大黃素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制探討

羅英花，劉暢，孫虎男，臧延青，金成浩

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院）

大黃素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制探討

羅英花1，劉暢2，孫虎男2，臧延青3，金成浩2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院）

研究大黃素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的藥效及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。通過(guò)MTT法檢測(cè)大黃素對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用；通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用；通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化。大黃素對(duì)A549細(xì)胞具有良好的殺傷作用且呈濃度依賴(lài)性；熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大黃素能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡且呈時(shí)間依賴(lài)性；Western blot檢測(cè)顯示大黃素處理A549細(xì)胞后，p-AKT、Bcl-2的表達(dá)量明顯減少，Bad和cleaved-caspase-3的表達(dá)水平明顯增加。大黃素通過(guò)調(diào)控AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡。

大黃素；人肺癌A549細(xì)胞；藥效；細(xì)胞凋亡；AKT信號(hào)通路

肺癌是當(dāng)前世界各地最常見(jiàn)的肺原發(fā)性惡性腫瘤，是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的惡性腫瘤之一。目前肺癌的治療手段包括手術(shù)切除、化學(xué)治療和放射治療等。但這些方法只能夠延長(zhǎng)患者的生存期，不能徹底治療肺癌[1]。所以尋找能夠徹底根治肺癌的藥物，提高患者的生存質(zhì)量迫在眉睫。

大黃素（Emodin，化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌）是存在于掌葉大黃根莖中的天然蒽醌衍生物，是一種天然的CK2抑制劑[2-3]。相關(guān)報(bào)道指出，大黃素可以誘導(dǎo)膽管癌QBC-939、口腔鱗癌KBV200等細(xì)胞發(fā)生凋亡[4-5]，但其對(duì)肺癌的藥效及藥理機(jī)制尚不清楚。實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法[6-7]闡明大黃素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的殺傷作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為大黃素的有效利用以及治療肺癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人肺癌A549細(xì)胞系購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)，由實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：大黃素（＞99.0%）購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，5-氟尿嘧啶（5-FU）購(gòu)自上海皓元化學(xué)科技有限公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體p-AKT、AKT、Bcl-2、caspase-3、β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：390302型倒置顯微鏡，Leica公司；ELX酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；電泳儀、半干轉(zhuǎn)印儀，美國(guó)伯樂(lè)公司Bio-rad；MicroChemi4.0型化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司；EVOS FL型全自于動(dòng)智能成像系統(tǒng)，Life Technology公司；FACSCalibvr型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素及100 μg·mL-1的鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3天換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞滿(mǎn)度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將A549細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種至96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h。用含有1% FBS的培養(yǎng)液血清饑餓處理2 h，再用不同濃度的大黃素和5-FU（1、3、10、30及100 μmol·L-1）處理24 h（實(shí)驗(yàn)中所用到的藥物的溶劑均為1%的RPMI1640培養(yǎng)液）。加入15 μL的MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后，用PBS洗滌3次。每孔加入100 μL的DMSO，在搖床上混勻10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度（A570）值，計(jì)算細(xì)胞存活率和IC50值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)定8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（空白調(diào)零組只加DMSO；對(duì)照組每孔加入1 μL DMSO；陽(yáng)性對(duì)照組5-FU每孔加入1 μL 5-FU）。

細(xì)胞存活率%=（實(shí)驗(yàn)組-空白調(diào)零組）/（對(duì)照組-空白調(diào)零組）

1.3.3 Annexin V-FITC/PI染色觀察細(xì)胞凋亡

將A549細(xì)胞種至6孔板中（2×105個(gè)/孔），用30 μmol·L-1的大黃素分別處理細(xì)胞不同時(shí)間（0、3、6、12、24 h）。參照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行染色。通過(guò)熒光顯微鏡觀察并分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將A549細(xì)胞種至6孔板中（2×105個(gè)/孔），加入30 μmol·L-1的大黃素分別處理細(xì)胞不同時(shí)間（0、3、6、12、24 h）后，用PBS重懸細(xì)胞，離心（7 000 r，5 min），棄上清，加入195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕混勻，再加入5 μL的Annexin V-FITC，輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL的PI，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量變化

收集經(jīng)過(guò)30 μmol·L-1的大黃素分別處理不同時(shí)間（0、3、6、12、24 h）后的細(xì)胞，提取蛋白，SDSPAGE分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳封閉，一抗（p-AKT、AKT、Bcl-2、caspase-3和β-actin）封閉過(guò)夜，二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG）室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用SPSS 11.0軟件包分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃素對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用

為了檢測(cè)大黃素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的殺傷作用，用不同濃度（1、3、10、30、100 μmol·L-1）的大黃素和5-FU（陽(yáng)性對(duì)照組）處理A549細(xì)胞24 h后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。如圖1所示，隨著大黃素藥物濃度的逐漸增加，細(xì)胞存活率明顯降低并呈濃度依賴(lài)性，其存活率分別為81.4±2.3%、75.9±2.1%、56.2±5.7%、41.3± 1.4%及21.7±0.7%。大黃素與陽(yáng)性對(duì)照組5-FU相比對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用更明顯，具有顯著性差異（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算，大黃素IC50值為17.52 μmol·L-1。

圖1 大黃素對(duì)肺癌A549細(xì)胞的殺傷作用Fig.1 Cytotoxic effect of emodin on A549 cells

2.2 大黃素對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)和熒光染色的影響

為了檢測(cè)大黃素是否具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡作用，用濃度為30 μmol·L-1的大黃素對(duì)A549細(xì)胞處理不同時(shí)間（0、3、6、12、24 h）后，利用Annexin V-FITC/PI染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡情況。如圖2A所示，對(duì)照組（0 h）細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁較牢固，細(xì)胞間緊密相連，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞膜完整。隨著藥物處理時(shí)間的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞體積變小，形態(tài)逐漸變圓、不規(guī)則，細(xì)胞間接觸松散，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型特征。而且Annexin V-FITC和PI的熒光強(qiáng)度也隨著藥物處理時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05，圖2B）。

2.3 大黃素對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證大黃素對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用，用濃度為30 μmol·L-1的大黃素對(duì)A549細(xì)胞處理不同時(shí)間（0、3、6、12、24 h）后，利用 Annexin VFITC和PI進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。如圖3所示，隨著藥物處理時(shí)間的增加，A549細(xì)胞凋亡程度也逐漸增加。尤其是當(dāng)藥物處理時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，細(xì)胞凋亡水平最為明顯（圖3B），提示大黃素能夠有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，并呈時(shí)間依賴(lài)性。

圖2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptotic effect of emodin on A549 cells by Annexin V-FITC/PI double staining

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用Fig.3 Apoptotic effect of Emodin on A549 cells by flow cytometry

2.4 大黃素對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了在分子水平上闡明大黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)途徑，用濃度為30 μmol·L-1的大黃素對(duì)A549細(xì)胞處理不同時(shí)間（0、3、6、12、24 h）后，利用Western blot方法檢測(cè)AKT及其下游蛋白表達(dá)量的變化。如圖4所示，抗凋亡因子p-AKT，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，而促凋亡因子Bad和cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，說(shuō)明大黃素通過(guò)調(diào)控AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖4 Western blot檢測(cè)大黃素對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化Fig.4 Effect of emodin on expression of apoptotic protein on A549 cells by western blot

3 討論

近年來(lái)，許多國(guó)家特別是工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的首位，女性肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，位列第二位，死亡率占第一位。細(xì)胞凋亡是一種保守的細(xì)胞死亡方式，不僅在正常機(jī)體中能夠維持細(xì)胞數(shù)目的平衡，而且與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡異常有關(guān)，因此尋找一種能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物迫在眉睫。

大黃素作為一種新型的ATP競(jìng)爭(zhēng)性CK2抑制劑可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。大黃素可通過(guò)下調(diào)JNK及JNK下游分子AP-1的表達(dá)從而誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，也可通過(guò)線粒體依賴(lài)性途徑來(lái)抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制為使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS，reactive oxygen species），隨后凋亡調(diào)控因子Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，導(dǎo)致線粒體內(nèi)cytochrome c釋放到胞漿進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3的活性[8-9]。

有報(bào)道證實(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路可以阻止腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)程序性死亡，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。通路中Akt磷酸化的激活作為Bad強(qiáng)有力的激酶，使Bad的Ser136位點(diǎn)磷酸化，阻斷Bad誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而激活下游caspase家族發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起到不可替代的作用，可以被多種因素活化，在CTL細(xì)胞的殺傷作用中，它既可被Fas/FasL途徑活化，也可以通過(guò)顆粒酶B途徑活化。在凋亡的早期階段，活化的Caspase-3通過(guò)裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。研究結(jié)果表明，大黃素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞具有良好的殺傷作用，且隨著藥物濃度和處理時(shí)間的增加，其殺傷作用更加明顯；而且Annexin V-FITC/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，大黃素可有效誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡且呈時(shí)間依賴(lài)性。研究Western blot結(jié)果表明，大黃素可下調(diào)抑癌蛋白p-AKT，Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促癌蛋白Bad和cleavedcaspase-3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，證實(shí)了大黃素通過(guò)AKT介導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)等方法，闡明大黃素通過(guò)調(diào)控AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而有效抑制A549細(xì)胞的增殖。為肺癌以及其他癌癥的治療提供新的理論依據(jù)。

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Effect of Emodin on Proliferation and Apoptosis of Human Lung Cancer A549 Cells and its Mechanism

Luo Yinghua1，Liu Chang2，Sun Hunan2，Zang Yanqing3，Jin Chenghao2
（1.College of Animal Science&veterinary medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Life Science&Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University；3.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

To investigate the pharmacologic effect and apoptotic mechanism of emodin on human lung cancer A549 cells，the viability of A549 cells were measured by MTT assay.The apoptotic effect of emodin on A549 cells was detected by Annexin V-FITC/PI double staining and flow cytometry.The related apoptotic protein expression level was determined by western blotting.Emodin suppressed the proliferation of A549 cells in a dose-dependent manner.The Annexin V-FITC/PI double staining and flow cytometry results showed that emodin could induce A549 cell apoptosis in a time-dependent manner.The western blotting results showed that emodin could significantly down-regulate p-AKT，Bcl-2 protein expression levels while up-regulated the Bad and cleaved-caspase-3 expression levels in A549 cells.Emodin significantly inhibited the proliferation of human lung cancer A549 cells by inducing mitochondrial-related apoptosis via AKT signaling pathway.

Emodin；human lung cancer A549 cell；pharmacologic effects；apoptosis；AKT signaling pathway

Q78

A

1002-2090（2017）02-0064-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.013

2016-05-03

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510223003）；黑龍江省自然基金項(xiàng)目（LC2015036）；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)項(xiàng)目（LBH-Q13132）；學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（XYB2013-24）。

羅英花（1976-），女，助理實(shí)驗(yàn)師，延邊大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事抗腫瘤藥物藥理學(xué)方面的研究工作。

金成浩，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：jinchenghao3727@qq.com。