魚骨泥殘留肌原纖維蛋白在加工過程中結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的變化

李學(xué)鵬，周明言，李 聰，朱文慧，儀淑敏，勵建榮,*，李鈺金，趙 葳，徐嘉憶，焦雪晴

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264300；3.大連天寶綠色食品股份有限公司，遼寧 大連 116001）

魚骨泥殘留肌原纖維蛋白在加工過程中結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的變化

李學(xué)鵬1，周明言1，李 聰1，朱文慧1，儀淑敏1，勵建榮1,*，李鈺金2，趙 葳3，徐嘉憶1，焦雪晴1

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264300；3.大連天寶綠色食品股份有限公司，遼寧 大連 116001）

依次利用膠體磨細粉碎（簡稱細粉碎）和濕法超微粉碎（簡稱超微粉碎）逐級粉碎方式制備魚骨泥，提取不同工藝階段骨泥中的肌原纖維蛋白，以肌原纖維蛋白溶解度、粒度、濁度、活性巰基含量、表面疏水性和相對二級結(jié)構(gòu)含量等為指標(biāo)，研究魚骨泥加工過程中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化。結(jié)果顯示：不同階段加工工藝對魚骨泥中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)影響顯著，其中超微粉碎對骨泥中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)影響較大，細粉碎對蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)影響相對較小。逐級粉碎可以顯著提高魚骨泥中肌原纖維蛋白的溶解度；在膠體磨剪切力作用下，肌原纖維蛋白粒徑顯著減小，而經(jīng)超微粉碎后，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和聚集作用，肌原纖維蛋白粒徑會顯著增加，由299.4 nm增至464.5 nm，同時濁度也隨之升高；細粉碎后活性巰基含量和表面疏水性均顯著下降，但隨著超微粉碎次數(shù)增加，活性巰基含量和表面疏水性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；細粉碎使肌原纖維蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)比例由64.21%增加到79.99%、β結(jié)構(gòu)比例下降，而超微粉碎可破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)，使其部分轉(zhuǎn)變成β結(jié)構(gòu)。

魚骨泥；膠體磨細粉碎；濕法超微粉碎；肌原纖維蛋白；結(jié)構(gòu)性質(zhì)

魚類加工過程中會產(chǎn)生大量的下腳料，如魚骨、魚頭、魚皮等，約占整魚的50%～70%左右。其中，魚骨是凍魚片加工中的主要下腳料，包括魚體中軸骨、附肢骨及魚刺等。由于目前缺乏相應(yīng)的魚骨深加工和綜合利用技術(shù)，水產(chǎn)加工企業(yè)通常將魚骨等下腳料低價賣給魚粉廠，簡單做成魚粉和肥料等低附加值產(chǎn)品，這不僅造成了大量的資源浪費，同時也影響了企業(yè)效益[1-2]。因此，建立經(jīng)濟、實用的魚骨加工方法及開發(fā)相應(yīng)產(chǎn)品，已成為多數(shù)水產(chǎn)加工企業(yè)的迫切技術(shù)需求。

近年來，骨泥食品因其營養(yǎng)豐富，富含骨膠原、軟骨素、礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸等，越來越受到國際市場的歡迎。骨泥食品是以鮮骨為原料，經(jīng)過粉碎成骨泥，進而加工成的食品，因其鈣磷比例與人體鈣磷比例接近，易于吸收，是人們補鈣的佳品[3-5]。由新鮮畜禽骨制成的骨泥食品在日本、歐美國家已較為流行[6]。本實驗以鰈魚骨為原料，采用濕法超微粉碎等工藝制得超微細骨泥，并將其添加到魚丸、魚肉腸等魚糜制品中，開發(fā)出了富含天然鈣質(zhì)的高鈣魚糜制品[7]。而在另一方面，魚骨在實際生產(chǎn)中常夾帶大量的魚肉（夾帶魚肉最多占魚骨總質(zhì)量的1/2左右，不同加工魚種略有差異），因此魚骨泥中含有大量的肌原纖維蛋白，這些肌原纖維蛋白也參與了高鈣魚糜制品的凝膠過程，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)將影響魚糜制品的凝膠特性和產(chǎn)品品質(zhì)。因此，了解魚骨泥加工過程中殘留肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化，對控制魚骨泥加工工藝、提高骨泥食品品質(zhì)具有重要意義。但目前關(guān)于骨泥的研究主要集中在骨的粉碎工藝以及骨泥產(chǎn)品研制等方面[8-10]，對骨泥加工過程中殘留肌原纖維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化鮮有關(guān)注。鑒于此，本實驗以鰈魚骨骨泥加工過程為基礎(chǔ)，提取不同加工階段骨泥中的肌原纖維蛋白，以肌原纖維蛋白溶解度、粒度、濁度、活性巰基含量、表面疏水性和二級結(jié)構(gòu)相對含量等為指標(biāo)，研究不同階段的工藝條件對骨泥中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，以期為魚骨泥加工工藝優(yōu)化以及魚骨泥食品的開發(fā)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰈魚骨（殘留魚肉占魚骨總質(zhì)量的（40±5）%），由大連天寶綠色食品股份有限公司提供。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨（8-anilino-1-naphthalenesulfonate ammonium，ANS）（均為分析純） 錦州藥業(yè)集團器化玻有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RRH-A250型高速萬能粉碎機 上海緣沃工貿(mào)有限公司；JMS-50型膠體磨 河北廊坊祥通機械有限公司；QDGX型濕法超微粉碎機 無錫輕大食品裝備有限公司；mS105DU型分析天平、PL602-L型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2550型紫外-可見光分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；970CRT型熒光分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨泥制備

將鰈魚骨上的血污洗凈，去除邊鰭及筋膜等，隨后將鰈魚骨切成2 cm×2 cm的小塊，將其放入-35 ℃冷凍箱中進行冷凍。利用高速萬能粉碎機將冷凍后的魚骨塊進行初步粉碎（粗粉碎）、以無可見脊椎骨塊為準(zhǔn)。然后將粗粉碎后的魚骨泥采用膠體磨研磨（細粉碎）至40 目，最后利用高精密濕法超微粉碎機將魚骨漿進一步進行超微粉碎1～3 次，使骨泥粒度達到100 目左右。為了避免粗粉碎和超微粉碎過程中物料由于摩擦升溫導(dǎo)致骨泥中蛋白質(zhì)變性，采用加冰水方式（骨泥與冰水質(zhì)量比為1∶4）和冰上預(yù)冷方式來調(diào)節(jié)骨泥的流動性并控制出料溫度均在10 ℃以下。將經(jīng)過超微粉碎的魚骨漿在4 500 r/min、4 ℃條件下離心15 min，獲得的沉淀即為骨泥。將骨泥放置-18 ℃貯藏備用。

1.3.2 魚骨泥中肌原纖維蛋白的提取及其鹽溶解度的測定

參考Benjakul等[11]的方法并略加改進，提取肌原纖維蛋白。采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，計算鹽溶性蛋白含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白粒徑及濁度測定

參考Riebroy等[12]的方法，采用激光粒度儀測定肌原纖維蛋白粒徑，采用紫外分光光度計測定肌原纖維蛋白溶液濁度。

1.3.4 活性巰基含量的測定

參考Xu Yanshun等[13]的方法，采用Ellman法進行測定。

1.3.5 表面疏水性的測定

ANS熒光探針法測定表面疏水性。將蛋白質(zhì)稀釋至0～1 mg/mL之間，在365 nm激發(fā)波長和484 nm發(fā)射波長條件下測定樣品的熒光強度，以熒光強度對蛋白質(zhì)量濃度作圖，曲線初始斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定

將蛋白液放入-80 ℃冷凍4 h，在真空冷凍干燥機中干燥8 h得固態(tài)粉末。對粉末進行壓片后放入傅里葉紅外光譜儀中進行掃描，收集光譜。掃描條件為：掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為256 次，分辨率為4 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0和Origin 8.0等軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析、顯著性檢驗和相關(guān)性分析，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚骨泥中肌原纖維蛋白鹽溶解度的變化

圖1 粉碎方式對肌原纖維蛋白鹽溶解度的影響Fig. 1 Effect of grinding procedures on the solubility of myof i brillar proteins in fi sh bone paste

肌原纖維蛋白鹽溶解度是評價肌肉蛋白質(zhì)變性的常用指標(biāo)。肌原纖維蛋白鹽溶解度在骨泥加工過程中的變化情況如圖1所示。隨著粉碎程度的增加和骨泥細度的下降，肌原纖維蛋白溶解度也顯著增加（P＜0.05），由最初的1.39 g/100 g提高至2.56 g/100 g。這可能是膠體磨（2 500 r/min）和超微濕法粉碎機（10 000 r/min）的粉碎程度不同所導(dǎo)致[14]。膠體磨和超微濕法粉碎機的使用，使物料承受到了較大的剪切力，破壞了魚肌肉細胞或肌肉組織，使物料顆粒變小，比表面積增大，從而促進了肌原纖維蛋白的溶解[15-16]。

2.2 魚骨泥中肌原纖維蛋白粒徑及濁度的變化

濁度指標(biāo)可以粗略反映出蛋白質(zhì)聚集情況，與蛋白質(zhì)分子粒徑具有正相關(guān)性，同時也間接說明蛋白質(zhì)的變性程度[17]。目前普遍認為蛋白質(zhì)粒徑變化的原因主要是蛋白質(zhì)變性、伸展，使蛋白質(zhì)在疏水作用力、靜電力、氫鍵、范德華力和二硫鍵等作用下，蛋白質(zhì)分子之間聚集[18-19]，形成更大的蛋白質(zhì)分子顆粒。

表1 粉碎方式對骨泥中肌原纖維蛋白粒徑的影響Table 1 Effect of grinding procedures on the particle size of myof i brillar proteins in fi sh bone paste

圖2 粉碎方式對肌原纖維蛋白鹽溶液濁度的影響Fig. 2 Effect of grinding procedures on the turbidity of myof i brillar proteins in fi sh bone paste

魚骨泥加工過程中肌原纖維蛋白粒徑和濁度的變化如表1和圖2所示。細粉碎時，蛋白質(zhì)分子粒徑由340.5 nm降至299.4 nm，同時濁度也顯著降低。而隨著超微粉碎加工的進行，蛋白質(zhì)分子粒徑顯著增加（P＜0.05），由299.4 nm增至464.5 nm，同樣濁度也隨之升高。結(jié)合表2對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)分析可知，由于細粉碎（低剪切力）魚骨時處于水環(huán)境，使得蛋白質(zhì)具有一定的活動空間，在氫鍵和疏水作用力下，由開始的β-折疊、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，減少疏水基團的暴露，降低了蛋白質(zhì)聚集的可能性，減小了蛋白質(zhì)分子粒徑。而隨著粉碎程度的加深，肌原纖維蛋白受到超微粉碎機強大的剪切力，破壞了α-螺旋結(jié)構(gòu)，使其蛋白質(zhì)變性伸展，形成β-折疊、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，進而在疏水基團的作用下相互聚集，形成了較大的蛋白質(zhì)分子顆粒[20]。

2.3 魚骨泥中肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化

巰基是蛋白質(zhì)重要的功能性基團之一。許多研究發(fā)現(xiàn)，在肌原纖維蛋白的天然構(gòu)象中包含著大量活性巰基基團[21]。不同粉碎形式對魚骨泥中肌原纖維蛋白活性巰基的影響如圖3所示。粗粉碎樣品中肌原纖維蛋白的活性巰基含量最多，此時破碎程度較小，活性巰基氧化程度較低。經(jīng)過細粉碎后活性巰基含量急劇減少（P＜0.05），與粗粉碎相比下降了26%。這可能是采用膠體磨細粉碎時，由于加水緣故，導(dǎo)致肌原纖維蛋白處于水溶液中，高速剪切力作用下，活性巰基發(fā)生氧化，從而使其含量減少。而超微粉碎1～2 次會導(dǎo)致活性巰基含量小幅度提高（P＜0.05），可能是超微細粉碎在一定程度上破壞了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，使得已經(jīng)包埋在分子內(nèi)部的巰基重新暴露出來。Poowakanjana等[22]報道了狹鱈、牙鱈和金線魚3種魚糜在低溫斬拌過程中，表面活性巰基含量隨著斬拌時間的延長而增加，認為斬拌這一加工過程破壞了肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，使活性巰基得以暴露出來，這與本研究結(jié)果有一致之處。超微粉碎3 次后，魚骨泥中肌原纖維蛋白活性巰基含量再一次下降，可能是隨著粉碎次數(shù)的增加，暴露出來的巰基進一步氧化形成二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性[23]。

圖3 粉碎方式對肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響Fig. 3 Effect of grinding procedures on the active sulfhydryl content of myof i brillar proteins in fi sh bone paste

2.4 魚骨泥中肌原纖維蛋白表面疏水性的變化

圖4 粉碎方式對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 4 Effect of grinding procedures on the surface hydrophobicity of myof i brillar proteins in fi sh bone paste

表面疏水性表明蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團的暴露程度。表面疏水基團暴露的越多，肌原纖維蛋白的表面疏水性越大，肌原纖維蛋白分子越有可能發(fā)生聚合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子不可逆的變性[24-25]。魚骨泥加工過程中肌原纖維蛋白表面疏水性的變化如圖4所示。細粉碎后，魚骨泥中肌原纖維蛋白疏水性顯著下降（P＜0.05），可能是蛋白質(zhì)分子處于水溶液中，疏水性作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子疏水性基團以及疏水性氨基酸殘基的埋藏，進而表面疏水性基團減少，疏水性下降。而超微粉碎工序再一次提高了肌原纖維蛋白的疏水性，但粉碎次數(shù)超過2 次時，疏水性又顯著降低（P＜0.05），并且低于細粉碎時蛋白質(zhì)的疏水性。由于超微粉碎強大的剪切力，破壞了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，使得埋藏的疏水基團再一次部分暴露出來，使疏水性增加。Multilangi等[26]認為由于蛋白質(zhì)的伸展變性，使埋藏在內(nèi)部的分子結(jié)構(gòu)暴露出來，導(dǎo)致疏水性的增加。但隨著粉碎次數(shù)增加，暴露在蛋白質(zhì)表面的疏水性基團增加，促使蛋白質(zhì)分子在水溶液中發(fā)生聚集，導(dǎo)致疏水基團重新被包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，從而降低了蛋白質(zhì)表面疏水性[27]。肌原纖維蛋白表面疏水性的降低，一定程度上有利于其溶解度的增加，這與前面超微粉碎后溶解度的變化結(jié)果相一致。

2.5 魚骨泥中肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化

表2 粉碎方式對骨泥中肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 2 Effect of grinding procedures on the secondary structures of myof i brillar proteins in fi sh bone paste

通過對傅里葉紅外光譜得到的圖譜中酰胺Ⅰ帶進行去卷積、擬合以及二階求導(dǎo)后，得到肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量，結(jié)果如表2所示，其中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角對應(yīng)的峰值分別為1 650～1 658、1 600～640、1 660～l 695 cm－1[28-30]。由表2可知，經(jīng)細粉碎后肌原纖維蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量顯著增加，由64.21%增加到79.99%，而β結(jié)構(gòu)所占比例顯著下降，β-折疊比例由14.62%降低至11.61%，β-轉(zhuǎn)角比例由21.17%降低至8.39%。隨著超微粉碎次數(shù)的增加，α-螺旋比例呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，由79.99%降至64.94%；而β-轉(zhuǎn)角比例持續(xù)增加，由8.39%升高至20.18%；β-折疊比例由11.61%增加至17.44%，之后又有所降低?？梢?，細粉碎和超微粉碎可以破壞魚骨泥中肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)。細粉碎后α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量增加的原因可能是粉碎時物料需要呈流體狀態(tài)，故加入了4 倍體積的冰水，肌原纖維蛋白具有較大的伸展空間，暴露出較多的α-螺旋結(jié)構(gòu)。超微粉碎強大的剪切力，再次破壞了肌原纖維蛋白穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)，使其部分轉(zhuǎn)變成β結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

加工工藝對魚骨泥中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)影響顯著，其中濕法超微粉碎對骨泥中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)影響較大，而膠體磨對蛋白結(jié)構(gòu)影響相對較小。

逐級粉碎可以顯著提高魚骨泥中肌原纖維蛋白的溶解度；在膠體磨剪切力作用下，肌原纖維蛋白粒徑顯著減少，而經(jīng)超微粉碎后，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和聚集作用，肌原纖維蛋白粒徑會顯著增加，濁度也隨之升高；細粉碎后活性巰基含量和表面疏水性均顯著降低，但隨著超微粉碎次數(shù)增加，活性巰基含量、表面疏水性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；細粉碎使肌原纖維蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)比例增加、β結(jié)構(gòu)比例下降，而超微粉碎可破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)，使α-螺旋結(jié)構(gòu)比例降低，β結(jié)構(gòu)比例增加。

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Changes in Structural Properties of Myof i brillarlar Proteins during the Processing of Fish Bone Paste

LI Xuepeng1, ZHOU Mingyan1, LI Cong1, ZHU Wenhui1, YI Shumin1, LI Jianrong1,*, LI Yujin2, ZHAO Wei3, XU Jiayi1, JIAO Xueqing1
(1. National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, College of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. Rongcheng Taixiang Food Co. Ltd., Rongcheng 264300, China; 3. Dalian Tianbo Green Food Co. Ltd., Dalian 116001, China)

Superf i ne fi sh bone paste was prepared by sequentially using colloid mill grinding and wet superf i ne grinding. Myof i brillarlar proteins from fi sh bone paste were extracted to investigate the changes in structural properties during the processing of bone paste through the determination of solubility, particle size, turbidity, active sulfhydryl content, surface hydrophobicity, and secondary structures. The results showed that processing methods signif i cantly affected myof i brillar proteins in fish bone paste, and wet superfine grinding showed a bigger impact on structural properties of myofibrillar proteins than colloid mill grinding. The solubility of myofibrillar proteins was enhanced after sequential grinding. The particle size reduced under the shear stress of colloid mill grinding, and then increased obviously from 299.4 to 464.5 nm after wet superf i ne grinding, accompanied with an increase in turbidity. The active sulfhydryl content and surface hydrophobicity were decreased after colloid mill grinding, but both of them fi rstly rosed then declined with the increase of wet superf i ne grinding time. The proportion of α-spiral in secondary structure increased from 64.21% to 79.99%, while β structure proportion decreased after colloid mill grinding, and wet superf i ne grinding could degrade part of the α-spiral structure and turned it into β structure.

fi sh bone paste; colloid mill grinding; wet superf i ne grinding; myof i brillarlar protein; structural properties

10.7506/spkx1002-6630-201707013

TS254.4

A

1002-6630（2017）07-0077-05

2016-03-13

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD17B03）；遼寧省科技廳農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計劃項目（2015103020）；山東省泰山學(xué)者藍色產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才團隊支撐計劃項目（魯政辦字（2015）19號）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410167000049）

李學(xué)鵬（1982—），男，副教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品貯藏加工。E-mail：xuepengli8234@163.com

*通信作者：勵建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品貯藏加工與食品安全。E-mail：lijr6491@163.com

李學(xué)鵬, 周明言, 李聰, 等. 魚骨泥殘留肌原纖維蛋白在加工過程中結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的變化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 77-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707013. http://www.spkx.net.cn

LI Xuepeng, ZHOU Mingyan, LI Cong, et al. Changes in structural properties of myofibrillarlar proteins during the processing of fish bone paste[J]. Food Science, 2017, 38(7): 77-81. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201707013. http://www.spkx.net.cn