哇巴因對人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞增殖及HIF-1α表達的影響

楊小颯，劉冬瑩，李 杰，衣泰龍，涂 悅，程世翔

(1.武警后勤學院附屬醫(yī)院 腦科醫(yī)院，天津 300162；2.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室，天津 300162；3.武警天津總隊第六支隊衛(wèi)生隊，天津 300410)

臨床醫(yī)學研究

哇巴因對人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞增殖及HIF-1α表達的影響

楊小颯1,2，劉冬瑩3，李 杰1，衣泰龍1，涂 悅1,2，程世翔1,2

(1.武警后勤學院附屬醫(yī)院 腦科醫(yī)院，天津 300162；2.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室，天津 300162；3.武警天津總隊第六支隊衛(wèi)生隊，天津 300410)

目的 探索哇巴因(Ouabain)對人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞增殖和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達的影響。方法 Ouabain(0.05、0.5、2.5、25 μmol/L)作用于U87-MG細胞24 h，MTT法檢測吸光度值和細胞活力，Western Blot檢測HIF-1α表達量。結果 不同濃度Ouabain干預24 h后U87-MG細胞吸光度值(OD490)與Control組相比，均明顯降低(P均<0.01)，細胞活力顯著下降(P<0.01)；與Control組比較，0.05 μmol/L Ouabain組HIF-1α蛋白表達量上升(1.27±0.05vs.1.00±0.05，P<0.05)，當Ouabain濃度升高至2.5、25 μmol/L，HIF-1α表達顯著降低(0.28±0.04，0.20±0.03vs.1.00±0.05，P均<0.01)。結論 較高濃度Ouabain可通過抑制HIF-1α表達，促進人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞凋亡。

哇巴因；人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞；缺氧誘導因子-1α；凋亡

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Glioma)是目前最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤之一，其起源于神經(jīng)上皮，惡性程度較高，約占顱腦腫瘤的40%～50%[1]。神經(jīng)膠質(zhì)細胞的過度分化和遷移是膠質(zhì)瘤的病理基礎，目前臨床上主要采取手術治療聯(lián)合放化療，但由于膠質(zhì)瘤的侵襲性使根治性腫瘤切除術無法實施，因而患者的生存中值較短，臨床預后較差[2]。為了改善膠質(zhì)瘤的臨床現(xiàn)狀，新的治療方案亟待發(fā)展。

哇巴因(Ouabain)作為一種強心苷類藥物，由于能夠抑制Na+/K+-ATP酶活性產(chǎn)生正性肌力作用而被廣泛用于治療充血性心力衰竭和心率失常[3]。最近研究表明，Ouabain可通過提高胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平、抑制細胞周期等，參與調(diào)節(jié)MAPK、Ras、Akt/mTOR等信號轉導通路，誘導膠質(zhì)瘤、腎上腺皮質(zhì)腺瘤和肺癌等多種腫瘤細胞凋亡，提高腫瘤細胞的放化療敏感性[4]。另外，流行病學研究也表明，使用Ouabain等強心苷類藥物能夠降低腫瘤患者的死亡率[5]。以上研究結果均提示Ouabain具有一定的抗癌特性，但目前關于其在腫瘤治療中的作用機制尚不明確。

缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是缺血缺氧環(huán)境下激活的一種重要轉錄因子，參與調(diào)節(jié)機體對缺氧的耐受[6]。研究表明，膠質(zhì)瘤細胞的快速生長導致氧氣消耗過度，由此引發(fā)的缺氧環(huán)境使HIF-1α呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并介導其下游多種靶基因促進腫瘤細胞生長，增強腫瘤細胞侵襲力和遷移能力以及化療藥物的耐受性，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。然而，使用強心苷類藥物地高辛可阻斷膠質(zhì)瘤誘導的HIF-1α產(chǎn)生從而抑制血管再生，提高膠質(zhì)瘤小鼠的存活率[8]。這表明，強心苷類藥物在膠質(zhì)瘤中抗癌作用的發(fā)揮可能與HIF-1α有關。

因此，本研究使用強心苷類藥物Ouabain干預人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞，以驗證Ouabain對膠質(zhì)瘤的抑制作用，并探索其作用機制與HIF-1α的關系，旨在為膠質(zhì)瘤的藥物治療提供更多實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)，Ouabain(美國Sigma公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Promega公司)，兔抗人一抗HIF-1α、β-actin(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(美國KPL公司)，化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE公司，Amersham Imager 600)，酶標儀(美國Thermo fisher公司，51119300)。

1.2 細胞培養(yǎng)和實驗分組 人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，待細胞匯合度達90%后消化傳代，正常培養(yǎng)7 d后進行后續(xù)實驗。實驗分為：正常對照組(control)和Ouabain組(0.05、0.5、2.5、25 μmol/L)，control組不進行Ouabain干預。

1.3 MTT法檢測細胞存活率 將U87-MG細胞以4 000個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置4個復孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后Ouabain組加入不同濃度Ouabain繼續(xù)培養(yǎng)24 h，control組細胞加入等體積的DMEM高糖培養(yǎng)基，空白孔僅加入等體積的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)相同時間后每孔加入20% MTT，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用酶標儀測定490 nm處的吸光度值(optical density，OD490)，計算細胞活力 =(OD490實驗孔-OD490空白孔)/(OD490對照孔-OD490空白孔)×100%。

1.4 Western Blot檢測HIF-1α蛋白表達量 U87-MG細胞經(jīng)不同濃度Ouabain處理24 h后，使用預冷PBS漂洗細胞3次，加入SDS蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，靜置1 min后，用細胞刮收集細胞至1.5 mL離心管，使用破碎儀3 500次/min破碎2 min，12 000 rpm離心取上清，-80℃保存待用。將制備好的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，HIF-1α一抗(兔抗，1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST充分洗膜，羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST充分洗膜。滴加化學發(fā)光劑ECL，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影后采用ScnImage灰度分析軟件進行分析，以目的蛋白與β-actin的蛋白條帶灰度值之比作為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 Ouabain對U-87MG細胞活力的影響 MTT結果顯示，不同濃度Ouabain處理24 h后U87-MG細胞OD490與control組比較，均顯著降低(P均<0.01)，細胞活力較control組顯著下降(P均<0.01,見表1)。

表1 Ouabain處理24 h后U87-MG細胞OD490和細胞活力

檢測指標藥物濃度00.05μmol/L0.5μmol/L2.5μmol/L25μmol/LOD4900.97±0.090.70±0.10**0.41±0.09**0.40±0.08**0.34±0.09**細胞活力(%)10072.30±5.66**42.50±5.51**41.34±4.64**34.86±5.77**

每組設置4個復孔；與control組相比，**P<0.01。

2.2 Ouabain對HIF-1α表達的影響 與control組比較，0.05 μmol/L Ouabain組HIF-1α蛋白表達量上升(1.27±0.05vs.1.00±0.05，P< 0.05)，當Ouabain濃度升高為2.5、25 μmol/L時，HIF-1α表達均顯著降低(0.28±0.04，0.20±0.03vs.1.00±0.05，P均<0.01)；另外，0.5 μmol/L Ouabain組的HIF-1α蛋白表達量與對照組相比無明顯差異(0.88±0.03vs.1.00±0.05，P> 0.05,見圖1)。

與control組相比，*P < 0.05，**P < 0.01。 圖1 Ouabain作用于U87-MG細胞24 h后的HIF-1α表達變化

3 討論

膠質(zhì)瘤作為侵襲性最高的腦腫瘤，具有較高的復發(fā)率和死亡率，近年來關于其治療方案的研究備受矚目[9]。Ouabain等強心苷類藥物作為Na+/K+-ATP酶的特異性抑制劑，近年來被發(fā)現(xiàn)具有一定的腫瘤抑制作用[10]。另外，強心類藥物被證實能夠抑制膠質(zhì)瘤誘導的HIF-1α表達，阻止腫瘤的病理進展。基于此，本實驗利用國內(nèi)外常用于研究膠質(zhì)瘤的U87-MG細胞構建膠質(zhì)瘤體外模型，不同濃度Ouabain干預U87-MG細胞24 h，以此來探究Ouabain對于U87-MG細胞凋亡和HIF-1α表達的影響。

Ouabain能夠抑制Na+/K+-ATP酶、降低鈉離子濃度梯度，從而增加胞內(nèi)鈣離子濃度、激活心肌細胞上的收縮元件，產(chǎn)生正性肌力作用而被用于治療充血性心臟病[11]。研究表明，作為Na+/K+-ATP酶的特異性抑制劑，Ouabain等強心苷類藥物通過降低Na+/K+-ATP酶α亞基的含量，可能影響腫瘤細胞的粘附和轉移，從而引起惡性乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、人白血病細胞等腫瘤細胞凋亡[12]。另外，Ouabain被報道能夠通過抑制Na+/K+-ATP酶α亞基與糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B的相互作用，阻斷PI3K/Akt和MEK/ERK通路，從而減弱膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力，抑制腫瘤細胞的生長[13]。本研究中，MTT結果表明，不同濃度Ouabain均導致U87-MG細胞活力降低，且具有一定的濃度依賴性，這表明Ouabain能夠抑制人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞的生長，與前者的研究結果相一致，均證實了Ouabain的抗癌特性。

為了進一步探討Ouabain促進U87-MG細胞凋亡的可能機制，我們檢測了HIF-1α的表達變化。HIF-1α是細胞內(nèi)維持氧平衡的重要調(diào)節(jié)因子，包含 826 個氨基酸，分子量為 92.7 kD，其在常氧條件下經(jīng)泛素化途徑而降解，當體內(nèi)發(fā)生缺氧時可在組織內(nèi)發(fā)生堆積，并通過調(diào)節(jié)糖酵解相關酶活性和調(diào)節(jié)線粒體功能來降低氧耗，使機體適應缺氧環(huán)境[14]。惡性腫瘤的無限增殖特性可導致細胞內(nèi)氧代謝異常，并造成細胞內(nèi)缺氧微環(huán)境，從而刺激HIF-1α的穩(wěn)定。充足的HIF-1α可通過促進腫瘤細胞自我更新、調(diào)節(jié)細胞代謝及胞內(nèi)葡萄糖利用，對腫瘤細胞生長、增殖、轉移起到促進作用，并可能觸發(fā)癌細胞侵襲和遷移以及放化療耐受[15]。

研究表明，除了環(huán)境中氧濃度的直接調(diào)節(jié)，Akt/mTOR信號通路也被證實能夠在轉錄水平促進HIF-1α的穩(wěn)定和積累[16]。而Akt/mTOR通路能夠抑制膠質(zhì)瘤病理過程中的程序性細胞死亡，從而導致膠質(zhì)細胞的過度分化，加劇膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)展[17]。李杰[18]等研究發(fā)現(xiàn)，ouabain能夠抑制人膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖，使其出現(xiàn)S期阻滯，同時高濃度的Ouabain能夠下調(diào)Akt、mTOR以及HIF-1α。在本研究中，Western Blot結果表明，在0.05 μmol/L Ouabain組，HIF-1α表達增加，這可能由于較低濃度的Ouabain對U-87MG細胞中Na+/K+-ATP酶的輕度抑制導致細胞處于較高代謝水平且相對缺氧的狀態(tài)，因而刺激了HIF-1α的表達上調(diào)。但隨著Ouabain濃度的增加，HIF-1α表達也逐漸降低。MTT和Western Blot結果提示，較高濃度Ouabain在抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的同時，也導致HIF-1α表達下調(diào)。這與李杰等的研究結果一致由此我們推測，較高濃度的Ouabain可能通過抑制Akt/mTOR信號通路，進而下調(diào)下游蛋白HIF-1α的表達，減弱細胞生長能力，從而引起腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，本實驗采用不同濃度Ouabain干預人膠質(zhì)瘤U87-MG細胞，發(fā)現(xiàn)Ouabain可通過抑制HIF-1α表達，從而促進腫瘤細胞凋亡，這為膠質(zhì)瘤的藥物治療提供了實驗依據(jù)，提示Ouabain可作為臨床治療膠質(zhì)瘤的潛在藥物。

[1] Wang H Y,Wang W,Liu Y W,et al.Role of KCNB1 in the prognosis of gliomas and autophagy modulation[J].Sci Rep,2017,7(1):14.

[2] Wang G,Liu M,Wang H,et al.Centrosomal protein of 55 regulates glucose metabolism,proliferation and apoptosis of glioma cells via the Akt/mTOR signaling pathway[J].J Cancer,2016,7(11):1431-1440.

[3] Blaustein M P,Chen L,Hamlyn J M,et al.Pivotal role of α2 Na(+) pumps and their high affinity ouabain binding site in cardiovascular health and disease[J].J Physiol,2016,594(21):6079-6103.

[4] Yan X,Liang F,Li D,et al.Ouabain elicits human glioblastoma cells apoptosis by generating reactive oxygen species in ERK-p66SHC-dependent pathway[J].Mol Cell Biochem,2015,398(1-2):95-104.

[5] Prassas I,Diamandis E P.Novel therapeutic applications of cardiac glycosides[J].Nat Rev Drug Discov,2008,7(11):926-935.

[6] 劉波,石京山,龔其海.缺氧誘導因子-1的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)[J].遵義醫(yī)學院學報,2012,35(6):548-552.

[7] Tang J H,Ma Z X,Huang G H,et al.Downregulation of HIF-1a sensitizes U251 glioma cells to the temozolomide (TMZ) treatment[J].Exp Cell Res,2016,343(2):148-158.

[8] Nigim F,Cavanaugh J,Patel A P,et al.Targeting hypoxia-Inducible factor 1α in a new orthotopic model of glioblastoma recapitulating the hypoxic tumor microenvironment[J].J Neuropathol Exp Neurol,2015,74(7):710-722.

[9] 王 敏,林 茂,馬曉莉,等.和厚樸酚對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的體內(nèi)外抗腫瘤作用[J].遵義醫(yī)學院學報,2016,39(5):459-463.

[10] Lima D B,Valente R C,Capella M A.Ouabain-induced alterations in ABCB1 of mesenteric lymph nodes and thymocytes of rats and mice[J].Oncol Lett,2016,12(6):5275-5280.

[11] Wu J,Li D,Du L,et al.Ouabain prevents pathological cardiac hypertrophy and heart failure through activation of phosphoinositide 3-kinase α in mouse[J].Cell Biosci,2015,5(1):64.

[12] Wang Y,Ye Q,Liu C,et al.Involvement of Na+/K+-ATPase in hydrogen peroxide-induced activation of the Src/ERK pathway in LLC-PK1 cells[J].Free Radic Biol Med,2014,71(6):415-426.

[13] Ono Y,Chiba S,Yano H,et al.Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B (GPNMB) promotes the progression of brain glioblastoma via Na+/K+-ATPase[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,481(1-2):7-12.

[14] Majmundar A J,Wong W J,Simon M C.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell,2010,40(2):294-309.

[15] Li J,Xu Y,Jiao H,et al.Sumoylation of hypoxia inducible factor-1α and its significance in cancer[J].Sci China Life Sci,2014,57(7):657-664.

[16] Coudre C,Alani J,Ritchie W,et al.HIF-1α and rapamycin act as gerosuppressant in multiple myeloma cells upon genotoxic stress[J].Cell Cycle,2016,15(16):2174-2182.

[17] Lin F,de Gooijer M C,Hanekamp D,et al.PI3K-mTOR pathway inhibition exhibits efficacy against high-grade glioma in clinically relevant mouse models[J].Clin Cancer Res,2017,23(5):1286-1298.

[18] 李杰,徐忠偉,程世翔,等.哇巴因誘發(fā)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤u251細胞凋亡的機制[J].武警后勤學院學報：醫(yī)學版,2016,25(3):174-177.

[收稿2016-12-29;修回2017-01-11]

(編輯：王福軍)

Effects of Ouabain on the growth of human glioma U87-MG cells and the expression of HIF-1α

YangXiaosa1,2,LiuDongying3,LiJie1,YiTailong1,TuYue1,2,ChengShixiang1,2

(1.Affiliated Hospital of Logistics University of PAP,Tianjin 300162,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair; Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience of PAP,Tianjin 300162,China; 3.Tianjin People’s Armed Police Corps Detachment of Sixth Medical Team,Tianjin 300410,China)

Objective To explore the effects of Ouabain on the growth of human glioma U87-MG cells and the expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α).Methods U87-MG cells were treated with different concentrations of Ouabain (0.05,0.5,2.5,25 μmol/L) for 24 h.MTT assay and Western Blot were used to detect cell viability and survival rate and the protein expression of HIF-1α,respectively.Results Compared with the control group,the optical density value (OD490) and cell viability of U87-MG cells which were treated with different concentrations of Ouabain were significantly decreased (allP<0.01).Compared with the control group,0.05 μmol/L Ouabain up-regulated the protein expression of HIF-1α (1.27±0.05vs.1.00±0.05,P<0.05),while 2.5 and 25 μmol/L Ouabain significantly decreased the protein level of HIF-1α (0.28±0.04,0.20±0.03vs.1.00±0.05,bothP<0.01).Conclusion Ouabain with high dose could promote the apoptosis of human glioma U87-MG cells by down-regulating HIF-1α.

Ouabain; Human glioma U87-MG cells; hypoxia inducible factor-1α; apoptosis

國家自然科學基金資助項目(NO：31200809)；武警部隊后勤科研項目(NO：WJHQ2012-20)；武警后勤學院中心實驗室開放基金資助項目(NO：2015ZXKF09)。

涂悅，女，博士，主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)危重癥，E-mail:ytumail@vip.126.com。

R741.05

A

1000-2715(2017)01-0064-04