鹽酸苯胺誘導(dǎo)小鼠皮膚快速衰老模型的建立

劉軍，邱美玉，于楠楠，崔玉東，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

鹽酸苯胺誘導(dǎo)小鼠皮膚快速衰老模型的建立

劉軍，邱美玉，于楠楠，崔玉東，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

為研究皮膚衰老機(jī)制和抗皮膚衰老藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。采用腹腔注射鹽酸苯胺160 mg·kg-1，每3天一次，注射5次的方法建立皮膚衰老小鼠模型。結(jié)果顯示：注射鹽酸苯胺后，Prdx2基因敲除小鼠與野生型小鼠外周血含海因茨小體紅細(xì)胞數(shù)量均上升（P＜0.001）；小鼠血液活性氧水平升高（P＜0.01）；皮膚組織中Cyclin D1，Cyclin E，p21，p16的表達(dá)量和p38，ERK的磷酸化程度均升高（P＜0.01）；小鼠真皮層厚度減少。表明酸苯胺可誘導(dǎo)小鼠皮膚提前衰老，且Prdx2可延緩這一作用。

皮膚衰老；鹽酸苯胺；Prdx2；動物模型；小鼠

2010年進(jìn)行的第六次人口普查數(shù)據(jù)顯示，中國人口老齡化加速，65歲及以上人口的比例上升1.91個百分點(diǎn)，國家將面臨未富先老的困境。因此，有關(guān)老齡化和衰老的研究已經(jīng)是刻不容緩。隨著社會發(fā)展和生活模式與健康模式的轉(zhuǎn)變，世界范圍的衰老研究也是在如火如荼的展開。皮膚作為人體的重要器官，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，不僅是體內(nèi)脆弱組織與外界環(huán)境之間的堅實(shí)壁壘，同時還發(fā)揮著維持體溫、保存水分、感覺和免疫監(jiān)視等作用[1]。衰老的皮膚將經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能上的退化，這不僅會使皮膚的美觀程度大打折扣，而且會使皮膚容易處于一些難以治愈甚至是致命的疾病當(dāng)中，例如濕疹、基底細(xì)胞癌，甚至惡性黑色素瘤等。皮膚提前衰老會嚴(yán)重地影響人們的生活質(zhì)量，因此切實(shí)有效地研究其致病機(jī)理受到了高度關(guān)注。經(jīng)過長時間的觀察研究發(fā)現(xiàn)Prdx2基因敲除小鼠出現(xiàn)了明顯的皮膚衰老癥狀，表現(xiàn)為全層皮膚厚度減少、表皮角質(zhì)層增厚、真皮層明顯變薄，這些現(xiàn)象顯示出了Prdx2在皮膚衰老過程中具有重要的作用[2-5]。雖然Prdx2基因敲除小鼠是很好的皮膚衰老小鼠模型，但其表現(xiàn)型建立最少需要約7個月時間。鹽酸苯胺可以將血紅素鐵從亞鐵狀態(tài)氧化為三價鐵狀態(tài)，從而使紅細(xì)胞產(chǎn)生大量高鐵血紅蛋白。鹽酸苯胺對紅細(xì)胞的作用是可逆的，并且鹽酸苯胺本身并不會增加紅細(xì)胞崩解的比例，但是它可以造成紅細(xì)胞的氧化損傷并且還伴隨著海因茨小體的產(chǎn)生，從而造成體內(nèi)活性氧水平的升高，這一現(xiàn)象與Prdx2敲除鼠的表現(xiàn)是一致的[4，6-7]。利用鹽酸苯胺制作皮膚衰老模型不僅使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的方式與Prdx2敲除小鼠相同，而且可以大大縮短皮膚衰老模型出現(xiàn)的時間。因此利用野生型小鼠快速誘導(dǎo)皮膚衰老或建立方法加強(qiáng)Prdx2敲除小鼠表型可為研究皮膚衰老機(jī)制和篩選延緩皮膚衰老藥物奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

注射用鹽酸苯胺（Sigma公司）；煌焦油藍(lán)染液（Solarbio公司）；抗 p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、pp38、p38、p21、p16、Cyclin D1、Cyclin E、α-tubulin抗體（Santa Cruz公司）；抗Prdx2抗體（Abfrontier公司）；NC膜（PALL公司）；ECL（Thermo公司）；培養(yǎng)皿（NEST公司）；蛋白免疫印跡系統(tǒng)（Amersham Bioscience公司）；伊紅Y、蘇木精（阿拉丁公司）；載玻片、蓋玻片（世泰公司）。

1.2 動物飼養(yǎng)

清潔級129/SVJ雄性小鼠，野生型與敲除型各24只，體重18～20 g，其中各12只為對照組，余各12只為注射組。小鼠引進(jìn)自韓國生命工學(xué)研究院（KRIBB），飼養(yǎng)在恒溫（23±2）℃，濕度50%～60%，自然光照的獨(dú)立飼養(yǎng)室內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飼料和過濾飲用水自行取用。

1.3 模型的建立

鹽酸苯胺以4 mg·mL-1濃度溶于DDW后用0.22 μm濾膜過濾，以160 mg·kg-1劑量腹腔注射，每3天一次，連續(xù)注射5次。

1.4 血液涂片海因茨小體觀察

取20 μL小鼠外周血加180 μL煌焦油藍(lán)染液，染色2 min后涂片，光學(xué)顯微鏡1 000 x下觀察計數(shù)。

1.5 紅細(xì)胞活性氧水平檢測

取20 μL小鼠外周血紅細(xì)胞稀釋于500 μL PBS緩沖液，加入10 μM DCF-DA 37℃孵育15 min，離心棄上清，用PBS洗滌3遍，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 Western blot檢測老化相關(guān)蛋白

將1 cm2小鼠背部皮膚脫毛剪碎加入蛋白質(zhì)裂解液裂解，充分混勻，4℃裂解4 h，在12 000 rpm·min-1、4℃條件下離心20 min，回收上清（即蛋白質(zhì)）。10 μg總蛋白在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠上進(jìn)行凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（美國Millipore公司），封閉，用抗p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38、p38、p21、P16、Cyclin D1、Cyclin、Prdx2、α-tubulin一抗（1∶2 000），在4℃下孵育過夜。棄去一抗，用TBST（含15 mmol·L-1NaCl、0.2% Tween-20和10 mmol·L-1Tris-HCl）洗滌5次，每次5 min，與HRP標(biāo)記的鼠或兔二抗（1∶5 000）孵育2 h，洗膜、ECL顯色、成像及結(jié)果分析。用Tina2.0進(jìn)行定量分析。

1.7 皮膚H/E染色

將1 cm2小鼠背部皮膚脫毛固定于NC膜上，10%福爾馬林溶液固定24 h，水洗1.5 h，70%酒精40 min，80%酒精50 min，90%酒精1 h，95%酒精1 h，100%酒精 1 h，100%酒精 1 h，100%二甲苯30 min，100%二甲苯30 min，100%二甲苯1 h，高熔點(diǎn)石蠟30 min，高熔點(diǎn)石蠟30 min，高熔點(diǎn)石蠟30 min，0.5 μm切片，室溫晾片12 h后進(jìn)行染色；染色為二甲苯 10 min，二甲苯 10 min，100% 酒精1.5 min，90%酒精1 min，80%酒精1 min，50%酒精1 min，DDW 2 min，hematoxylene 5 min，DDW 1 min，DDW 2 min，1%acid alcohol 2 s，DDW 1 min，DDW 2 min，0.8%Ammonia，DDW 3 min，DDW 2 min，Eosin 1 min，95%酒精 1 min，95%酒精1 min，100% Alcohol 1 min，封片，晾干后觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SigmaPlot繪圖，多組均數(shù)比較采用t檢驗進(jìn)行分析，P＜0.01為差異顯著，P＜0.001為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射鹽酸苯胺后小鼠外周紅血細(xì)胞含海因茨小體比例

Prdx2可以作為分子伴侶保護(hù)紅細(xì)胞中的血紅蛋白使其在高活性氧的狀態(tài)下保持穩(wěn)定[4，6-7]，而Prdx2缺失的血紅蛋白易變性導(dǎo)致海因茨小體產(chǎn)生，從而造成血液活性氧水平升高，這也是造成Prdx2小鼠皮膚提前衰老的原因之一[2-3]。因此，觀察了野生型與Prdx2缺失小鼠分別在對照組與注射組的外周血含海因茨小體的紅細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，野生型對照組（WT）小鼠紅細(xì)胞狀態(tài)正常幾乎沒有海因茨小體產(chǎn)生；野生型注射組（WT+AH）有海因茨小體產(chǎn)生且產(chǎn)生海因茨小體紅細(xì)胞的比例為37%與Prdx2基因敲除型對照組（Homo）小鼠的比例相近；Prdx2敲除小鼠注射鹽酸苯胺后含有海因茨小體的紅細(xì)胞數(shù)量明顯增多為60%，見圖1。

圖1 野生型與Prdx2基因敲除型小鼠的對照組與注射鹽酸苯胺組紅細(xì)胞海因茨小體水平Fig.1 The increment of RBCs with the Heinz bodies in WT and Prdx2 knockout mouse with control group and injection group

2.2 DCF-DA染色血液活性氧檢測

含海因茨小體紅細(xì)胞數(shù)量升高通常造成血液活性氧水平升高，因此我們檢測了兩種基因型對照組與注射組小鼠的紅細(xì)胞活性氧水平，。結(jié)果顯示，注射鹽酸苯胺后野生型注射組（WT+AH）小鼠血液活性氧水平升高且與敲除對照組（Homo）活性氧水平相近，敲除注射組（Homo+AH）與敲除型對照組（Homo）相比也有升高，且在四組小鼠中活性氧水平最高，見圖2。

圖2 血液活性氧水平Fig.2 ROS levels of blood

2.3 皮膚中衰老相關(guān)蛋白和活性氧相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

為進(jìn)一步檢測鹽酸苯胺誘導(dǎo)皮膚衰老的作用及機(jī)制，對兩種基因型的對照組及注射組小鼠的皮膚進(jìn)行取樣，并對CyclinD1，Cyclin E，p21，p16，p-p38，p38，p-JNK，JNK，p-ERK，ERK，Prdx2，α-tubulin進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示，注射鹽酸苯胺后與細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老密切相關(guān)的Cyclin D1，Cyclin E，p21，p16的表達(dá)量均上升，其中p16可作為皮膚衰老的生物標(biāo)志物（Bio-marker）[8]，且野生型注射組（WT+AH）與敲除型對照組（Homo）的Cyclin D1，Cyclin E，p21，p16表達(dá)量相近，在敲除型注射組（Homo+AH）的表達(dá)量最高；與活性氧密切相關(guān)的MAPKs信號也在注射鹽酸苯胺后被激活，其中ERK的磷酸化水平在注射鹽酸苯胺后顯著升高，p38磷酸化程度也有所增加，JNK在野生型中增加不顯著但在敲除型中有增加趨勢，見圖3。

圖3 皮膚中衰老相關(guān)蛋白和活性氧相關(guān)蛋白表達(dá)檢測Fig.3 Determination of the proteins expressing relative with skin aging and ROS levels

2.4 皮膚組織H/E染色

衰老的皮膚會經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能上退化[9-11]，例如Prdx2基因敲除小鼠出現(xiàn)了明顯的皮膚衰老癥狀，表現(xiàn)為全層皮膚厚度減少、表皮角質(zhì)層增厚、真皮層明顯變薄。因此將兩種基因型的對照組與注射組的小鼠皮膚樣品進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，注射鹽酸苯胺后小鼠皮膚真皮層變薄，野生型注射組（WT+AH）與敲除型對照組（Homo）真皮厚度相近，敲除型注射組（Homo+AH）真皮層厚度減少最為明顯，見圖4。

圖4 皮膚組織H/E染色Fig.4 H/E staining of skin

3 討論

引起皮膚衰老的因素可以分為內(nèi)源性和外源性兩大方面，究其原因主要源自活性氧造成的損傷。人體消耗的氧氣中2%會變成活性氧（reactive oxygen species，ROS），活性氧是指由分子氧直接或間接轉(zhuǎn)化而來、具有比分子氧更活潑的化學(xué)反應(yīng)性的一類含氧物，是一組具有一個或多個未配對電子的原子或分子，包括超氧陰離子（superoxide anion，O2·-）、單線態(tài)氧（singlet oxygen）、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）、羥自由基（hydroxyl radical，HO·）等，它們的化學(xué)性質(zhì)活躍，過高的活性氧水平會對細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損害[12-14]。機(jī)體中活性氧的增多會引起脂類過氧化作用，嚴(yán)重地?fù)p害了生物膜的功能，使脂質(zhì)發(fā)生過氧化，損傷線粒體等細(xì)胞器膜的流動性、通透性和完整性，在細(xì)胞核中引起DNA斷裂突變，影響其修復(fù)和復(fù)制過程，生成異常蛋白質(zhì)，引起原有蛋白多肽和酶功能的喪失，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生[15]，因此研究氧化應(yīng)激與過氧化物酶的關(guān)系對了解皮膚衰老的機(jī)制和探索延緩皮膚衰老的方法具有重要作用。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)了一種廣泛存在于機(jī)體組織細(xì)胞中的過氧化物酶家族Peroxiredoxins（Prdxs）。哺乳動物的Prdxs家族包括6個成員，根據(jù)各成員間的同源性和cys殘基的數(shù)目，Prdxs家族蛋白可分為3個亞類，即典型2-cys Prdx（Prdx1～4），非典型2-Cys Prdx（Prdx5）和1-cys Prdx（Prdx6）。Prdx2為2-cys Prdx含有兩個高度保守的具有氧化還原活性的半胱氨酸殘基，即具有過氧化活性的半胱氨酸殘基（cys51）和還原活性的半胱氨酸殘基（cys172），在發(fā)揮抗氧化作用時形成同型二聚體，利用硫氧還蛋白（thioredoxin）作為中間電子供體對過氧化物進(jìn)行還原，具有及時清除體內(nèi)較低濃度活性氧的作用。自Prdx2基因敲除鼠制作完成之后，Prdx2基因功能的研究得到了進(jìn)一步的發(fā)展。Prdx2基因敲除鼠表現(xiàn)出外周血液網(wǎng)織紅細(xì)胞增多、紅細(xì)胞中出現(xiàn)海因茨小體以及脾腫大等溶血性貧血癥狀，表明Prdx2在血液系統(tǒng)中清除活性氧的重要生理意義[6]。

經(jīng)過觀察研究發(fā)現(xiàn)，Prdx2基因敲除小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞衰老特征，而且Prdx2基因敲除小鼠出現(xiàn)了明顯的皮膚衰老癥狀，表現(xiàn)為全層皮膚厚度減少、表皮角質(zhì)層增厚、真皮層明顯變薄，這些現(xiàn)象顯示出了Prdx2在皮膚衰老過程中具有重要的作用。為了進(jìn)一步研究Prdx2與皮膚衰老和活性氧之間的關(guān)系，利用野生型與Prdx2基因敲除型小鼠分別注射鹽酸苯胺（aniline hydrochloride，AH）并與未注射小鼠進(jìn)行對比，比較其皮膚衰老程度。鹽酸苯胺可以將血紅素鐵從亞鐵狀態(tài)氧化為三價鐵狀態(tài)，從而使紅細(xì)胞產(chǎn)生大量高鐵血紅蛋白。鹽酸苯胺對紅細(xì)胞的作用是可逆的，并且鹽酸苯胺本身并不會增加紅細(xì)胞崩解的比例，但是它可以造成紅細(xì)胞的氧化損傷并且還伴隨著海因茨小體的產(chǎn)生，從而造成體內(nèi)活性氧水平的升高，這一現(xiàn)象與Prdx2敲除鼠的表型一致。利用鹽酸苯胺制作皮膚衰老模型不僅使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的方式與Prdx2敲除小鼠相類似，而且可以快速省時地制作這一模型。因此研究Prdx2抑制鹽酸苯胺誘導(dǎo)的小鼠皮膚提前衰老的機(jī)制對Prdx2基因功能的研究和活性氧與皮膚衰老的研究都具有重要意義。

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Establishment of Rapid Skin Aging Mouse Model by Aniline Hydrochloride Injection

Liu Jun，Qiu Meiyu，Yu Nannan，Cui Yudong，Han Yinghao
（College of Life Sciences and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to set up the experimental foundation for the study of skin aging mechanism and the screening drugs preventing skin aging.Intraperitoneal injections of aniline hydrochloride，160mg·kg-1every three days was used to set up skin premature aging model；Heinz body levels and Heinz body contents were increased after injection（P＜0.001）；the expression of Cyclin D1，Cyclin E，p21，p16 and the phosphorylation levels of p38，ERK were higher after injection aniline hydrochloride in the skin（P＜0.01）；the dermal thickness was decreased after injection.These results showed that Aniline Hydrochloride could induce premature skin aging and Prdx2 could play a protective role.

skin aging；aniline hydrochloride；Prdx2；animal models；mouse

Q78

A

1002-2090（2017）02-0079-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.016

2016-03-20

2015研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（YJSCX2015-Y58）。

劉軍（1991-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2013級碩士研究生。

韓英浩，男，副教授，E-mail：yinghaohan@byau.edu.cn；崔玉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：cuiyudong@yahoo.com。