色米提取物的抗氧化作用與成分分析研究

嚴(yán) 娜王 芳，2高雪燕崔梓荻王汝華華澤田，2

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院1，天津 300457）（天津天隆種業(yè)科技有限公司2，天津 300457）

色米提取物的抗氧化作用與成分分析研究

嚴(yán) 娜1王 芳1，2高雪燕1崔梓荻1王汝華1華澤田1，2

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院1，天津 300457）
（天津天隆種業(yè)科技有限公司2，天津 300457）

為探討色米提取物總酚含量與抗氧化相關(guān)性及其抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，以4種不同品種的色米為材料，采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總酚含量，三氯化鋁比色法測(cè)定黃酮含量，DPPH·、ABTS+·清除法和O2-·清除法評(píng)價(jià)抗氧化活性，高效液相色譜法進(jìn)行多酚成分分析。結(jié)果表明，4個(gè)品種的色米總酚含量范圍為42～305.2 mg GAE／g，紅米具有最高的總酚和黃酮含量以及最好的抗氧化能力，綠米各項(xiàng)指標(biāo)均最低。提取物成分分析結(jié)果顯示，4個(gè)品種均具有一定含量的沒(méi)食子酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸。

色米 總酚 抗氧化 活性成分

稻米是我國(guó)2／3人口的主食，提高稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及保健品質(zhì)對(duì)促進(jìn)我國(guó)人民的身體健康有著十分重要的作用［1］。有色稻米是色素沉積在水稻種子的種皮內(nèi)形成的一種重要的特異水稻種質(zhì)資源，就種皮顏色而言，可分為綠色、紫色、紅色、紫黑色、黃色、黃褐色、咖啡色和紫紅色等顏色［2］。多項(xiàng)研究證明有色稻米具有清除自由基、延緩衰老、抗應(yīng)激反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，起到關(guān)鍵作用的物質(zhì)主要是黃酮素、花青素、酚酸類等活性成分［3-4］。黃酮類和酚酸類物質(zhì)均屬于多酚類物質(zhì)，因其獨(dú)特的抗氧化活性受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外酚類物質(zhì)的研究主要集中在水果和蔬菜上［5］，對(duì)于稻米中的總酚物質(zhì)的研究較少，Su等［6］以白米和糙米為原料，研究其中游離酚和結(jié)合酚的成分，張名位等［7］研究了黑米提取物不同極性部位的抗氧化性和成分分析。

本試驗(yàn)以不同顏色（紅色、黑色、紫色、綠色）的色米為材料，利用多種自由基體系進(jìn)行抗氧化活性的研究，結(jié)果更客觀。測(cè)定多酚類物質(zhì)的常用的方法有紫外分光光度法、離子色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等，而紫外分光光度法和薄層色譜法，只能測(cè)定總酚或某一類酚的含量，不能確定具體的種類和含量。高效液相色譜具有流動(dòng)相消耗少，分析時(shí)間短，選擇性好、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏性高等特點(diǎn)［8］，因此本試驗(yàn)選用此方法進(jìn)行成分測(cè)定。本試驗(yàn)在優(yōu)化色米抗氧化提取物制備條件的基礎(chǔ)上測(cè)定其抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，提高稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和附加值，以期為色米的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

紅米（131TZ14）、黑米（141TZ13）、紫米（141TZ16）、綠米（141LT91）：天津天隆種業(yè)有限公司。稻谷經(jīng)龔谷機(jī)碾去種皮得到糙米。

沒(méi)食子酸、蘆丁、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽）、NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）、NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、PMS（吩嗪硫酸甲酯）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

TE214S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；JSP-100高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市榮浩二貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Alpha1-2LDPlus真空冷凍干燥機(jī)：北京五洲東方科技有限公司；EMS-19磁力攪拌器：天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

用龔谷機(jī)碾去種皮得到糙米，經(jīng)過(guò)粉碎后備用。

1.2.2 色米提取物的制備

取5 g樣品，加入50 mL提取液（70%丙酮、1%乙酸、29%水），在磁力攪拌條件下常溫提取1 h，3 000 r／min離心15 min，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥成粉末，以備測(cè)定抗氧化活性。每種色米提取3次，求平均提取率。樣品分析和測(cè)定用50%甲醇溶解。

1.2.3 多酚含量測(cè)定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu（FC）法測(cè)定［9］。以50%甲醇做空白，以沒(méi)食子酸為標(biāo)樣，于760 nm下測(cè)定吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的回歸方程為：Y= 1.118 6X-0.002 3（R2=0.999）?？偡雍恳悦靠颂崛∥镏兴喈?dāng)于沒(méi)食子酸的量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量采用三氯化鋁比色法測(cè)定［10］。以50%甲醇做空白，以蘆丁為標(biāo)樣，于510 nm下測(cè)定吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的回歸方程為：Y=0.928 8X-0.000 3（R2=0.999 7）?？傸S酮含量以每克提取物中所含相當(dāng)于蘆丁的量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 DPPH·清除能力測(cè)定［11］

取50 μL適當(dāng)濃度樣品溶液和3 mL 0.1 mmol／L 的DPPH甲醇溶液，充分混勻后于室溫下密封避光靜置60 min，以50%甲醇做空白，于517 nm下測(cè)吸光值。DPPH清除率計(jì)算公式：DPPH清除率=（A0-A1）／A0×100%，式中：A0為對(duì)照管的吸光度值；A1為樣品管的吸光度值。

1.2.6 ABTS+·清除能力測(cè)定［12］

使用前將濃度為7 mmol／L的 ABTS溶液與2.45 mmol／L過(guò)硫酸鉀溶液按1∶1混合，室溫避光放置16～24 h，制得ABTS+儲(chǔ)存液，臨用前用乙醇稀釋混合液，稀釋終點(diǎn)用混合液的吸光值來(lái)判斷，當(dāng)吸光值為A734為0.700±0.02時(shí)即可。

移取50 μL樣品溶液，加入3 mL的ABTS+工作液，混合，室溫下避光反應(yīng)30 min，以50%甲醇做空白，測(cè)定其在734 nm處吸光值。ABTS+清除率計(jì)算公式為：ABTS+清除率 =（A0-A1）／A0×100%，式中：A0為空白管的吸光度值，A1為樣品管的吸光度值。

1.2.7 SOR自由基清除能力［13］

該反應(yīng)于96孔板中進(jìn)行，依次加入50 μL的樣品提取液、50 μL的 NBT（200 μmol／L）、50 μL的NADH（624 μmol／L）以及50 μL的PMS（80 μmol／L），于室溫下反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀于560 nm下測(cè)定吸光值。PMS用pH為7.4的0.1 mol／L的PBS現(xiàn)用現(xiàn)配，以PBS為陰性對(duì)照。SOR清除率計(jì)算公式為：SOR清除率=［1-（Asample／Acontrol）］×100%。

1.2.8 高效液相色譜測(cè)定抗氧化成分［14］

樣品在液相前過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜。色譜柱：Waters C18（5.0 μm 4.6×250 mm）。檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，流速：0.7 mL／min，進(jìn)樣體積：10 μL，柱溫：30℃。流動(dòng)相A：1 000 mL水+7 mL甲酸。流動(dòng)相B：500 mLACN（乙腈）+500 mL水+7 mL甲酸。

HPLC設(shè)定條件如表1所示。

表1 HPLC的設(shè)定條件

2 結(jié)果與分析

2.1 色米提取物得率及總酚、總黃酮含量

表2顯示4種色米提取物得率在1%～4%之間，得率相差不大。不同品種之間總酚含量和黃酮含量存在顯著差異（P＜0.05），其中紅米的總酚及黃酮含量均最高，綠米的總酚及黃酮含量較低，而綠米提取得率較高的原因可能是提取物中含有多糖類物質(zhì)［15］。

表2 4種色米提取物的得率及總酚、黃酮含量

2.2 色米提取物清除自由基能力測(cè)定

清除自由基研究方法主要有電子自旋共振法、高效液相色法、化學(xué)發(fā)光法、分光光度法等，本研究采取分光光度法進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，因此常被選作抗氧化性能評(píng)價(jià)的方法。不同的抗氧化體系，其機(jī)理有所不同，一般選擇多種抗氧化體系進(jìn)行測(cè)定，常見(jiàn)的有 DPPH、ABTS等。

由圖1可以看出，4種色米提取物在相同濃度下對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、SOR自由基的清除能力存在顯著性差異（P＜0.05）。紅米提取物對(duì)3種自由基清除能力最大，綠米最小，其清除能力順序：紅米＞黑米＞紫米＞綠米，其清除能力趨勢(shì)與相應(yīng)的多酚黃酮含量一致，可推測(cè)色米提取物清除自由基能力與其多酚類化合物的含量有關(guān)。原因可能是色米提取物中所含多酚含量越多，抗氧化性物質(zhì)越多，清除自由基的能力也就越強(qiáng)［16］。另外，多酚類化合物作為一類氧化還原電位很低的還原劑，具有很強(qiáng)的供氫能力，H+與自由基結(jié)合，能使之還原為惰性化合物或較穩(wěn)定的自由基，4種色米提取物中綠米的供氫能力較?。?7-18］。

圖1 不同樣品清除自由基能力

注：字母相同表示差異不顯著（P＞0.05），字母不相同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.3 高效液相色譜測(cè)定抗氧化成分

在已確定的色譜條件下，分別將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量關(guān)系進(jìn)行線性回歸如下表格。在各相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，表明線性關(guān)系良好。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析和檢測(cè)方法的相關(guān)數(shù)據(jù)

將圖3與圖2對(duì)照，確定色米水稻多酚中含有沒(méi)食子酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸（以紫米為例）。

常見(jiàn)的稻米多酚按照化學(xué)結(jié)構(gòu)不同主要分有黃酮類、酚酸類等。其中兒茶素屬于黃酮類物質(zhì)，沒(méi)食子酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸屬于酚酸類。本試驗(yàn)樣品中各酚類物質(zhì)的含量以峰面積查相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，結(jié)果見(jiàn)表4。紅米在4種物質(zhì)中含量均最高，除咖啡酸和阿魏酸以外，綠米含量均最低。另外，紅米和黑米中咖啡酸最多，紫米和綠米兒茶素含量最多。從樣品譜圖看出，有幾個(gè)較明顯的峰沒(méi)有找到其對(duì)應(yīng)標(biāo)品，需要進(jìn)一步的純化來(lái)大致確定其所屬類型。

圖2 色米提取物標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖

圖3 色米（紫米）提取物的HPLC譜圖

表4 4種有色米所含成分的含量差異／mg／mg

3 討論與結(jié)論

4種色米總酚含量均具有顯著性差異，以紅米的含量最高為305.4 mg／g，其次是黑米、紫米、綠米此結(jié)論與Shen等［19］的結(jié)論稍有不同，原因可能是稻米多酚有游離態(tài)，結(jié)合態(tài)與酯化態(tài)形式存在，而不同處理方式（如堿性、酸性或者酶的作用下［20］）提取得到的成分有所不同。

本研究中色米提取物成分結(jié)果分析得出酚酸類物質(zhì)比黃酮類物質(zhì)含量要高，與有關(guān)報(bào)道有相似之處［21］。本試驗(yàn)檢測(cè)出了沒(méi)食子酸、香草酸、咖啡酸阿魏酸、兒茶素 5種物質(zhì)，從液相譜圖看出，在35～40 min出現(xiàn)較大的峰面積，說(shuō)明提取物中含有未知的單體黃酮，需要進(jìn)一步研究，以確定其成分。

稻米多酚具有較明顯的抗氧化作用，其抗氧化作用隨著色米總酚含量的增加而提高，這一結(jié)論與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論一致。試驗(yàn)中色米提取物的總酚含量與DPPH·、ABTS+·清除能力、超氧陰離子自由基之間有顯著的相關(guān)關(guān)系。本研究色米品種較多，不只集中在黑米的研究上［7，22］。為了進(jìn)一步探究其抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，可以采用液質(zhì)聯(lián)用等方法進(jìn)行提取物的結(jié)構(gòu)分析，確定其中起到關(guān)鍵作用的基團(tuán)種類。

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Research on Antioxidant Effect and Composition Analysis of Colored Rice Extracts

Yan Na1Wang Fang1，2Gao Xueyan1Cui Zidi1Wang Ruhua1Hua Zetian1，2
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology1，Tianjin 300457
（Tianjin Tianlong Seeds Science and Technology Co.，Ltd.2，Tianjin 300457）

In order to discuss correlation between the total phenolic content and the antioxidant activity in col ored rice and the material basis of antioxidant activity，based on using four different varieties of colored rice as materi als，the total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method，the flavonoid content was determined by al chlor colorimetric method，the antioxidant activity was evaluated by DPPH·，ABTS+·clearance assay and，O2-· clearance assay，high performance liquid chromatography（HPLC）method was used for polyphenol content analysis Results indicated that the total phenolic content of the four colored rice was in the range of 42～305.2 mg GAE／g. Red rice exhibited the highest total phenolic and flavone content and the best antioxidant properties，while the gree rice was the lowest.Extract components analysis results showed that the four varieties had certain content of galli acid，catechin，vanillic acid，caffeic acid and ferulic acid.

colored rice，total phenols，antioxidant，active ingredients

TS213.3

A

1003-0174（2017）03-0001-05

863計(jì)劃（2011AA10A101），天津市教委項(xiàng)目（2013 0616），天津市科技特派員項(xiàng)目（15JCTPJC57400）

2015-08-12

嚴(yán)娜，女，1989年出生，碩士，糧油資源與生物技術(shù)

王芳，女，1975年出生，副教授，功能性谷物