清胰Ⅱ號對雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠Nrf2相關(guān)基因水平的影響

柳 源，劉龍中，徐亞沙，謝雪勵，李利生，徐尚福，陸遠(yuǎn)富，吳 芹，石京山

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099；3. 遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

清胰Ⅱ號對雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠Nrf2相關(guān)基因水平的影響

柳 源1，劉龍中2，徐亞沙1，謝雪勵3，李利生1，徐尚福1，陸遠(yuǎn)富1，吳 芹1，石京山1

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099；3. 遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

目的 研究清胰Ⅱ號對雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 雄性昆明種小鼠32只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、清胰Ⅱ號低劑量組(10 g/kg)及清胰Ⅱ號高劑量組(20 g/kg)，每組8只。給藥7 d后，采用雨蛙素制模。觀察清胰Ⅱ?qū)σ认僦笖?shù)、血清胰淀粉酶含量、胰腺組織的形態(tài)學(xué)變化及胰腺組織中核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)、醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶(HO-1)、谷胱甘肽合成的限速酶(Gclc)基因的mRNA 水平的影響。結(jié)果 與空白組比較，模型組胰腺指數(shù)及血清胰淀粉酶水平顯著升高(P<0.05)，胰腺組織出現(xiàn)明顯水腫及壞死，同時胰腺組織中Nrf2、Nqo1基因的mRNA水平顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，清胰Ⅱ號給藥組胰腺指數(shù)及血清中胰淀粉酶水平顯著降低(P<0.05)，胰腺組織水腫和壞死明顯減輕，胰腺組織中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1、Gclc基因的mRNA水平較模型組顯著增高(P<0.05)。結(jié)論 清胰Ⅱ號對蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎有預(yù)防保護(hù)作用，其機(jī)制可能與進(jìn)一步上調(diào)胰腺組織中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1、Gclc的水平有關(guān)。

清胰Ⅱ號；急性胰腺炎；核因子E2相關(guān)因子2；雨蛙素

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是多種病因作用下發(fā)生在胰腺組織的急性炎癥性病變，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，大量研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與胰酶自身消化、白細(xì)胞過度激活、氧化應(yīng)激損傷等有關(guān)。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)屬于cap-n-collar(CNC)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族，通過誘導(dǎo)一系列抗氧化保護(hù)蛋白的編碼，提高細(xì)胞抗氧化損傷的能力，是機(jī)體內(nèi)一個重要的保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。近期相關(guān)研究表明，通過激活或上調(diào)Nrf2信號通路能夠有效降低AP實驗?zāi)Ｐ偷难趸瘧?yīng)激水平，從而達(dá)到下調(diào)相關(guān)炎癥因子的水平以及改善其病理狀態(tài)的目的[3]。清胰Ⅱ號為我院經(jīng)驗方，主要由大黃、虎杖、木香、金錢草等組成，具有利膽、消炎、排石、攻下等功效[4]。本院長期研究證實，清胰Ⅱ號可阻斷AP觸發(fā)的炎癥連鎖反應(yīng)，且具有清除氧自由基的功能，對膽汁淤積性肝損傷及急性胰腺炎等具有良好的治療效果[5-6]。本研究擬采用雨蛙素復(fù)制急性胰腺炎小鼠模型，觀察清胰Ⅱ號對該模型小鼠胰腺的保護(hù)作用及對Nrf2信號通路相關(guān)基因的影響，為該藥的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)藥理學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品及試劑 清胰Ⅱ號(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供，大黃40 g，赤芍40 g，芒硝10 g，木香15 g，延胡索15 g，厚樸15 g，牡丹皮15 g，梔子15 g，方劑水煎1次，去渣取汁，4 ℃存儲)；RNA提取試劑盒、RNA純化試劑盒(上海華舜生物技術(shù)有限公司)；引物設(shè)計(大連寶生物工程有限公司)；High Capacity Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems, USA)；SYBR?PCR Master Mix (美國BIO-RAD公司)；胰蛋白酶測試盒(南京建成生物工程研究所)；雨蛙素(美國sigma公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 動物 雄性昆明種小鼠32只， SPF級，體重(20±5) g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號SCXK(軍)2012-0011。

1.1.3 儀器 5417R型冷凍離心機(jī)(德國eppendorf)；RO.DI-50(H)-RZ型純水器(Research科技儀器公司)；BS100S型電子分析天平(北京德賽公司)；X-15R型冷凍離心機(jī)(美國Beckman)；SIM-F124型制冰機(jī)(日本三洋公司)；CFX connect熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD)；ND2000超微量分光光度計(美國Thermo)；Trilogy全自動生化分析儀(美國Drew)；BX43型正置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；Mastercycler Gradient 梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、給藥及制模 將32只昆明種小鼠根據(jù)體重進(jìn)行編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組, 每組8只，即空白對照組、模型組，清胰Ⅱ號低劑量組(簡稱QYⅡ-L，10 g/kg)、高劑量組(簡稱QYⅡ-H，20 g/kg)，清胰Ⅱ號低劑量組和高劑量組分別按10和20 g/kg灌胃給藥，空白對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d，于末次給藥1 h后，除空白對照組外，其余各組腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg)，每1小時注射1次，共6次，制模10 h后再給藥1次。于制模12 h后眼眶取血，切取胰腺稱其重量，檢測胰腺組織相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 小鼠胰腺指數(shù)的測定 剖取胰腺，稱其重量，按胰腺指數(shù)=胰腺重量(g)/體重(g)×100%，計算小鼠胰腺指數(shù)。

1.2.3 血清中胰淀粉酶活性檢測 小鼠眼眶取血，以3 000 rpm/min 離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書的操作方法，于全自動生化分析儀檢測血清中胰淀粉酶活性。

1.2.4 胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察 取各小鼠相同部位胰腺組織于4%甲醛溶液中固定48 h，常規(guī)石臘包埋、蘇木精-伊紅染色(Hemaltoxylin and eosin, HE)，使用正置生物顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.5 Real-Time PCR檢測Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1、Gclc基因的水平 切取相同部位胰腺組織50～100 mg置于1 mL Trizol中，提取胰腺總RNA，按照試劑盒說明書提取并純化RNA，采用超微量分光光度計測定其濃度及純度，A260/A280比值為1.8～2.0表示純度較理想。從NCBI中查出相關(guān)基因序列，由大連寶生物工程有限公司設(shè)計合成，見表1。采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為15 μL，95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)。以β-actin基因為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計算上述基因的相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

基因基因編號上游引物下游引物β-actinM32599AACTTTGGCATTGTGGAAGGGGATGCAGGGATGATGTTCTNrf2BC026943GAGATATACGCAGGAGAGGTA-AGGCTCGACAATGTTCTCCAGCTTHO-1M33203CCTCACTGGCAGGAAATCATCCCTCGTGGAGACGCTTTACATANQO-1BC004579TATCCTTCCGAGTCATCTCTAG-CATCTGCAGCTTCCAGCTTCTTGKeap1NM_016679AAGGAACATGATATGCCCTGA-CAACACAGGCCGGCTCCATGCLCBC019374TGGCCACTATCTGCCCAATTGTCTGACACGTAGCCTCGGTAA

2 結(jié)果

2.1 清胰Ⅱ號對雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰腺指數(shù)的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠胰腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)，結(jié)果提示小鼠胰腺受損；與模型組比較，清胰Ⅱ號各劑量組的胰腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05，見表2)。

2.2 清胰Ⅱ號對雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰淀粉酶的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清中胰淀粉酶含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，清胰Ⅱ號各劑量組小鼠血清胰淀粉酶含量均明顯降低(P<0.05，見表2)。

組別給藥劑量(g/kg)胰腺指數(shù)(%)胰淀粉酶(U/L)空白對照模型QYⅡ-LQYⅡ-H——10.020.00.77±0.091.02±0.12#0.77±0.12*0.82±0.11*534.40±68.63 4503.50±1168.60##2147.91±749.89*1675.41±663.05*

#:P<0.05，與空白對照組比較；##:P<0.01，與空白對照組比較；*:P<0.05，與模型組比較。

2.3 清胰Ⅱ號對雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰腺組織病理學(xué)的影響 胰腺組織切片，HE染色，光鏡下觀察，空白對照組可見胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整，胰腺腺泡和胰島清晰可見，無炎癥細(xì)胞浸潤，無出血和壞死。模型組胰腺組織見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)管顯著擴(kuò)張，部分見組織灶狀壞死。清胰Ⅱ號治療組炎性細(xì)胞浸潤及導(dǎo)管擴(kuò)張程度減輕，壞死灶明顯縮小，未見壞死組織(見圖1)。

A：空白對照組；B：模型組；C：清胰Ⅱ號低劑量組；D：清胰Ⅱ號高劑量組。圖1 清胰Ⅱ號對雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響 (HE，×200)

2.4 對小鼠胰腺組織中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1和GclcmRNA水平的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠胰腺組織中Nrf2、Nqo1 mRNA的水平均明增高(P<0.05)；與模型組比較，清胰Ⅱ號給藥組小鼠胰腺組織中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1和GclcmRNA水平進(jìn)一步增高(P<0.05，見圖2)。

Control: 空白對照組；Model: 模型組；QYⅡ-L: 清胰Ⅱ號低劑量組；QYⅡ-H: 清胰Ⅱ號高劑量組。#: P<0.05，與空白對照組比較；*: P<0.05，與模型組比較。圖2 清胰Ⅱ號對小鼠胰腺組織中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1和Gclc mRNA水平的影響

3 討論

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是發(fā)生在胰腺組織的急性炎癥性病變，病變亦可累及周圍器官，許多因素參與其病理生理過程，包括胰酶自身消化激活、炎癥介質(zhì)、大量細(xì)胞因子產(chǎn)生，氧化應(yīng)激損傷等[7-9]。

氧化應(yīng)激是指活性氧 (ROS) 和活性氮(RNS)過量產(chǎn)生或機(jī)體清除能力降低，導(dǎo)致機(jī)體氧化還原失衡而發(fā)生一系列反應(yīng)，常伴有一些生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的生理功能損害。最近有研究表明，ROS被認(rèn)為與AP的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。在AP模型中發(fā)現(xiàn)ROS水平明顯升高，通過進(jìn)行抗氧化干預(yù)，能夠在一定程度上緩解AP導(dǎo)致的病理損傷[10-11]。近期的相關(guān)研究表明，Nrf2/ARE信號通路在改善AP的病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[10]。在正常的生理狀態(tài)下，Nrf2與其分子伴侶Keap1結(jié)合于胞漿中，處于功能抑制狀態(tài)，并由Keap1將其帶入泛素化途徑進(jìn)行降解[12-13]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或毒素刺激時，Nrf2從Keap1中解離以穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element, ARE)相結(jié)合，從而上調(diào)包括醌氧化還原酶[NAD(P)H: quinone oxidoreductase, Nqo1]，血紅素加氧酶(Heme oxygenase-1, HO-1)和谷胱甘肽合成限速酶(Glutamate-cysteine ligase, catalytic, Gclc)在內(nèi)的一系列抗氧化蛋白的表達(dá)，從而降低ROS等氧化應(yīng)激指標(biāo)，達(dá)到緩解AP的目的[14]。

本實驗采用腹腔注射雨蛙素模型制模，通過多次重復(fù)腹腔注射，可刺激胰腺過度分泌，進(jìn)而造成急性胰腺炎損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行腹腔注射雨蛙素后，小鼠胰腺指數(shù)及血清胰淀粉酶水平顯著升高，胰腺病理表現(xiàn)為組織見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)管顯著擴(kuò)張，出現(xiàn)組織灶狀壞死，與重癥急性胰腺炎有相似的病理特征[15]。提示腹腔注射雨蛙素可造成急性胰腺炎損傷。模型組小鼠胰腺組織見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)管顯著擴(kuò)張，部分見組織灶狀壞死，清胰Ⅱ治療組炎性細(xì)胞浸潤及導(dǎo)管擴(kuò)張程度減輕，壞死灶明顯縮小，未見壞死組織，提示清胰Ⅱ號對急性胰腺炎模型具有預(yù)防保護(hù)作用。結(jié)合近期的研究，為進(jìn)一步探索清胰Ⅱ號可能機(jī)制，繼續(xù)檢測胰腺組織Nrf2相關(guān)基因水平。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠胰腺組織中Nrf2相關(guān)基因的mRNA水平具有升高趨勢，可能是由于機(jī)體自身的應(yīng)激狀態(tài)所導(dǎo)致，結(jié)合病理結(jié)果提示，小鼠自身氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)系統(tǒng)對該模型動物胰腺不能夠起到有效的保護(hù)作用，而清胰Ⅱ號給藥組可進(jìn)一步上調(diào)胰腺組織中Nrf2、Keap1，以及相關(guān)抗氧化酶Nqo1、HO-1、Gclc基因的mRNA水平，從而可能影響了相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，達(dá)到保護(hù)該模型小鼠胰腺的目的，我們也將在下一步的試驗中進(jìn)行相關(guān)蛋白水平的檢測，對mRNA的結(jié)果進(jìn)行驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)清胰Ⅱ號對雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎有預(yù)防保護(hù)的作用，其機(jī)制可能與進(jìn)一步激活Nrf2/ARE信號通路從而上調(diào)抗氧化酶Nqo1、HO-1和Gclc的水平有關(guān)。

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[收稿2016-12-05;修回2017-01-13]

(編輯：王靜)

Effects of QingYi Ⅱ on Nrf2 signaling pathway in cerulein-induced acute pancreatitis mice

LiuYuan1,LiuLongzhong2,XuYasha1,XieXueli3,LiLisheng1,XuShangfu1,LuYuanfu1,WuQin1,ShiJingshan1

(1. Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Pharmacy School of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To investigate the protective effects of QingYi Ⅱ on severe acute pancreatitis induced by caerulein in mice, and explore the potential mechanisms.Methods Male KM mice were randomly divided into 4 groups (8 for each): control group, model group, low dose of QingYi Ⅱ group (10 g/kg), and high dose of QingYi Ⅱ group (20 g/kg). Mice were orally administered with QingYi Ⅱ for 7 days, and then intraperitoneally injected with caerulein except the control group. The effects of QingYi Ⅱ were evaluated with the pancreas index, the content of serum amylase, the histomorphology of pancreas, and the gene expressions ofNrf2,Keap1,Nqo1,HO-1 andGclc.Results Compared with the control group, the pancreas index and the concentration of serum amylase of the model group were significantly increased (P<0.05), the pathologic lesion of the pancreas was severe, and the mRNA levels ofNrf2 andNqo1 were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the pancreas index and the content of serum amylase were obviously decreased in the treatment group (P<0.05), the edema and necrosis of pancreas were significantly reduced, and the gene expressions of Nrf2, Keap1, Nqo1, HO-1 and Gclc were significantly increased (P<0.05).Conclusion QingYi Ⅱ can observably protect the pancreas and relieve the severe acute pancreatitis induced by caerulein. The mechanisms might be related to up-regulating the gene expressions ofNrf2,Keap1,Nqo1,HO-1 andGclc.

QingYi Ⅱ; severe acute pancreatitis; nuclear factor E2 related factor 2(Nrf2); caerulein

遵義市匯川科技局項目(NO: E-120)；遵義市紅花崗區(qū)科學(xué)技術(shù)項目(NO: 遵紅科合社字[2013]09)。

石京山，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail: shijs@zmc.edu.cn；吳芹，女，高級實驗師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)與神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail: wuqin@zmc.edu.cn。

R285.5

A

1000-2715(2017)01-0033-05