結(jié)扎腰動脈建立大鼠脊髓缺血模型有效性的評估

何祥中， 陳春美， 韋 浩， 張 帆

結(jié)扎腰動脈建立大鼠脊髓缺血模型有效性的評估

何祥中1， 陳春美2， 韋 浩1， 張 帆1

目的 結(jié)扎腰動脈建立大鼠脊髓缺血模型，為研究缺血性脊髓病、繼發(fā)性脊髓損傷的發(fā)生機(jī)制提供良好的載體。 方法 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(僅分離出腰動脈)和脊髓缺血組(結(jié)扎所有腰動脈)，于術(shù)后進(jìn)行大鼠后肢運動功能BBB評分、脊髓蘇木精-伊紅(H-E)染色鏡下觀察及Caspase-3免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果 術(shù)后48 h對缺血組大鼠后肢運動功能BBB評分為(9.22±0.97)，與對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；H-E染色鏡下可見脊髓缺血組大鼠正常神經(jīng)元數(shù)目明顯減少；免疫組織化學(xué)顯示Caspase-3陽性細(xì)胞呈棕黃色，脊髓缺血組陽性率遠(yuǎn)大于假手術(shù)組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論 通過結(jié)扎大鼠腰動脈可以建立穩(wěn)定的脊髓缺血模型，為脊髓缺血后損傷機(jī)制和預(yù)防措施的研究提供良好的載體。

動脈； 脊髓缺血； 模型，動物

脊髓缺血疾病常見于脊柱脊髓損傷、胸腹主動脈瘤手術(shù)或血栓性疾病等，其發(fā)病率也呈逐漸增高的趨勢。目前國內(nèi)外關(guān)于脊髓缺血再灌注動物模型制作方法種類繁多，制作動物模型的研究雖不斷改進(jìn)，但仍是當(dāng)前國內(nèi)外致力探討的課題[1]。Kwun等首次通過結(jié)扎兔腰動脈建立了脊髓缺血模型，這個模型的最大優(yōu)點就是避免了因阻斷腹主動脈所產(chǎn)生的內(nèi)臟及后肢損傷[2]。本研究擬在Kwun的脊髓缺血模型及本課題組前期對大鼠腰動脈解剖研究基礎(chǔ)上[3]，通過結(jié)扎大鼠5根腰動脈建立脊髓模型，并進(jìn)行大鼠后肢運動功能BBB評分、脊髓蘇木精-伊紅(H-E)染色鏡下觀察及Caspase-3免疫組織化學(xué)檢測等評估，旨在建立穩(wěn)定的大鼠脊髓缺血模型，為研究缺血性脊髓病、繼發(fā)性脊髓損傷的發(fā)生機(jī)制提供良好的載體。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級純系健康雄性SD大鼠(上海斯萊克實驗動物中心,許可證號:SCXK 滬2012-0008)，體質(zhì)量300～350 g；兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(北京中杉金橋生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 將20只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和脊髓缺血組各10只(每組大鼠分別編號為1-10)。假手術(shù)組SD大鼠僅分離出腰動脈，不進(jìn)行結(jié)扎；脊髓缺血組分離出雙側(cè)所有腰動脈，并將其結(jié)扎。10%水合氯醛(0.35 mg/kg)將大鼠腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，取腹部左側(cè)切口，暴露腹主動脈，在顯微鏡下首先找到左腎動脈、髂腰動脈及薦中動脈，并依次找到5根腰動脈(圖1)，每根腰動脈用2根4#手術(shù)縫線結(jié)扎，靠中間剪斷，用綿片將大鼠腹腔血跡擦拭干凈，在顯微鏡下再次仔細(xì)觀察有無活動性出血。確認(rèn)無出血后，逐層縫合腹部肌肉、皮膚。假手術(shù)組只分離腰動脈，不結(jié)扎。術(shù)后脊髓缺血組大鼠每天肌內(nèi)注射青霉素(50 mg/kg)防止感染。按摩大鼠膀胱幫助其排尿。

1.2.2 行為學(xué)評分 術(shù)后48 h對2組大鼠后肢運動功能進(jìn)行BBB評分[4]，本實驗選用3名研究人員進(jìn)行評價，記錄結(jié)果后匯總。

1.2.3 H-E染色及免疫組織化學(xué)染色 BBB評分完成后取SD大鼠脊髓腰膨大標(biāo)本，于4%多聚甲醛固定 24 h，脫水、石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行H-E染色(光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓前角形態(tài))及免疫組織化學(xué)染色(隨機(jī)計算5個高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比)。

2 結(jié) 果

2.1 BBB評分 假手術(shù)組大鼠后肢活動自如，BBB評分為(20.57±0.50)；脊髓缺血組表現(xiàn)為偶見負(fù)重腳掌站立，無前后肢協(xié)調(diào)運動，BBB評分為(9.22±0.97)，二者比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A：腰動脈(L1、L2、L3、L4)、薦中動脈(Lmsa)、左腎動脈(LRA)及髂腰動脈(LIA)；B：第5腰動脈(L5)，腰動脈“Y”型分支(LY)，第三和第四腰動脈相互交錯(L3,4)；C：第三腰動脈缺如.圖1 大鼠腰動脈解剖定位及變異Fig 1 The anatomy location and variation of rat’s lumbar arteries

其中，1例脊髓缺血組于結(jié)扎腰動脈術(shù)后8 h死亡，發(fā)現(xiàn)后立即將其腹腔打開，發(fā)現(xiàn)腹腔積有大量血塊，并仔細(xì)解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)扎腰動脈的縫線脫落，由于腰動脈活動性大量出血，大鼠休克致死。

2.2 H-E染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠H-E切片脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，可見數(shù)個正常形態(tài)的神經(jīng)元，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞核居中，呈圓形，細(xì)胞核輪廓清晰，胞膜完整(圖2A)；脊髓缺血組可見正常神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，前角神經(jīng)元細(xì)胞核萎縮或溶解，呈凋亡和壞死樣改變(圖2B)。

A:假手術(shù)組; B：脊髓缺血組.圖2 假手術(shù)組和脊髓缺血組脊髓前角H-E染色( ×200)Fig 2 The sham operation group and spinal cord ischemia group spinal cord anterior horn( ×200)

2.3 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 假手術(shù)組大鼠免疫組織化學(xué)切片見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均無Caspase-3陽性細(xì)胞明顯表達(dá)(圖3A)；脊髓缺血組細(xì)胞胞質(zhì)中可見大量Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕黃色，細(xì)胞核也可見少量陽性細(xì)胞表達(dá)(圖3B)，表達(dá)陽性率為(82.1±7.41)%，遠(yuǎn)大于假手術(shù)組(1.82±0.74)%，二者比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A:假手術(shù)組; B：脊髓缺血組.圖3 假手術(shù)組和脊髓缺血組Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)(DAB ×200)Fig 3 The sham operation group and spinal cord ischemia group Caspase-3 positive expression(DAB ×200)

3 討 論

脊髓缺血性損傷疾病是常見病、多發(fā)病，是目前研究的熱點和難點之一。因此，建立理想的脊髓缺血損傷模型，闡明缺血性脊髓病、繼發(fā)性脊髓損傷的發(fā)生機(jī)制，為臨床救治提供指導(dǎo)具有重要意義。Zinvin等通過阻斷兔子腎動脈下腹主動脈方法所建立的脊髓缺血模型是較為常用的傳統(tǒng)脊髓缺血動物模型[2]。通過夾閉或者栓塞主動脈建立的脊髓缺血模型最大的優(yōu)點就是能夠完全阻斷脊髓的供血動脈，使動物模型雙下肢出現(xiàn)癱瘓，操作簡單[5-6]。但這些模型也存在明顯的缺點，因為把主動脈阻斷后會產(chǎn)生內(nèi)臟及后肢不可避免的損傷，對實驗指標(biāo)的準(zhǔn)確觀察產(chǎn)生了很大的影響。在眾多脊髓缺血模型當(dāng)中，Kwun等學(xué)者通過結(jié)扎兔腹主動脈腎臟以下的腰動脈所建立的脊髓缺血模型是比較符合臨床上脊髓缺血的特點，與傳統(tǒng)的脊髓缺血動物模型相比具有較大的優(yōu)點，避免了因阻斷腹主動脈所產(chǎn)生的內(nèi)臟損傷及后肢功能障礙，而且創(chuàng)傷較少。但是由于兔子飼養(yǎng)相對較困難，價格昂貴，并且市場上目前用于兔研究的相關(guān)抗體較少。鑒于大鼠具有成本低、種系內(nèi)純合性好、抗感染和生命力強(qiáng)，價格便宜、容易飼養(yǎng)管理等特點，筆者前期已對大鼠的腰動脈進(jìn)行了詳細(xì)的解剖，為通過結(jié)扎腰動脈建立大鼠脊髓缺血模型提供了相關(guān)解剖學(xué)基礎(chǔ)。

BBB評分法不是采用多項累計加分的方式，而是采用單個獨立觀察者對應(yīng)單個相應(yīng)分值的方式，且BBB評分的各個觀察點包括了更為詳細(xì)的特征和細(xì)節(jié)說明，所以BBB評分的判斷結(jié)果更為客觀和準(zhǔn)確，結(jié)果可靠。當(dāng)SD大鼠腰動脈都被阻斷后，導(dǎo)致大鼠脊髓的血供減少，出現(xiàn)脊髓缺血性損傷，大鼠表現(xiàn)為后肢運動功能障礙。通過大鼠H-E切片結(jié)果可以看出，SD大鼠腰動脈都被阻斷后，由于大鼠脊髓的血供減少，腰段脊髓前角運動神經(jīng)元發(fā)生凋亡和壞死，才導(dǎo)致大鼠表現(xiàn)為后肢運動功能的障礙。脊髓缺血組大鼠免疫組織化學(xué)切片可見Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕黃色，表達(dá)陽性率遠(yuǎn)大于假手術(shù)組，二者差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步說明，脊髓缺血可導(dǎo)致脊髓前角運動神經(jīng)元發(fā)生凋亡和壞死，導(dǎo)致后肢功能障礙。韓亞新等研究證實：大鼠脊髓缺血再灌注損傷后Caspase-1,Caspase-3及TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)明顯，說明脊髓缺血再灌注損傷后存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡，Caspase-1及Caspase-3均參與損傷的調(diào)節(jié)，并可以作為大鼠脊髓缺血損傷的評價指標(biāo)[7]，這與本研究結(jié)果一致。結(jié)合BBB評分結(jié)果、H-E染色及免疫組織化學(xué)結(jié)果，可以看出SD大鼠腰動脈都被阻斷后，導(dǎo)致大鼠脊髓的血供減少，腰段脊髓前角運動神經(jīng)元發(fā)生凋亡和壞死，進(jìn)一步導(dǎo)致大鼠表現(xiàn)為后肢運動功能的障礙。同時，也說明通過結(jié)扎大鼠腰動脈所建立的脊髓缺血模型是穩(wěn)定可靠的。

通過對SD大鼠的腰動脈解剖研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腰動脈從腹主動脈的背面發(fā)出，共有5根，第一根位于左腎動脈略上方，第二根位于左腎動脈略下方，第三根和第四根通常位于髂腰動脈附近，且彼此之間距離很近，第五根發(fā)自薦中動脈背面，薦中動脈起于腹主動脈背側(cè)末端；第三根和第四根腰動脈比較特殊，存在一些變異情況；可見腰動脈自腹主動脈發(fā)出后，在進(jìn)入肌肉或即將進(jìn)入肌肉可分為上下兩支，呈“Y”型；5根腰動脈分別分布于腰肌及腰方肌，其較大的終支伴隨脊神經(jīng)經(jīng)椎間孔進(jìn)入脊髓，匯入脊髓的前、后正中動脈，參與脊髓的供血，與人體基本相似。所以，通過結(jié)扎SD大鼠5根腰動脈建立了脊髓缺血模型。脊髓缺血組10只SD大鼠，其中1例于結(jié)扎腰動脈術(shù)后8 h死亡，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)扎腰動脈的縫線脫落，腰動脈活動性大量出血，導(dǎo)致大鼠休克致死，說明在制作脊髓缺血模型的時候要認(rèn)真止血。該模型也存在一定的局限性。由于大鼠的腰動脈相對比較細(xì)小，肉眼下進(jìn)行結(jié)扎腰動脈有些困難，較容易損傷到腰動脈，所以需在顯微鏡下操作。結(jié)扎大鼠5根腰動脈可以建立穩(wěn)定的脊髓缺血模型，且大鼠具有成本低、種系內(nèi)純合性好、抗感染和生命力強(qiáng)，價格便宜、容易飼養(yǎng)管理等特點，可為脊髓缺血后損傷機(jī)制和預(yù)防措施的研究提供良好的載體。

[1] 曾 俊,方 華,王泉云,等.兔脊髓缺血再灌注損傷的病理特征變化[J].四川醫(yī)學(xué),2007,28(5)：468-470.

[2] Kwun B D,Vacanti F X. Mild hypothermia protects against irreversible damage during prolonged spinal cord ischemia[J].JSurgRes,1995,59(6):780-782.

[3] 韋 浩,陳春美,王春華,等.大鼠腰動脈解剖在脊髓缺血模型中的應(yīng)用[J].中華實驗外科雜志,2013,30(9)：1859-1860.

[4] Basso D M,Beattie M S,Bresnahan J C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].JNeurotrauma,1995,12(1):1-21.

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[7] 韓亞新,王巖峰,屠冠軍. 大鼠脊髓缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-1、Caspase-3的表達(dá)[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展,2011,17(6):559-561, 565.

(編輯:張慧茹)

Evaluation of the Effectiveness of Lumbar Spinal Cord Ischemia in Rats

HE Xiangzhong1, CHEN Chunmei2, WEI Hao1, ZHANG Fan1

1. Department of Neurosurgery,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350009,China; 2. Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001,China

Objective To evaluate a mouse model produced by ligation of the lumbar arteries for study of spinal cord diseases and spinal cord injury. Methods SD rats were divided into the sham operation group and spinal cord ischemia group. In the spinal cord ischemia group the lumbar arteries were ligated while in the sham operation group we only separated out all lumbar arteries. BBB scoring of motor function of hindlimb of rats, the hematoxylin-eosin staining (H-E) and immunohistochemistry test were performed after the vascular ligation or the separation of the arteries. Results BBB score of motor function of hind limb of rats 48 hours after vascular ligation was (9.22±0.97), which was statistically significantly different than the BBB score in the sham operation (P<0.01). The result of spinal cord ischemia HE was that the number of normal neuron decreased. Immunohistochemistry showed that the sham operation group had only a few scattered yellow-brown positive cells of Caspase-3, while the spinal cord ischemia group showed numerous and densely distributed positive cells, and the difference was statistically significant (P<0.01). Conclusion By ligating the lumbar arteries in the rats, we can make stable spinal cord ischemia models therefore are able to supply an ideal model for spinal cord diseases and spinal cord injury research.

arteries；spinal cord ischemia；models, animal

2016-07-15

福建醫(yī)科大學(xué) 1.附屬福州市第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，福州 350009；2.附屬協(xié)和醫(yī)院 神經(jīng)外科，福州 350001

何祥中,男，副主任醫(yī)師

陳春美. Email: 18359185784@qq.com

R332；R651.2

A

1672-4194(2017)01-0054-04