磁性殼聚糖的制備及在脂肪酶固定的應(yīng)用

王楠楠,張大準(zhǔn)，董發(fā)才

(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004)

磁性殼聚糖的制備及在脂肪酶固定的應(yīng)用

王楠楠,張大準(zhǔn)，董發(fā)才*

(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004)

采用共沉淀法制備磁性殼聚糖微球，戊二醛做交聯(lián)劑把脂肪酶固定在磁性殼聚糖載體上，分別使用掃描電子顯微鏡、傅立葉紅外光譜儀、X射線衍射儀、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、熱重分析儀等對(duì)磁性殼聚糖微球進(jìn)行表征分析，并檢測(cè)了固定化酶的特性. 結(jié)果表明,制備的磁性殼聚糖性能良好，與游離酶相比，固定化酶的最適pH，最適溫度均有提高，固定化酶的熱穩(wěn)定性，對(duì)變性劑的耐受力，重復(fù)使用性都有較大幅度提高.

磁性殼聚糖；脂肪酶；固定化酶

脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)又稱三脂酰甘油水解酶，能夠?qū)⒏视腿ニ鉃橹舅岷透视蚚1-2]. 隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)脂肪酶還能夠催化甘油三酯的醇解、脂肪酸的酯化、酰胺鍵的水解等反應(yīng). 基于脂肪酶的這些催化特性，目前已被廣泛地用于食品[3-4]、生物柴油[5-6]和藥物的拆分[7]等領(lǐng)域. 游離的脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用時(shí)存在分離純化等困難，一般為一次性使用，很難回收利用，增加工業(yè)成本[8]. 固定化技術(shù)可以解決以上問(wèn)題，固定化酶不僅保持了游離酶的高效性和專(zhuān)一性，同時(shí)增加了酶對(duì)溫度、酸堿、變性劑的耐受性，易于分離和重復(fù)使用，有效的降低了成本，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[9]. 殼聚糖(CS)具有生物相容性、生物親和性和無(wú)毒等特性，分子鏈上大量存在的羥基和氨基又使其易于進(jìn)行化學(xué)改性，常被作為磁性高分子材料的“外殼”而應(yīng)用于污水處理、醫(yī)藥和酶固定化等領(lǐng)域. 磁性殼聚糖微球作為一種新型功能高分子材料，已作為載體被廣泛應(yīng)用于酶的固定化領(lǐng)域. WANG等[10]采用乳化交聯(lián)法成功制備磁性殼聚糖微球固定化堿性蛋白酶. LIU等[11]應(yīng)用殼聚糖包覆的Fe3O4磁性納米粒子固定化木聚糖酶，固定化酶量達(dá)162.2 mg/g，顯示了較高結(jié)合酶的能力. CHEN等[12]使用磁性殼聚糖微球?qū)Ζ?半乳糖苷酶進(jìn)行固定化研究，分解乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖，產(chǎn)率可達(dá)到50.5%. 目前，磁性殼聚糖微球作為載體已經(jīng)應(yīng)用于淀粉酶，米糠內(nèi)源酶，酵母乙醇脫氫酶、蛋白酶、脂肪酶[13-17]等的固定化的應(yīng)用. 通常采用乳化交聯(lián)法制備磁性殼聚糖微球，但該方法使用了大量有機(jī)試劑，成本高、對(duì)人體有害、污染環(huán)境、操作復(fù)雜. 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)共沉淀法制備磁性殼聚糖微球得到性能良好的脂肪酶固定化載體，克服了以上缺點(diǎn)，并對(duì)固定化酶特性做了相關(guān)研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

AVATAR360型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó) Nicolet公司；X Pert Pro型X射線衍射儀，荷蘭Philips；JSM5600LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海恒科學(xué)儀器有限公司；LNG-T83型干燥箱；JJ-1型電動(dòng)攪拌器，金壇市科析儀器有限公司.

三羥甲基氨基甲烷(TRIS)購(gòu)于索萊寶公司；四水氯化亞鐵，戊二醛(體積分?jǐn)?shù)50%)均購(gòu)自阿拉丁公司；Candida rugosa lipase Type VII購(gòu)自Sigma公司；十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、異丙醇購(gòu)于天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖、4-硝基酚、三氯乙酸、乙二胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4-硝基苯基棕櫚酸酯購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；鹽酸購(gòu)自中平能化集團(tuán)開(kāi)封市東大化工有限公司；冰乙酸購(gòu)自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；六水三氯化鐵購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 方法

1.2.1 磁性殼聚糖微球的制備

稱取0.3 g殼聚糖加入250 mL三口燒瓶中，取15 mL的2%的冰醋酸溶液加入三口燒瓶中，攪拌使殼聚糖完全溶于冰醋酸溶液，分別稱取1.22 g六水三氯化鐵和0.5 g四水氯化亞鐵溶于30 mL 0.05 mol/L的稀鹽酸中，充分?jǐn)嚢柚谅然F和氯化亞鐵完全溶解后倒入三口燒瓶中，500 r/min攪拌使鐵鹽與殼聚糖冰醋酸溶液充分混合，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)50%的戊二醛200 r/min交聯(lián)1 h，加入1.3 mol/L氫氧化鈉至完全沉淀，將沉淀轉(zhuǎn)移至燒杯中用滅過(guò)菌的雙蒸水洗滌3次，然后磁分離和真空干燥，即可得到磁性殼聚糖微球(Fe3O4/CS).

1.2.2 磁性殼聚糖微球的活化和醛基含量測(cè)定

磁性殼聚糖微球的活化：稱取0.5 g磁性殼聚糖微球，分別加入10 mL濃度為0.55%的戊二醛溶液，對(duì)制備的磁性殼聚糖微球進(jìn)行活化.

醛基含量測(cè)定[18]：分別稱取0.1 g恒重干燥的磁性殼聚糖微球和活化后的磁性殼聚糖微球，加入到25 mL 0.25 mol/L的鹽酸羥胺-甲基橙溶液中，用玻璃棒攪拌使其充分接觸，室溫下反應(yīng)2 h后，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，當(dāng)溶液顏色由紅色變成黃色后停止滴定，記錄此時(shí)消耗的NaOH溶液體積. 將不加樣品，其他條件不變作為空白對(duì)照，記錄空白對(duì)照消耗的NaOH溶液體積. 使用空白對(duì)照校正樣品的滴定結(jié)果. 醛基的含量計(jì)算公式如下：

N: NaOH的濃度, mol/L;V0: 樣品消耗的NaOH溶液體積, mL;V1: 空白對(duì)照消耗的NaOH溶液體積, mL;W: 樣品的質(zhì)量, g.

1.2.3 脂肪酶的固定

稱取0.5 g磁性殼聚糖微球置于100 mL的三口燒瓶中，加入10 mL 0.35%的戊二醛溶液與磁性殼聚糖微球于30 ℃，120 r/min交聯(lián)60 min，磁分離，棄上清保留沉淀，取滅過(guò)菌的雙蒸水洗滌沉淀物3次后加入10 mL一定濃度的脂肪酶pH 7.5的PBS緩沖液100 r/min反應(yīng)60 min，磁分離，分別檢測(cè)上清和固定化酶的活力.

1.2.4 脂肪酶活力測(cè)定[19]

酶活力單位定義: 在pH 7.5時(shí)，35 ℃條件下，每小時(shí)內(nèi)催化產(chǎn)生1 mmol對(duì)硝基酚需要的酶量為1個(gè)脂肪酶活力單位 (U).

具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[19]，其中終止反應(yīng)的三氯乙酸和中和反應(yīng)NaOH加入量均為5.2 mL.

固定化率=(固定化酶活力/加入游離酶的活力) ×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性殼聚糖微球的表征分析

2.1.1 熱重圖

磁性殼聚糖微球熱重分析如圖1所示. 100 ℃以下的失重可能是由于不同方法制備的磁性殼聚糖微球有少量的水份. 第二個(gè)失重階段在200～650 ℃溫度范圍內(nèi)，這部分的失重來(lái)源于殼聚糖的分解. 繼續(xù)升高溫度，曲線趨于平穩(wěn)，表明殼聚糖已經(jīng)完全分解. 此結(jié)果表明，制備的磁性殼聚糖微球中殼聚糖的含量在60%以上.

圖1 Fe3O4/CS微球的熱重分析圖Fig.1 TG curve of Fe3O4/CS microspheres

2.1.2 掃描電子顯微鏡 (SEM) 觀察

圖2 (A) 是Fe3O4的掃描電鏡圖，由圖可知Fe3O4粒子的微觀形貌呈不規(guī)則的類(lèi)球形，有輕微團(tuán)聚現(xiàn)象. 圖2 (B) 和圖2 (C) 中磁性殼聚糖微球表面凸凹不平，有孔狀片層，與Fe3O4粒子的微觀形貌有顯著差異，結(jié)合熱重分析的結(jié)果，說(shuō)明Fe3O4粒子表面包裹了殼聚糖形成了磁性殼聚糖復(fù)合微球.

(A) Fe3O4；(B) Fe3O4/CS； (C) 放大的Fe3O4/CS.圖2 掃描電鏡圖Fig.2 SEM photograph

2.1.3 傅立葉紅外譜圖

圖3為CS (a)，F(xiàn)e3O4(b) 與Fe3O4/CS微球 (c) 的FT-IR譜圖. 從圖3中可以看出，譜線 (b) 于588 cm-1有強(qiáng)吸收峰，此處對(duì)應(yīng)于Fe3O4中Fe-O特征伸縮振動(dòng)吸收峰. 譜線 (c) 在588 cm-1附近也有吸收峰，并且與譜線 (b) 中Fe3O4的特征吸收峰非常相似，說(shuō)明Fe3O4/CS微球中有Fe3O4，殼聚糖確實(shí)包埋了Fe3O4. 譜線 (a) 在3 431 cm-1附近有紅外吸收，這是-OH和-NH2的伸縮振動(dòng)峰，2 892 cm-1附近為殼聚糖中C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 084 cm-1附近為C-O峰. 譜線 (c) 中既出現(xiàn)了殼聚糖的特征吸收峰，又在1 649 cm-1處出現(xiàn)Shiff堿鍵C=N的特征吸收峰，說(shuō)明磁性微球的外層成功包埋了殼聚糖，并且交聯(lián)劑戊二醛和殼聚糖發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng).

圖3 CS (a), Fe3O4 (b) 與Fe3O4/CS微球 (c) 的FTIR譜圖Fig.3 FTIR spectra of CS (a) Fe3O4 (b), and Fe3O4/CS microspheres (c)

2.1.4 X射線衍射分析(XRD)

圖4所示 (a) 為磁性Fe3O4粒子的XRD譜圖，(b) 為Fe3O4/CS微球的XRD譜圖. 從圖4中可以看出，(a)磁性Fe3O4粒子的XRD圖譜沒(méi)有出現(xiàn)雜質(zhì)峰，是典型的單相四氧化三鐵的尖晶石結(jié)構(gòu). (b)Fe3O4/CS微球的在2θ角為30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57°、62.6°這6個(gè)典型的峰位置出現(xiàn)主要衍射峰，與(a)基本相同，表明磁性Fe3O4粒子被殼聚糖包埋修飾過(guò)后，其晶格結(jié)構(gòu)未變化.

圖4 Fe3O4 (a) 與Fe3O4/CS微球 (b) 的XRD譜圖Fig.4 XRD patterns of Fe3O4 (a) and Fe3O4/CS microspheres (b)

2.1.5 磁學(xué)特性

圖5中 (a) 是四氧化三鐵的磁滯回線，(b) 是磁性殼聚糖微球的磁滯回線. 從圖5中可以看出，磁性殼聚糖微球的比飽和磁化強(qiáng)度與四氧化三鐵相比，下降幅度較大，可能是因?yàn)榇罅康臍ぞ厶前裨谒难趸F表面，降低了磁性殼聚糖載體的比飽和磁化強(qiáng)度，間接證明了殼聚糖成功包埋了四氧化三鐵.

圖5 納米Fe3O4 (a)與Fe3O4/CS載體(b)的磁滯回線圖Fig.5 Hysteresis loop of Fe3O4 nanoparticles (a) and Fe3O4/CS carriers (b)

2.1.6 磁性殼聚糖微球醛基含量的測(cè)定

磁性殼聚糖微球醛基含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示，每克磁性殼聚糖材料中有0.89 mmol醛基；經(jīng)戊二醛活化后的磁性殼聚糖材料中，每克有1.46 mmol醛基，原因是戊二醛可以增加殼聚糖表面醛基，進(jìn)而使磁性殼聚糖中的醛基數(shù)目增加.

表1 磁性殼聚糖微球醛基含量的測(cè)定

2.2 固定化酶性質(zhì)測(cè)定

2.2.1 磁性殼聚糖微球固定化脂肪酶最適溫度測(cè)定

在溫度較低時(shí)，適當(dāng)增加溫度可以提高酶的活性，因?yàn)榇藭r(shí)酶分子的催化速度隨溫度的增加而增大. 但是脂肪酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶因構(gòu)像變化變性而失活. 因此必須在酶催化反應(yīng)活化速度和蛋白質(zhì)變性之間尋求一種平衡，探索酶活反應(yīng)溫度的最佳值. 由圖6可以看出，游離酶活力在35 ℃ 時(shí)最高，固定化酶的最適溫度為43 ℃，相比游離酶提高了8 ℃，原因可能是脂肪酶被固定到載體上后，載體束縛酶分子，對(duì)外界影響有一定屏蔽保護(hù)效果. 當(dāng)反應(yīng)溫度高于35 ℃，游離酶的活力開(kāi)始下降，固定酶的活力繼續(xù)上升，43 ℃后無(wú)論是游離酶還是固定酶活力均下降，因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致酶分子失活比例增大.

圖6 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of free and immobilized lipase

2.2.2 固定化酶最適pH

測(cè)定底物溶液pH為4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0時(shí)酶活，并在相同條件下測(cè)定對(duì)應(yīng)的游離酶酶活，以同組最高酶活為100%，其余酶活為與其比值，得到結(jié)果如圖7所示. 游離酶活力在pH為6.0時(shí)最高，固定化酶的活力在pH為7.5時(shí)最高，相比游離酶提高了1.5. 當(dāng)?shù)孜锶芤簆H低于6.0，游離酶和固定酶的活力均隨著pH的增大而增大，當(dāng)?shù)孜锶芤簆H在6.0到7.5之間時(shí)，游離酶的活力開(kāi)始下降，固定酶的活力繼續(xù)上升，在底物溶液pH大于7.5后，無(wú)論是游離酶還是固定酶活力均下降，但固定化酶的活力明顯高于游離酶，原因可能是磁性殼聚糖表面含有大量羥基，脂肪酶在被固定到載體的過(guò)程中，酶分子的構(gòu)象和酶分子活性中心一些官能團(tuán)的離子狀態(tài)發(fā)生改變，載體上過(guò)量的負(fù)電荷影響了酶活性中心和水質(zhì)子化的相互作用，增加了脂肪酶對(duì)堿性溶液的耐受性.

圖7 pH對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of free and immobilized lipase

2.2.3 固定化酶熱穩(wěn)定性

分別制備磁性殼聚糖載體固定化酶將其和對(duì)應(yīng)的游離酶置于60 ℃恒溫水浴鍋中保溫不同時(shí)間，定時(shí)取樣測(cè)量酶活，以同組最高酶活為100%，其余酶活為與其比值，繪制酶的熱穩(wěn)定曲線. 從圖8可以看出游離酶和固定酶活力均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，游離酶的相對(duì)活力比固定化酶下降速度更快，趨勢(shì)更明顯. 圖8中游離酶在60 ℃保溫120 min時(shí)游離酶活力剩余14.8%，而固定化酶活力是42%. 在相同溫度保溫相同時(shí)間后，固定化酶活力明顯高于游離酶，表現(xiàn)出更強(qiáng)的溫度耐受性. 原因可能是脂肪酶被固定到載體的過(guò)程中，酶分子之間，酶與載體之間通過(guò)共價(jià)鍵、分子間作用力等相互作用，增強(qiáng)固定化酶分子的結(jié)構(gòu)剛性，提高其耐高溫的能力，而游離酶缺乏這些相互作用力，容易在高溫條件下酶分子結(jié)構(gòu)改變而變性[20].

圖8 脂肪酶的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of the free and the immobilized lipase

2.2.4 固定化酶抗變性

尿素是一種常用的蛋白質(zhì)變性劑，蛋白質(zhì)分子中的肽鏈以一定的方式盤(pán)繞曲折，形成特定的構(gòu)象. 而這種構(gòu)象的維持，主要依賴于蛋白質(zhì)分子中的氫鍵. 高濃度尿素能破壞氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松弛，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的變性. 圖9的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：游離酶和固定酶活力均隨著尿素濃度的增加而降低，游離酶的相對(duì)活力比固定化酶下降速度更快，在相同尿素濃度時(shí)，固定化酶的活力始終明顯高于游離酶. 圖中游離酶在尿素濃度為5 mol/L時(shí)，酶活力剩余24.8%，而固定化酶活力性是62%；固定化酶活力高于游離酶，表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)尿素這種變性劑的耐受性，原因可能是脂肪酶被固定到載體后，酶分子與載體相互作用，形成了保護(hù)酶分子的微環(huán)境，減弱了尿素溶液對(duì)酶蛋白的氫鍵和疏水殘基的破壞，進(jìn)而減輕了酶分子的構(gòu)象變化.

圖9 尿素濃度對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.9 Effect of urea concentration on the activity of free and immobilized lipase

2.2.5 固定化酶重復(fù)使用性

分別稱取1 g磁性殼聚糖載體固定化酶在相同情況下連續(xù)反應(yīng)10次，測(cè)定其活力，得到圖10所示結(jié)果. 隨著使用次數(shù)增加，固定化酶的活力緩慢下降，在連續(xù)使用10次后，磁性殼聚糖載體固定化酶的活力剩余66%，說(shuō)明固定化酶有良好的重復(fù)使用性.

圖10 固定化脂肪酶的重復(fù)使用性Fig.10 Reuse of the immobilized lipase

2.2.6 固定化酶動(dòng)力學(xué)分析

圖11顯示了固定化酶和對(duì)應(yīng)的游離酶的Lineweaver-Burk曲線. 通過(guò)計(jì)算可以得知(a)中磁性殼聚糖載體固定化酶的Km為2.41 μmol/L，對(duì)應(yīng)游離酶的Km為0.31 μmol/L固定化酶對(duì)底物的親和力降低. 出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是載體材料對(duì)底物的擴(kuò)散有一定得限制作用，同時(shí)脂肪酶被固定化后，載體材料與酶分子的活性位點(diǎn)間有空間位阻，降低了酶與底物的結(jié)合能力.

圖11 固定化脂肪酶的動(dòng)力學(xué)分析Fig.11 The kinetics analysis of immobilized enzyme

3 結(jié)論

摸索出一種新的制備磁性殼聚糖微球的方法，該方法工藝相對(duì)簡(jiǎn)單；采用的原料殼聚糖來(lái)源廣、價(jià)格低廉、沒(méi)有毒副作用，降低了工業(yè)成本，對(duì)環(huán)境無(wú)污染. 這些優(yōu)點(diǎn)使該制備方法可用于磁性殼聚糖微球工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn). 制備的磁性殼聚糖微球中殼聚糖包裹在磁性粒子表面，有良好的磁響應(yīng)性. 經(jīng)固定化后，脂肪酶的熱穩(wěn)定性、抗變性劑尿素的能力和重復(fù)使用性均得到顯著提高，對(duì)底物的親合力出現(xiàn)一定程度的降低. 使用磁性殼聚糖材料固定化脂肪酶，克服了游離酶分離回收難的缺點(diǎn)，提高了酶的使用效率，為固定化酶進(jìn)一步工業(yè)應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ).

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[責(zé)任編輯：劉紅玲]

Research on preparation of magnetic chitosan and immobilization of lipase

WANG Nannan, ZHANG Dazhun, DONG Facai*

(LaboratoryofPlantStressBiology,SchoolofLifeSciences,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

The magnetic chitosan microspheres were prepared using the cross-linking co-precipitation technique. The lipase was immobilized on magnetic chitosan microspheres using glutaraldehyde as a crosslinking agent. The characteristics of the magnetic chitosan microspheres were evaluated by scanning electron microscope (SEM), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), phase X-ray diffraction (XRD), vibration sample magnetometer (VSM) and the thermogravimetric analysis. The results indicated that the microspheres had good properties. The thermal, degeneration agent of urea tolerance, reusablities and storage stabilities of the enzyme were greater increased after the immobilization the free enzyme.

magnetic chitosan； lipase； immobilization

2016-11-11.

國(guó)家棉花生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金資助項(xiàng)目(CB2015C26).

王楠楠(1988-)，女，博士生，研究方向?yàn)槊腹こ?*

，E-mail：06wangnan@163.com.

O629.8

A

1008-1011(2017)02-0247-07