淫羊藿苷對CX3CL1誘導(dǎo)的單核細胞向人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移和黏附的影響及機制研究

付曉霞，羅云梅，劉 娟，劉 杰，李利生

(1.遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學研究

淫羊藿苷對CX3CL1誘導(dǎo)的單核細胞向人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移和黏附的影響及機制研究

付曉霞1，羅云梅1，劉 娟2，劉 杰1，李利生1

(1.遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所，貴州 遵義 563099)

目的 研究淫羊藿苷(icariin，ICA)對CX3CL1誘導(dǎo)的單核細胞(THP-1)向人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)遷移和黏附的影響及其機制。方法 采用Transwells聯(lián)合培養(yǎng)THP-1和HUVECs，CX3CL1誘導(dǎo)THP-1向HUVECs遷移和黏附模型，并觀察ICA(10-8、10-7、10-6mol/L)對該模型的影響。ICA預(yù)給藥4 h后加入CX3CL1(50 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，移除Transwells及上室中的THP-1細胞，收集培養(yǎng)液并對遷移至下室的THP-1計數(shù)；免疫熒光雙標法檢測THP-1向HUVECs黏附的情況；Western blot檢測CX3CR1、p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平。結(jié)果 與對照組比較，CX3CL1誘導(dǎo)THP-1向HUVECs遷移和黏附的數(shù)量明顯增多(P<0.01)，伴有CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平升高(P<0.05)；ICA預(yù)處理(10-8～10-6mol/L)能減少THP-1向HUVECs遷移和黏附的數(shù)量(P<0.05或P<0.01)，抑制CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平的上調(diào)。結(jié)論 ICA(10-8～10-6mol/L)可抑制CX3CL1誘導(dǎo)的THP-1向HUVECs的遷移和黏附，作用機制可能與抑制CX3CL1/CX3CR1/NF-κB/TNF-α信號通路有關(guān)。

淫羊藿苷；CX3CL1；CX3CR1；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；單核細胞(THP-1)；人臍靜脈內(nèi)皮細胞

血管炎癥是動脈粥樣硬化[1]、肺動脈高壓[2]等疾病的重要病理特征，涉及大量的炎癥介質(zhì)和細胞。趨化因子CX3CL1主要表達于血管內(nèi)皮細胞[3]，是CX3C亞家族的唯一成員，包括溶解型和膜結(jié)合型兩種形式，二者均可與其受體CX3CR1結(jié)合[4]，經(jīng)Gi蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使表達該受體的細胞如淋巴細胞、單核細胞向內(nèi)皮細胞招募、黏附并向中膜遷移，從而導(dǎo)致血管狹窄，甚至血管重塑[5]。抑制血管壁炎癥性細胞浸潤不僅可緩解炎癥、還能夠預(yù)防血管壁形態(tài)學改變。

淫羊藿苷(icariin，ICA)是我國傳統(tǒng)中藥淫羊藿的主要有效成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、影響內(nèi)分泌和改善心腦血管功能等多種藥理作用[6-7]。而其對抑制細胞遷移黏附的作用鮮有報道。本實驗采用單核細胞(Human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)和臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 聯(lián)合培養(yǎng)模型，初步探討了ICA對CX3CL1誘導(dǎo)THP-1向HUVECs遷移和黏附的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HUVECs和THP-1由湘雅醫(yī)院中心實驗室提供；ICA (經(jīng)HPLC檢測純度≥98%)購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；Transwells購自美國Corning公司；重組人CX3CL1購自美國Peprotech公司；BCA和ECL發(fā)光劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；兔多克隆抗體CX3CR1、兔多克隆抗體 IκB-α、小鼠單克隆抗體CD14、TNF-α購自美國Abcam公司；兔多克隆抗體p-NF-κB p65，兔多克隆抗體NF-κB p65購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗Ⅷ因子抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標記的GAPDH抗體購自中國康成生物技術(shù)有限公司。

全波長酶標儀(型號：Multiskan)，美國Thermo scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號：Chemi Doc XR5)，美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡(型號：1X73+DP73)，日本Olympus公司。

1.2 細胞培養(yǎng) HUVECs和THP-1均培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL青霉素及鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶按1∶2比例消化傳代貼壁細胞。

1.3 實驗分組及藥物處理 分為對照組，模型組(CX3CL1 50 ng/mL)，ICA-L、M、H組(CX3CL1 50 ng/mL + ICA 10-8、10-7、10-6mol/L)。ICA預(yù)給藥4 h后加入CX3CL1 (50 ng/mL) 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 THP-1的遷移情況 分別將THP-1(2×105個/mL)和HUVECs(2×105個/mL)接種于Transwells的上室和下室，建立聯(lián)合培養(yǎng)體系，藥物干預(yù)結(jié)束后移去上室，收集培養(yǎng)液進行細胞計數(shù)。

1.5 免疫熒光雙標法測定THP-1的黏附情況 細胞接種與藥物干預(yù)同1.4。干預(yù)結(jié)束后移去上室和培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%的Triton X-100在室溫下處理10 min，1%BSA孵育30 min，以CD14和Ⅷ因子抗體分別標記THP-1和HUVECs并在4 ℃中過夜，PBS洗滌細胞3次，在室溫下孵育二抗75 min，DAPI染細胞10 min。倒置熒光顯微鏡拍照，并對THP-1計數(shù)即黏附細胞數(shù)。

1.6 Western Blot檢測CX3CR1、p-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白的表達 收集經(jīng)處理的細胞，總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，熱變性(95 ℃，10 min)后BCA試劑盒測定蛋白含量，按20 μg/10 μL每孔泳道蛋白上樣，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗CX3CR1(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗(羊抗兔，1∶3 000)室溫下孵育1.5 h，TBST 洗膜，ECL發(fā)光液孵育2 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，經(jīng)Image J軟件測定條帶灰度值，分別計算CX3CR1、TNF-α與GAPDH及p-NF-κB p65與NF-κB p65灰度值的比值，即為目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行ONE-WAY ANOVA處理，方差分析有差異者進一步做兩兩比較，方差齊者用LSD法，方差不齊用Dunnett’T3法，相關(guān)性分析采用Pearson法，P<0.05認為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 ICA抑制CX3CL1誘導(dǎo)的THP-1向HUVECs遷移 與對照組比較，CX3CL1刺激細胞24 h后，THP-1遷移的數(shù)量明顯增多(P<0.01)。ICA各劑量組均可抑制THP-1向HUVECs遷移(P<0.01)，并具有劑量依賴關(guān)系(見圖1)。

2.2 ICA抑制CX3CL1誘導(dǎo)的THP-1向HUVECs黏附 如圖2所示，CX3CL1可明顯誘導(dǎo)THP-1向HUVECs或培養(yǎng)板底部黏附，黏附細胞數(shù)達對照組的5倍。ICA(10-8～10-6mol/L)預(yù)處理可顯著抑制CX3CL1所致的THP-1向HUVECs黏附(P<0.01)，但仍高于對照組。

A：代表性熒光圖片(比例尺：50 μm) ，THP-1呈紅色熒光，HUVECs呈綠色熒光；B：THP-1黏附細胞數(shù)統(tǒng)計柱狀圖。與對照組比較，##P<0.01；與模型組組比較，*P<0.05或**P<0.01。圖2 ICA對CX3CL1誘導(dǎo)的THP-1向HUVECs黏附的影響

2.3 ICA對THP-1細胞CX3CR1和HUVECs p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平的影響 THP-1經(jīng)CX3CL1處理后CX3CR1蛋白水平顯著增高(P<0.05)，ICA(10-7～10-6mol/L)能抑制CX3CR1蛋白水平的上調(diào)(P<0.05)。HUVECs經(jīng)CX3CL1處理后p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平高于對照組(P<0.05)，ICA(10-8～10-6mol/L)能抑制p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平的上調(diào)(P<0.05，見圖3)。

與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 ICA對THP-1細胞中CX3CR1及HUVECs中p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平的影響

2.4 THP-1向HUVECs遷移和黏附的細胞數(shù)量與THP-1細胞CX3CR1蛋白水平相關(guān)性分析 如表1所示，THP-1向HUVECs遷移和黏附的細胞數(shù)量與THP-1細胞CX3CR1蛋白水平呈顯著正相關(guān)。

表1 THP-1向HUVECs遷移和黏附的細胞數(shù)量與THP-1細胞CX3CR1蛋白水平相關(guān)性分析

變量CX3CR1相關(guān)系數(shù)rP遷移細胞數(shù)0.850.034黏附細胞數(shù)0.850.034

3 討論

炎癥灶炎癥細胞浸潤是一個連續(xù)動態(tài)的過程，包括招募、黏附、聚集和遷移等環(huán)節(jié)。在血管壁炎癥反應(yīng)過程中炎癥細胞黏附在內(nèi)膜并向中膜遷移，本研究選用的Transwell孔徑為8μm，模擬血管內(nèi)膜的物理屏障功能，分析THP-1的遷移及隨后向HVUECs黏附的情況，即先遷移再黏附，在時間順序上與在體過程不同。

炎癥趨化因子是一類趨化炎癥細胞向炎癥和損傷部位聚集的小分子蛋白，炎癥趨化因子及其受體是治療慢性炎癥重要的藥物作用靶點。趨化因子CX3CL1為跨膜蛋白質(zhì)，主要在血管內(nèi)皮細胞表達，當受到致炎因素刺激時ADAM17被誘導(dǎo)并將CX3CL1裂解生成大量的膜結(jié)合型和溶解型兩部分，二者均可與其受體CX3CR1相互作用發(fā)揮其生物學功能，介導(dǎo)CX3CR1陽性細胞如中性粒細胞、單核細胞、NK細胞、T淋巴細胞等向血管內(nèi)皮細胞遷移和黏附[8]。血管內(nèi)皮是炎癥細胞跨膜轉(zhuǎn)移的第一道屏障，內(nèi)皮細胞表面的CX3CL1被認為是控制炎癥部位炎癥細胞滲出的“門戶”。本研究中使用的CX3CL1為溶解型，在50 ng/mL濃度時可顯著誘導(dǎo)THP-1遷移并向HUVECs黏附，與Wang等[9]報道的一致。

ICA具有很強的抗炎作用，能夠抑制 NF/κB p65信號通路的活化有效調(diào)節(jié)卵白蛋白誘導(dǎo)的大鼠哮喘模型細胞因子的平衡；通過活化PI3K/Akt信號通路、抑制NF-κB信號通路進而下調(diào)TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS mRNA表達，緩解LPS所致的肺部炎癥等[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)ICA能夠有效抑制CX3CL1誘導(dǎo)的THP-1向HUVECs遷移和黏附，在10-8～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)抑制THP-1遷移呈明顯的劑量依賴性，但抑制THP-1黏附效應(yīng)在10-7mol/L和10-6mol/L之間無明顯差異，提示10-8mol/L已接近最小有效濃度。

CX3CL1誘導(dǎo)細胞遷移和黏附與NF-κB有著密切的關(guān)系。NF-κB是一種重要的促炎通路，由p65(RelA)、RelB、c-Rel、p105/p50和p100/p52 5個成員組成[12]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB以p65/p50二聚體形式與其抑制蛋白IκB結(jié)合存在于胞漿，當受到CX3CL1刺激時，NF-κB被激活，磷酸化的p65/p50迅速從胞漿轉(zhuǎn)至胞核(尤其是p65亞型)，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加速炎性疾病的發(fā)生與發(fā)展，為激活炎癥細胞發(fā)生遷移黏附提供了一個重要的途徑[13-14]；活化的NF-κB引起TNF-α表達的上調(diào)[15]，而TNF-α的上調(diào)又可進一步激活CX3CL1[3]。本實驗給予CX3CL1(50 ng/mL) 干預(yù)24 h后，發(fā)現(xiàn)CX3CL1可上調(diào)p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平，表明NF-κB通路被活化。ICA能抑制CX3CL1 所致的p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平的上調(diào)，表明ICA抑制CX3CL1誘導(dǎo)的THP-1向HUVECs遷移和黏附與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究證實ICA能夠抑制CX3CL1誘導(dǎo)的THP-1向HUVECs遷移和黏附，其機制可能與CX3CL1/CX3CR1/NF-κB/TNF-α信號通路有關(guān)。

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[收稿2016-11-16;修回2016-12-30]

(編輯：王靜)

Effects and mechanisms of icariin on migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1

FuXiaoxia1,LuoYunmei1,LiuJuan2,LiuJie1,LiLisheng1

(1.Key Lab of Basic Pharmacology of Education Ministry and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Education Ministry,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Institute of Clinical Medicine,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of icariin (ICA) on migration and adhesion of human acute monocytic leukemia cell line (THP-1) to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by CX3CL1.Methods Transwells were employed to establish the co-culture system of THP-1 and HUVECs,and to measure the migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1.After 4 h of ICA administration,CX3CL1 (50 ng/mL) was added to co-culture system for 24 h.Then the upper chambers of transwells were moved,and the medium was collected for counting the number of the migrated THP-1.The number of adherent THP-1 to HUVECs was observed by immunofluorescence double labeling.Western blot technology was used to evaluate the protein level of CX3CR1,p-NF-κB p65 and TNF-α.Results Compared with the control group,the number of migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1 was significantly increased (P<0.01),and the protein levels of CX3CR1,p-NF-κB p65 and TNF-α were also increased (P<0.05).Pretreatment with ICA could cut down the number of migration and adhesion of THP-1 to HUVECs in dose-dependent manner at the dosage range from 10-8mol/L to 10-6mol/L (P<0.05 orP<0.01),and inhibit the protein levels of CX3CR1,p-NF-κB p65 and TNF-α.Conclusion ICA (10-8～10-6mol/L) inhibit the migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1 through inhibition of CX3CL1/CX3CR1/NF-κB/TNF-α signaling pathway.

icariin; CX3CL1; CX3CR1; NF-κB; THP-1; human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)

國家自然科學基金資助項目(NO：81260654)；貴州省科技廳攻關(guān)項目(NO：黔科合SY字[2011]3019)；貴州省教育廳重點招標項目(NO：黔教科2011019)。

李利生，男，副教授，研究方向：心血管藥理，E-mail:medlls@sina.com。

R965

A

1000-2715(2017)01-0059-05