的歷史事件，但擴(kuò)張歷史較短，核苷酸變異積累不充分[12]?；贛edian-joining方法構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖出現(xiàn)了兩個(gè)輻射進(jìn)化中心，均呈星狀分布。其中分布最廣的H1是最原始的單倍型，輻射進(jìn)化出多個(gè)單倍型；H6可能是由H1分化而來(lái)，又逐漸分化出北京和廣西地理種群的私有單倍型?！靶菭钕到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系(star phylogeny)”也支持了我國(guó)白紋伊蚊不同地理種群是經(jīng)歷“種群瓶頸”后開(kāi)始擴(kuò)張的種群[13]。

Each cycle represent a haplotype, the area of the circle is proportional to the frequency of haplotype. Different geographical populations were shown in different colors.圖2 基于線粒體COI構(gòu)建的Median-joining單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.2 Median-joining haplotype network construction based on mitochondrial gene COI

不同地理種群間的分化系數(shù)Fst值也有明顯的差異，大部分種群間的分化不明顯，但海南種群與其它地理種群間的Fst值均較大，且達(dá)到顯著水平，其中海南種群和浙江種群間的Fst值為1.0，表明是這兩個(gè)種群達(dá)到了完全的隔離分化。這可能是與海南島與其它地區(qū)的地理隔離有關(guān)系，白紋伊蚊的主動(dòng)擴(kuò)散能力弱，島嶼的地理隔離導(dǎo)致基因交流受阻，部分地理種群間出現(xiàn)了遺傳分化。此外，這也可能是與本研究所涵蓋的地理群體和研究樣品較少有關(guān)，上述研究結(jié)果并不排除在其它未取樣地區(qū)存在不同或與現(xiàn)有結(jié)果不一致的現(xiàn)象。增大樣本量和種群覆蓋面，研究結(jié)果可能將會(huì)更加客觀。

隨著全球氣候變暖，生態(tài)環(huán)境和生物群落都隨之發(fā)生改變，白紋伊蚊的密度及其地理分布也在發(fā)生變化。目前全世界都面臨著蟲(chóng)媒病的重大威脅，其中相當(dāng)一部分屬于蚊媒病。近幾年登革熱疫情持續(xù)加重，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。但持續(xù)擴(kuò)張中的白紋伊蚊種群間分化水平很低，頻繁的基因流是保持種群間不出現(xiàn)分化的重要因素，同時(shí)基因流也使得不同地理種群白紋伊蚊具有相似的帶毒能力，因此蚊媒病的防控任務(wù)仍很艱巨。

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Zhang Zhong, Email：zhangz@tsmc.edu.cn

Genetic diversities of different geographical populations ofAedesalbopictusbased on mitochondrial gene COI

ZHANG Rui-ling1,2, YAO Guang-qin2, PAN Xiao-qian2, MA De-zhen3, ZHAO Ai-hua3, ZHANG Zhong1,2

(1.CollaborativeInnovationCenterfortheOriginandControlofEmergingInfectiousDiseases,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China; 2.DepartmentofPathogenicBiology,Tai’anMedicalUniversity,Tai’an271016,China; 3.TaianMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Tai’an271000,China)

In order to figure out phylogenetic relationship and genetic diversity of different geographical populations, genetic analyses ofAedesalbopictuswere performed based on mitochondrial gene COI. Based on samples collected from most distribution regions in China, mitochondrial gene Cytochrome C Oxidase Subunit I was obtained through PCR and DNA sequence. Together with some COI sequences downloaded from GenBank, 60 COI sequences with the final length of 598 bp were used for subsequent analyses. Results showed that there was no obvious divergence according to phylogenetic analyse, all sequences were clustered together in Maximum Likelihood tree. Sixteen haplotypes were detected, and four of them shared haplotypes. Haplotype diversity (Hd) was 0.737, nucleotide diversity (π) was 0.20%. Population genetic differentiation analyses demonstrated that Hainan population showed obvious divergences. In the network of haplotypes, H1 and H6 was found to be the primary haplotypes, and they formed two radical centers. All these results indicate thatA.albopictuspopulations of China are expanding presently, and Hainan population become differential with other geographical populations, which probably attribute to geographical isolations.

Aedesalbopictus; geographical isolation; bottleneck effect; mosquito-borne disease

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.005

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.81401693&81572028)和大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No.201510439010)聯(lián)合資助

張 忠，Email：zhangz@tsmc.edu.cn

1.泰山醫(yī)學(xué)院新發(fā)傳染病溯源及防控協(xié)同創(chuàng)新中心，泰安 271016； 2.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，泰安 271016； 3.泰安市疾病預(yù)防控制中心，泰安 271000

Supported by the Natural Science Foundation of China (Nos. 81401693 & 81572028) and the Student’s Platform for Innovation and Entrepreneurship Training Program (No. 201510439010)

R384.1

A

1002-2694(2017)04-0316-05

2016-08-02 編輯：劉岱偉