微波提取對(duì)胡蘿卜中的多糖基本結(jié)構(gòu)特征及固體形貌的影響

萬宇俊，殷軍藝，聶少平，石惠方，謝明勇*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

微波提取對(duì)胡蘿卜中的多糖基本結(jié)構(gòu)特征及固體形貌的影響

萬宇俊，殷軍藝，聶少平，石惠方，謝明勇*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

研究微波提取對(duì)胡蘿卜中的多糖基本結(jié)構(gòu)特征及固體形貌的影響。采用沸水浴、微波兩種方式提取胡蘿卜中的多糖（分別記為WEP和MEP），通過基本理化性質(zhì)測(cè)定、高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）和單糖組成分析等方法比較了兩者的基本結(jié)構(gòu)特征，并采用掃描電子顯微鏡對(duì)兩者的固體形貌進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，WEP和MEP的中性糖、糖醛酸和總酚含量存在差異，兩者均由半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖組成，但MEP總糖含量更高并含有更多果膠類單糖；WEP和MEP的HPSEC圖有一定相似性，但WEP中含有重均分子質(zhì)量高達(dá)7.77×105D的組分；WEP表現(xiàn)較為聚集的片狀結(jié)構(gòu)，而MEP組分則表現(xiàn)較為分散且主要為小片段狀態(tài)。上述結(jié)果表明，兩種不同提取方法所得到的多糖具有顯著差異。

胡蘿卜；多糖；微波提??；基本結(jié)構(gòu)特征；固體形貌

胡蘿卜，又稱紅蘿卜或甘荀，為傘形科草本植物胡蘿卜（Daucus carota L.）的肉質(zhì)根。胡蘿卜中富含胡蘿卜素、胡蘿卜多糖等食品功能成分[1]。研究表明，胡蘿卜多糖具有良好的抗氧化及抗菌特性[2]；此外，胡蘿卜多糖在抗炎[2]、降血糖[3]、抑制脂肪肝[4]等方面的作用也有相關(guān)研究進(jìn)行報(bào)道。胡蘿卜多糖的良好功能活性被廣泛研究報(bào)道，但傳統(tǒng)的胡蘿卜多糖提取方法因耗時(shí)長(zhǎng)、得率低、流程復(fù)雜等使得其工業(yè)化生產(chǎn)困難。

微波輔助提取技術(shù)具有節(jié)能、省時(shí)、有效成分得率高等特點(diǎn)[5]，在天然產(chǎn)物提取方面具有較好的應(yīng)用前景，有研究將該技術(shù)用于多糖提取[6]。將微波輔助提取應(yīng)用到胡蘿卜多糖提取中能夠有效地提高胡蘿卜多糖的得率，同時(shí)節(jié)省提取時(shí)間[7]，但是通過微波提取的多糖和傳統(tǒng)工藝提取得到的多糖在基本結(jié)構(gòu)特征及固體形貌方面的差異卻鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以新鮮胡蘿卜為原料，分別采用沸水浴加熱提取及微波輔助提取，從中提取、制備得到兩種胡蘿卜多糖，然后通過基本理化指標(biāo)測(cè)定、高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）、單糖組成分析、傅里葉紅外光譜及掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）方法對(duì)兩種多糖的基本結(jié)構(gòu)特征及固體形貌方面進(jìn)行比較，旨在探討微波輔助提取對(duì)胡蘿卜多糖基本結(jié)構(gòu)特征及固體形貌的影響，為胡蘿卜多糖的提取技術(shù)選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮胡蘿卜購于江西省南昌市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品（L-巖藻糖、鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-核糖、D-果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）、醋酸鈉 美國Sigma公司；牛血清白蛋白 美國Amersco公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、溴化鉀（光譜純） 德國Fluka公司；95%食用級(jí)酒精、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚、咔唑、沒食子酸、福林-酚、硝酸鈉和疊氮鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS-6微波消解儀 法國CEM公司；多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀（配有DAWN HELEOS Ⅱ型十八角度激光光散射儀、Optlab T-rEX干涉型示差折光檢測(cè)器、ViscoStar黏度檢測(cè)器） 美國Wyatt公司；Dionex ICS 5000型離子色譜儀 美國Dionex公司；Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司；JSM 6701F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（帶能譜儀） 日本電子株式會(huì)社；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；ALPHA 1-2冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 胡蘿卜多糖制備

1.3.1.1 胡蘿卜原材料處理

將新鮮的胡蘿卜洗凈、切絲，放入60 ℃烘箱過夜烘干，烘干后的樣品經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過100 目篩，收集的胡蘿卜粉末置于干燥器中備用。

1.3.1.2 恒溫沸水浴法提取胡蘿卜多糖及其制備

取適量胡蘿卜粉末，按照料液比為1∶60（m/V）、提取溫度為100 ℃、提取時(shí)間為2 h的條件進(jìn)行胡蘿卜多糖的提取。提取所得上清液經(jīng)真空濃縮至原體積1/5后，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃條件下醇沉過夜，離心去除上清液，得到胡蘿卜粗多糖[8]。采用Sevag法[9]對(duì)胡蘿卜粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，脫蛋白后的多糖溶液于4 ℃條件下透析72 h。透析后的多糖進(jìn)行二次醇沉，離心后到的沉淀利用無水乙醚、丙酮分別潤(rùn)洗兩次，凍干后得到胡蘿卜多糖，記為WEP（water extracted polysaccharide）。

1.3.1.3 微波提取胡蘿卜多糖及其制備

取適量胡蘿卜粉末，在料液比1∶60（m/V）、提取溫度100 ℃、微波功率2 000 W、提取時(shí)間15 min的條件下進(jìn)行胡蘿卜多糖的提取。提取所得上清液按照1.3.1.2節(jié)中方法制備得到微波提取的胡蘿卜多糖，記為MEP（microwave extracted polysaccharide）。

1.3.2 總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、總酚含量的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[10]測(cè)定多糖中的總糖含量；以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用咔唑-硫酸法[11]測(cè)定多糖中糖醛酸含量；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法[12]測(cè)定多糖中蛋白質(zhì)含量；以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu法[13]測(cè)定多糖中總酚含量。

1.3.3 多糖提取物純度和分子質(zhì)量測(cè)定

利用0.1 mol/L NaNO3（含0.2 mg/mL NaN3）溶液在室溫條件下將多糖樣品重復(fù)溶解，樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，并用0.2 μm水系濾膜過濾待后續(xù)進(jìn)樣分析。

色譜條件：0.1 mol/L NaNO3（含0.2 mg/mL NaN3）溶液為流動(dòng)相，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量為100 μL，色譜柱為Ohpak SB-G保護(hù)柱（6 mm×50 mm，10 μm）、Ohpak SB-806 HQ型色譜柱（8 mm×300 mm，13 μm）與Ohpak SB-804 HQ型色譜柱（8 mm×300 mm，10 μm）串聯(lián)使用，柱溫箱溫度為35 ℃。數(shù)據(jù)采集軟件為ASTRA 6.0，樣品數(shù)據(jù)分析前利用葡聚糖（Mw＝40 000 D，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品采集數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的歸一化處理[14]。

1.3.4 單糖組成分析

稱取5 mg樣品至20 mL具塞試管中，冰浴條件下緩慢加入0.5 mL 12 mol/L H2SO4，磁力攪拌0.5 h，取出后加入2.5 mL超純水稀釋，轉(zhuǎn)移至100 ℃油浴中充分水解4 h；水解完全后迅速置于冰浴中冷卻。將水解液稀釋100 倍過0.2 mm水系濾膜后利用Dionex ICS 5000型離子色譜儀進(jìn)行分析[15]。

色譜條件[16]：CarboPac? PA20分析柱（3 mm×150 mm），流動(dòng)相A為250 mmol/L NaOH溶液，B為超純水，C為1 mol/L乙酸鈉溶液，梯度洗脫，洗脫程序如表1所示，流速為0.5 mL/min。

表1 單糖和糖醛酸的洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for the separation of monosaccharide and uronic acid

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

取適量經(jīng)過真空干燥后的多糖樣品與KBr粉末混勻后壓片，利用Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜掃描[17]。

1.3.6 SEM分析

取微量多糖樣品通過導(dǎo)電帶吸附到樣品臺(tái)上，經(jīng)過噴金處理后利用場(chǎng)發(fā)射SEM（帶能譜儀）進(jìn)行觀察分析[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 23.0軟件，采用單樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取物基本成分分析

表2 WEP、MEP基本成分分析（n＝3，±s）Table 2 Physicochemical properties of WEP and MEP (n= 3,±s)

表2 WEP、MEP基本成分分析（n＝3，±s）Table 2 Physicochemical properties of WEP and MEP (n= 3,±s)

注：同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。表4同。

組分中性糖含量糖醛酸含量蛋白質(zhì)含量總酚含量WEP70.50±0.42a30.45±0.35b1.92±0.11a0.09±0.15bMEP66.35±0.30b35.72±0.57a1.02±0.10b0.26±0.13a

從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，兩個(gè)多糖樣品的中性糖與糖醛酸含量之和均大于100%，這是由于在采用苯酚-硫酸法測(cè)定中性糖的過程中，糖醛酸同樣會(huì)有部分顯色反應(yīng)發(fā)生[19]，導(dǎo)致測(cè)得的中性糖含量偏高，從而使兩者之和大于100%。此外，從表2還可看出，WEP中的糖醛酸含量及總酚含量比MEP中含量要低，但是WEP中的中性糖含量比MEP要高；基本成分含量的差異初步表明了微波對(duì)多糖會(huì)有一定影響，導(dǎo)致兩者在理化性質(zhì)上的差異。

2.2 HPSEC檢測(cè)

HPSEC-激光光散射儀聯(lián)用不僅可以得到聚合物的重均分子質(zhì)量（Mw），同時(shí)還可以得到數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）、多分散度（Mw/Mn）和均旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）等一系列聚合物構(gòu)象參數(shù)[14]。由HPSEC結(jié)果可知，WEP組分較MEP組分更為復(fù)雜；同時(shí)通過ASTRA軟件分析得到的結(jié)果可以看出，WEP主要由3 個(gè)組分組成，其對(duì)應(yīng)的Mw分別為：7.77×105、1.06×105、1.61×104D；MEP主要由兩個(gè)組分組成，其對(duì)應(yīng)的Mw分別為：1.59×105、9.95×103D，回收率分別為：54.2%、27.8%。通過比較可知：WEP和MEP的HPSEC圖譜有一定相似性，但WEP的分子質(zhì)量比MEP要高。此結(jié)果與Yoo等[20]的結(jié)論相吻合。

圖1 HPSEC光譜圖（示差信號(hào)）Fig. 1 HPSEC chromatograms of WEP and MEP

表3 HPSEC分析結(jié)果Table 3 Analytical results of WEP by HPSEC

2.3 單糖組成分析

通過離子交換色譜對(duì)WEP、MEP進(jìn)行了單糖組成分析。圖2顯示了11 種單糖標(biāo)準(zhǔn)和WEP、MEP的單糖組成色譜圖，根據(jù)不同單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到WEP由半乳糖醛酸GalA（19.01%）、半乳糖Gal（18.11%）、葡萄糖Glc（11.11%）、阿拉伯糖Ara（8.38%）、鼠李糖Rha（1.62%）組成，MEP由Gal（31.54%）、GalA（19.10%）、Ara（11.47%）、Rha（4.81%）、Glc（4.81%）組成。WEP主要含有GalA、Gal、Glc等單糖，而MEP主要含有Gal、GalA、Ara等果膠類單糖。以上結(jié)果表明兩種不同方法提取得到的WEP與MEP組分在單糖組成含量上有所差異，Yan Yajuan等[21]研究也表明傳統(tǒng)熱水浸提與微波提取得到的兩組分多糖在單糖組成上有差異。

圖2 單糖組成色譜圖Fig. 2 HPAEC chromatography

表4 HPAEC分析結(jié)果（n＝3，xs）Table 4 HPAEC analysis of monosaccharides (n= 3,±s)

表4 HPAEC分析結(jié)果（n＝3，xs）Table 4 HPAEC analysis of monosaccharides (n= 3,±s)

組分Rha含量Ara含量Gal含量Glc含量GalA含量WEP1.62±0.15b8.38±0.33b18.11±0.68b11.11±0.57a19.01±0.17baMEP4.81±0.95a11.47±0.40a31.54±0.68a4.81±0.01b19.10±1.76a

2.4 傅里葉紅外光譜特征

圖3 WEP、MEP紅外光譜圖Fig. 3 Infrared spectra of WEP and MEP

從兩種多糖的傅里葉紅外光譜圖（圖3）中可以得到相關(guān)結(jié)構(gòu)特征信息：在3 400 cm-1附近的較寬且吸收較強(qiáng)的峰應(yīng)該是糖類的O—H伸縮振動(dòng)；在2 800～3 000 cm-1范圍內(nèi)的較弱吸收峰一般是甲基或亞甲基的C—H伸縮振動(dòng)；2 300 cm-1附近的較弱吸收峰一般由于測(cè)試環(huán)境中CO2存在所造成的；1 700 cm-1附近的吸收峰為—COOH中的C＝O吸收峰；1 620、1 400 cm-1附近的吸收峰分別是伯胺N—H鍵的彎曲、變角振動(dòng)；1 200 cm-1附近則是糖類的C—H變角振動(dòng)； 950～1 160cm-1范圍內(nèi)的吸收峰一般是由于吡喃環(huán)的伸縮振動(dòng)造成。因此WEP、MEP均具有典型的糖類特征吸收峰[15,22-23]，且二者均具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，故WEP、MEP的紅外光譜特征較為相似。

2.5 SEM表征

圖4 WEP、MEP的SEM圖譜Fig. 4 SEM images of of WEP and MEP

采用SEM表征WEP、MEP的形態(tài)變化情況，結(jié)果如圖4所示。WEP表現(xiàn)較為聚集的片狀結(jié)構(gòu)，而微波提取所得到的MEP則表現(xiàn)較為分散且主要為小片段狀態(tài)。通過SEM圖像可以看出兩者的固體形貌存在較大的差異，造成這種差異的原因可能是由于微波的高能量導(dǎo)致多糖的片狀、鏈狀結(jié)構(gòu)解聚成小分子片段[24]。

3 討 論

胡蘿卜分別經(jīng)過沸水浴提取、微波提取后得到的WEP和MEP存在較明顯的差異，具體表現(xiàn)在基本成分分析、單糖組成、分子質(zhì)量分布及固態(tài)形貌等方面。其中MEP的多酚含量為0.26%，是WEP中多酚含量的3 倍，這可能是微波提取的作用時(shí)間較短，對(duì)于極易被氧化的多酚類物質(zhì)起到了一個(gè)保護(hù)作用[25-27]，導(dǎo)致MEP中的總酚含量較WEP要高。WEP與MEP中的中性糖含量及糖醛酸含量有所差異，單糖組成分析表明在WEP組分中主要以GalA（19.01%）、Gal（18.11%）及Glc（11.11%）為主，而MEP中主要以Gal（31.54%）、GalA（19.10%）及Ara（11.47%）為主，這些結(jié)果初步表明兩種提取方法所得到的多糖有一定的差異[28-29]。同時(shí)WEP主要有3 個(gè)Mw分布，MEP主要有兩個(gè)Mw分布，結(jié)合HPSEC圖譜可以看出，MEP中的1.59×105、9.95×103D兩個(gè)Mw分布與WEP組分中1.06×105、1.61×104D這兩個(gè)Mw分布有一定的相似性，但是WEP組分中7.77×105D部分在MEP中并沒有出現(xiàn)；SEM圖像也表明MEP主要以小分子片段為主，而WEP則以片狀結(jié)構(gòu)及鏈狀結(jié)構(gòu)為主；但是通過傅里葉紅外圖譜可以看出兩者均具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)且兩者所存在的官能團(tuán)差異不是很大，所以微波提取過程中可能是由于微波的強(qiáng)穿透力導(dǎo)致多糖分子的解聚[30]，使得大分子的片段解聚成小分子片段，從而導(dǎo)致MEP分子質(zhì)量比WEP要小，同時(shí)造成兩者在單糖組成、中性糖及糖醛酸含量上有所差異。綜上所述，微波提取雖然給予了諸多方便，但是對(duì)于提取的產(chǎn)物還是會(huì)造成一定的影響，而經(jīng)過微波提取后的產(chǎn)物與傳統(tǒng)提取方式所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)差異性導(dǎo)致其對(duì)應(yīng)的活性變化，也有待于進(jìn)一步深入、系統(tǒng)研究。

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Impact of Microwave Extraction on Structural Characteristics and Morphology of Carrot (Daucus carota L.) Polysaccharide

WAN Yujun, YIN Junyi, NIE Shaoping, SHI Huifang, XIE Mingyong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In this paper, we investigated the effect of microwave extraction on structural characteristics and morphology of polysaccharides from carrot. Boiling water bath and microwave were used to extract carrot polysaccharide (the resulting products were denoted as WEP and MEP respectively). A comparative evaluation was made of the basic physical and chemical properties of the two polysaccharides. High size exclusion chromatography (HPSEC), monosaccharide composition analysis, and scanning electron microscope (SEM) were also used for the preliminary characterization of their morphology. The results showed that the contents of neutral sugar, uronic acid and total phenol were different in WEP and MEP. They were both composed of galacturonic acid, galactose, glucose, arabinose, and rhamnose, but the total sugar content of MEP was higher and contained more constituent monosaccharides of pectin. The HPSEC chromatogramsss of WEP and MEP had some similarity, but WEP exclusively contained a component with a relative molecular weight of up to 7.77 × 105D. WEP displayed a more aggregated sheet structure, and its components were more dispersed and mainly present as small fragments. According to the results above, the polysaccharides obtained from two different extraction methods had signif i cant differences.

carrot (Daucus carota L.); polysaccharide; microwave extraction; structural characteristics; morphology

10.7506/spkx1002-6630-201707001

TS201.1

A

1002-6630（2017）07-0001-05

萬宇俊, 殷軍藝, 聶少平, 等. 微波提取對(duì)胡蘿卜中的多糖基本結(jié)構(gòu)特征及固體形貌的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707001. http://www.spkx.net.cn

WAN Yujun, YIN Junyi, NIE Shaoping, et al. Impact of microwave extraction on structural characteristics and morphology of carrot (Daucus carota L.) polysaccharide[J]. Food Science, 2017, 38(7): 1-5. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707001. http://www.spkx.net.cn

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571826）；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目（SKLF-ZZA-201611）

萬宇俊（1993—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：wanyujun@yeah.net

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn