抗菌肽在家蠅胚胎細(xì)胞中的表達(dá)及活性測(cè)定

王靈軍，王 鑫，賀莉芳，馬元芬，生 燕，劉 暉

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.眉山市彭山區(qū)人民醫(yī)院 普外科，四川 眉山 620860；3.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)教研室，貴州 都勻 558000；4.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

抗菌肽在家蠅胚胎細(xì)胞中的表達(dá)及活性測(cè)定

王靈軍1，王 鑫2，賀莉芳3，馬元芬4，生 燕4，劉 暉1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.眉山市彭山區(qū)人民醫(yī)院 普外科，四川 眉山 620860；3.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)教研室，貴州 都勻 558000；4.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

目的 在原核表達(dá)家蠅抗菌肽Attacin基因的研究基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提高抗菌肽的活性，利用重組桿狀病毒Bacmid-pFastBacTM-Attacin表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC-07114，對(duì)其活性進(jìn)行探索研究。方法 構(gòu)建pFastBacTMHTA質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Escherichiacoli(E.coli)DH10細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆。構(gòu)建抗菌肽Attacin的家蠅胚胎細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)。構(gòu)建Bacmid-pFastBacTM-Attacin表達(dá)系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞，提取培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物粗蛋白，純化，SDS-PAGE和Western-Blot對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。結(jié)果 重組桿狀病毒Bacmid DNA成功轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)分離、停止生長(zhǎng)、直徑變大等現(xiàn)象；培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，在22 KD出現(xiàn)了1條特異性條帶；通過(guò)Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白在家蠅胚胎細(xì)胞中成功表達(dá)；通過(guò)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)測(cè)得其產(chǎn)物有較好的抑菌活性。結(jié)論 與E.coliBL21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)相比，家蠅胚胎細(xì)胞系靈敏度較好，但仍有較大提升空間。

抗菌肽；家蠅胚胎細(xì)胞；桿狀病毒表達(dá)載體；真核表達(dá)

抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一類(lèi)具有抗菌作用的小肽類(lèi)物質(zhì)，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗菌譜廣、活性穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)?？咕某嗽谡婧松锏奶烊幻庖呦到y(tǒng)中扮演重要的角色之外[1-2]，還在食品、飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]，甚至可以有效作用于對(duì)常規(guī)藥物表現(xiàn)出抗藥性的病原微生物，因此得到了廣泛的關(guān)注[4]，并且有望成為理想的抗生素替代品。目前已有多種抗菌肽從原核生物到有機(jī)生物體中得以成功分離并分類(lèi)。 但在抗菌肽生產(chǎn)實(shí)踐中還是面臨諸多問(wèn)題。由于許多抗菌肽具有較高的細(xì)胞毒性,其次抗菌肽的規(guī)?；a(chǎn)也是制約抗菌肽實(shí)際應(yīng)用的難題。基因工程技術(shù)因生產(chǎn)成本低、可規(guī)模生產(chǎn)，成為抗菌肽規(guī)模生產(chǎn)的一條理想途徑。而利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽，如何構(gòu)建高效、穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)是主要問(wèn)題?？咕氖抢ハx(chóng)先天性免疫系統(tǒng)對(duì)各種病原微生物做出快速反應(yīng)的重要組成部分[2]，由于抗菌肽本身具有抗菌活性，對(duì)宿主菌有殺傷作用，因而目前抗菌肽在原核中表達(dá)多采用融合表達(dá)方式。原核系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，但表達(dá)的蛋白往往不能有效正確的翻譯，使得選擇真核表達(dá)系統(tǒng)成為目前抗菌肽基因工程研究的熱點(diǎn)[5-7]。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有安全性高、基因克隆容量大、具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)、 高效表達(dá)外源基因、無(wú)內(nèi)毒素污染等優(yōu)點(diǎn)[8]，利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白，其功能和結(jié)構(gòu)與天然蛋白相似，是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品的有效手段[9]。

本研究以家蠅抗菌肽Attacin為目的基因，利用含桿狀病毒穿梭載體的Bacmid-pFastBacTM-Attacin和自行建立的家蠅胚胎細(xì)胞MDEC-07114構(gòu)建抗菌肽Attacin的桿狀病毒-家蠅胚胎細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)，為抗菌肽Attacin的生物學(xué)活性研究和家蠅胚胎細(xì)胞用于抗菌肽的基因工程生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Attacin基因(Genbank登錄號(hào)AY460106)、家蠅胚胎細(xì)胞系(MDEC-07114)、質(zhì)粒PUC57、pFastBacTMHTA、DH10Bac購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌由遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。

昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基(金普諾安蛋白質(zhì)工程技術(shù)有限公司)；Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；活性蛋白提取試劑盒、Ni-NTA SefinoseTMResin Kit、UNIQ-200柱式質(zhì)粒中量抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；蛋白Marker(日本TaKaRa公司)；BCA蛋白定量試劑盒、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)。DNA Mix酶、Trans2K(中國(guó)北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Ni NTA親和層析填料、ECL顯色液(美國(guó)Thermo公司)；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 凝膠回收純化試劑盒(中國(guó)北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；Page Ruler Prestained Protein Ladder(美國(guó)Thermo公司)。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)SHEL公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；酶標(biāo)儀、電泳儀、PCR儀、紫外分光光度計(jì)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；電轉(zhuǎn)儀PS-9(大連競(jìng)邁科技有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Thermosavant公司)；恒溫?fù)u床(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng))。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增 以課題組前期篩選的候選家蠅抗菌肽為目的基因，設(shè)計(jì)引物時(shí)分別加入酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增獲得目的基因。PCR引物序列如下：

1.2.2 重組載體的構(gòu)建及鑒定 將“1.2.1”中獲得的目的基因和質(zhì)粒PUC57分別用EcoR I、Pst I雙酶切后進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程(上海)股份有限公司有限公司測(cè)序。

1.2.3E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞制備 將E.coliDH10Bac菌液接種到含50 μg/mL卡那霉素和10 μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)取20 μL接種于含50 μg/mL卡那霉素及10 μg/mL四環(huán)素的5 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD=0.5；將備用的1.5 mL離心管和菌液置于冰塊中預(yù)冷，吸取1.2 mL預(yù)冷的菌液至離心管，以5 000 rpm 4 ℃離心5 min，棄上清， 加入800 μL預(yù)冷的50 nmol/L CaCl2，輕輕懸浮并在冰上放置30 min；于4 ℃ 5 000 rpm離心2 min， 棄上清液，加 100 μL預(yù)冷的 50 mmol/L CaCl2，輕輕懸浮，加入等體積預(yù)冷的40%甘油，吹打混勻后分裝，保存在-80 ℃。

1.2.4 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-pFastBacTM-Attacin的制備 將解凍后的感受態(tài)DH10Bac細(xì)胞，轉(zhuǎn)入1.5 mL Ep管里，加入連接產(chǎn)物20 μL，混勻后，冰上孵育30 min；42 ℃熱休克45 s，后置于冰上2 min。加入900 μL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)后離心，棄去上清，輕柔吹起沉淀，混勻；吸取10 μL已轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于IPTG-X-gal篩選平板后培養(yǎng)48 h。挑取白色單菌落，以Bac上的M13引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，產(chǎn)物電泳分析。

1.2.5 Attacin在MDEC-07114細(xì)胞中的表達(dá)及活性測(cè)定

1.2.5.1 家蠅胚胎細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及重組病毒的擴(kuò)增測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDEC-07114細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]。將制備的重組桿狀病毒Bacmid-pFastBacTM-Attacin轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞，分別于感染0、48、72 h記錄細(xì)胞形態(tài)，設(shè)定常規(guī)方法培養(yǎng)為對(duì)照組。擴(kuò)增低滴度P1毒株，從而產(chǎn)生高滴度的毒株P(guān)2(滴度為1×107pfu/mL到1×108pfu/mL)，接種活力>97%的MDEC-07114細(xì)胞6×106個(gè)至培養(yǎng)瓶，加培養(yǎng)液至6 mL，加轉(zhuǎn)染后的病毒上清60 μL(MOI=0.1)培育，離心收集上清。

1.2.5.2 抗菌肽Attacin的表達(dá)測(cè)試 將桿狀病毒株P(guān)2轉(zhuǎn)染MDEC-07114細(xì)胞，收集培養(yǎng)72 h細(xì)胞和培養(yǎng)上清，一步法昆蟲(chóng)細(xì)胞活性蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞裂解物的粗蛋白，上清和細(xì)胞裂解物粗蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量、SDS-PAGE分析鑒定純化前、后各蛋白種類(lèi)。

1.2.5.3 抗菌肽Attacin抑菌活性、穩(wěn)定性檢測(cè) 采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法來(lái)初步檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗菌活性及抗菌譜。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌株配置成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏膽腋∫?，涂布于LB培養(yǎng)板，晾干。將4張重疊的藥敏紙片分別用滅菌雙蒸水、細(xì)胞裂解物、上清提取物、青霉素儲(chǔ)存液(58.7 μg/mL) 、慶大霉素儲(chǔ)存液(96 μg/mL)浸濕，鋪至培養(yǎng)板，培養(yǎng)后觀(guān)察抑菌圈大小，以空載體上清液作為陰性對(duì)照。

1.2.5.4 不同P2感染量下的目的蛋白的表達(dá)與鑒定 設(shè)置50、100、200、250、500 μL P2感染組及空白對(duì)照組，將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)72 h后，對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行蛋白提取、純化后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，觀(guān)察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 目的基因Attacin的克隆及原核載體構(gòu)建和鑒定 以篩選的目的基因Attacin為模板，PCR獲得目的基因克隆入載體PUC57質(zhì)粒，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序獲得陽(yáng)性克??；轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，PUC57重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、Pst I雙酶切后，經(jīng)電泳鑒定，出現(xiàn)長(zhǎng)度約為700 bp目的基因和2 710 bp PUC57質(zhì)粒條帶(見(jiàn)圖1)。

M：DNA marker；1：PUC57-Attacin雙酶切。圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.2 真核表達(dá)載體Bacmid-pFastBacTM-Attacin的構(gòu)建 將上述獲得的片段亞克隆入pFastBacTMHTA供體質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10Bac細(xì)胞，鑒定出陽(yáng)性克隆后，提取重組Bacmid，用M13通用引物擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳。未插入目的片段的pFastBac轉(zhuǎn)座后擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2 430 bp，重組Bacmid的擴(kuò)增產(chǎn)物約為3 100 bp(見(jiàn)圖2)。與理論值一致，證明重組Bacmid構(gòu)建成功。

2.3 Bacmid轉(zhuǎn)染MDEC-07114細(xì)胞 用Bacmid對(duì)家蠅細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別于感染0、48、72 h觀(guān)察細(xì)胞變化，觀(guān)察顯示：對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，細(xì)胞呈圓形梭形及多邊形，透亮，生長(zhǎng)速度無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖3A)； 病毒組細(xì)胞體積相較與對(duì)照組略有增大，到48 h時(shí)，病毒組大部分細(xì)胞停止生長(zhǎng)，體積不再增大，細(xì)胞核增大、顯示不清部分充滿(mǎn)細(xì)胞，出現(xiàn)小泡(見(jiàn)圖3B)；72 h病毒組細(xì)胞停止生長(zhǎng)，有顆粒出現(xiàn)，部分從培養(yǎng)瓶脫離(見(jiàn)圖3C)。

M：DNA marker；1、3、5：Bacmid-pFastBacTM-Attacin PCR產(chǎn)物；2、4、6：陰性克隆。圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

A：對(duì)照組(×400)，箭頭所指為細(xì)胞核；B：48 h病毒組(×400)，箭頭所指細(xì)胞出現(xiàn)小泡；C：72 h病毒組(×400)，箭頭所指細(xì)胞呈顆粒狀。圖3 Bacmid轉(zhuǎn)染家蠅細(xì)胞結(jié)果

2.4 抗菌肽Attacin預(yù)表達(dá)測(cè)試及目的蛋白的純化與分析 BCA法測(cè)得上清總蛋白濃度為5.5 mg/mL，細(xì)胞裂解物總蛋白濃度為3.0 mg/mL，上清純化產(chǎn)物蛋白含量為0.53 mg/mL，細(xì)胞裂解物純化蛋白含量為0.12 mg/mL。SDS-PAGE檢測(cè)經(jīng)鎳柱純化前后的MDEC-07114細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物，在22 KD附近出現(xiàn)特異性條帶，與目的蛋白的理論分子量21.78 KD基本一致(見(jiàn)圖4)。

Western Blot結(jié)果分析各實(shí)驗(yàn)組灰度值明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明各組細(xì)胞培養(yǎng)上清均有抗菌肽Attacin的表達(dá) (見(jiàn)圖5)。

M：marker；1：細(xì)胞裂解物總蛋白；2：細(xì)胞裂解純化物；3：上清總蛋白；4：上清純化物。圖4 SDS-PAGE分析Attacin

圖5 不同病毒用量組的抗菌肽Attacin表達(dá)(A)和灰度值柱形圖(B)

2.5 抗菌肽Attacin活性及耐受性分析 抗菌活性檢測(cè)：MDEC-07114細(xì)胞表達(dá)的抗菌肽Attacin對(duì)供試菌株均出現(xiàn)大小不等的抑菌圈，顯示均有較強(qiáng)的抗菌活性(見(jiàn)圖6)。熱穩(wěn)定性檢測(cè)：MDEC-07114細(xì)胞表達(dá)抗菌肽Attacin對(duì)溫度有較好的耐受性，對(duì)大腸桿菌的抗菌活性在時(shí)間1～20 min，溫度60～100 ℃，沒(méi)有太大變化，甚至100 ℃、30 min時(shí)仍具有抗菌活性(見(jiàn)圖7)。酸堿耐受性檢測(cè)：分別用pH 5.0～10.0的溶液作用于家蠅細(xì)胞表達(dá)抗菌肽Attacin后發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其仍具有抗菌活性(見(jiàn)圖8)。

A：大腸桿菌；B：金黃色葡萄球菌；C:枯草芽孢桿菌。1：滅菌雙蒸水；2：上清提取物；3:細(xì)胞裂解物；A4：慶大霉素；B4,C4：青霉素。圖6 抗菌肽對(duì)供試菌株的抑菌效應(yīng)

圖7 不同溫度和時(shí)間下Attacin對(duì)大腸桿菌的抗菌效果

3 討論

抗菌肽因其獨(dú)特的抗菌效應(yīng)及作用機(jī)制，一直受科研工作者的熱捧。抗菌肽是家蠅自身免疫體系的重要組成成分，在一定程度上對(duì)原蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒、腫瘤等均有抑殺作用[11]。原核表達(dá)系統(tǒng)雖然優(yōu)勢(shì)明顯、應(yīng)用廣泛，但其不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的翻譯后修飾(如二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊等)，存在一定局限性。而真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾機(jī)制接近天然形式，可用于不適宜原核系統(tǒng)如E.coli表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。另外，由于抗菌肽本身具有抗菌作用，表達(dá)產(chǎn)物常常對(duì)宿主會(huì)產(chǎn)生反饋抑制作用，若直接采用原核表達(dá)系統(tǒng)，會(huì)影響其進(jìn)一步表達(dá)。

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，不需要 CO2，適于高密度懸浮培養(yǎng)，表達(dá)水平高，含有哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的諸多翻譯后修飾。Hellers等通過(guò)將cecropin肽原的前體片段克隆到苜蓿斜紋蛾多角體病毒啟動(dòng)子的下游，成功構(gòu)建了昆蟲(chóng)病毒表達(dá)系統(tǒng)，此后多名學(xué)者利用昆蟲(chóng)細(xì)胞成功構(gòu)建抗菌肽基因的表達(dá)系統(tǒng)，且產(chǎn)物產(chǎn)量增加并保留特有的生物活性[12]。現(xiàn)在世界上已建立400多種昆蟲(chóng)細(xì)胞系，我國(guó)有粘蟲(chóng)、家蠶、粉紋夜蛾等20余株昆蟲(chóng)細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生物學(xué)領(lǐng)域。昆蟲(chóng)細(xì)胞主要應(yīng)用于殺蟲(chóng)劑和利用桿狀病毒大量表達(dá)外源基因研究。隨著昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，病毒表達(dá)載體的研發(fā)獲得迅速發(fā)展，細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基也已商品化。雖然近年來(lái)從不同的昆蟲(chóng)中建立了許多的細(xì)胞系，但在蛋白表達(dá)方面表現(xiàn)優(yōu)秀的細(xì)胞系不多， Protein Science公司報(bào)道了細(xì)胞系Express SF+，該細(xì)胞系比現(xiàn)在桿狀病毒載體系統(tǒng)Sf9更優(yōu)秀[13]。目前Sf9和High-5細(xì)胞系是病毒表達(dá)系統(tǒng)中運(yùn)用最為廣泛的，許多學(xué)者通過(guò)各種技術(shù)改造，以期獲得具有活性、高表達(dá)的的產(chǎn)物。趙昆[14]等將?？咕腂ac7-Bac5-βdefense串聯(lián)基因克隆到BAC-To-BACTM重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的pFast HTB載體中，獲得重組桿狀病毒穿梭載體，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得對(duì)大腸桿菌有抑菌作用的目的蛋白。

家蠅胚胎的細(xì)胞系MDEC-07114是本課題組自行建立，能夠穩(wěn)定傳代的昆蟲(chóng)細(xì)胞系。此外，驗(yàn)證其能否高效敏感的作為抗菌肽表達(dá)工具細(xì)胞，非常值得嘗試。因此，本研究成功將包含家蠅抗菌肽Attacin基因的桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到家蠅細(xì)胞系MDEC-07114，后經(jīng)SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)證實(shí)抗菌肽Attacin的表達(dá)。由此可見(jiàn)，課題組自建家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC-07114可用作抗菌肽Attacin的真核表達(dá)工具，該表達(dá)系統(tǒng)的建立不僅為抗菌肽的生產(chǎn)和進(jìn)一步通過(guò)獲得的純化抗菌肽用于抗菌、抗腫瘤等機(jī)理研究打下基礎(chǔ)，也為自建昆蟲(chóng)細(xì)胞系作為工具細(xì)胞進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供方向。

此外，本研究不僅探討了抗菌肽對(duì)致病菌的抑菌作用，還研究了其對(duì)有益菌的影響，為后續(xù)深入研究抗菌肽的抑菌能力及種類(lèi)奠定了基礎(chǔ)。該抗菌肽對(duì)供試菌株的抑菌結(jié)果也說(shuō)明構(gòu)建好的抗菌肽的線(xiàn)性功能區(qū)域尚未形成靶向體，因此也沒(méi)有識(shí)別特定微生物的作用。該類(lèi)抗菌肽可同時(shí)作用于多種有害微生物，而對(duì)有益菌卻不產(chǎn)生過(guò)多的影響[15-16]。這對(duì)維持動(dòng)物胃腸道菌群平衡及健康方面也具有一定的意義。

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[收稿2016-12-30;修回2017-01-24]

(編輯：王靜)

Expression and biologic activity of antimicrobial peptide attacin from housefly embryos cells

WangLingjun1,WangXin2,HeLifang3,MaYuanfen4,ShengYan4,LiuHui1

(1.Department of Parasitology,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of General Surgery,Pengshan District people's Hospital,Meishan Sichuan 620860,China; 3.Department of Pathogenic Biology,College of Basic Medical Science,South Guizhou Medical College,Duyun Guizhou 558000,China; 4.Department of Morphology,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To express antimicrobial peptide in housefly embryos cells by using the recombinant baculovirus Bacmid-pFastBacTM-Attacin,and then further investigate the biologic activity of Attacin.Methods The recombinant plasmid pFastBacTMHTA was constructed,and then transformed into competent cell ofEscherichiacoli(E.coli) DH10Bac.Blue & white selection was performed for choosing positive clone.Subsequently,the housefly embryonic cells (MDEC-07114) were transfected with the prepared recombinant baculovirus Bacmid-pFastBacTM-Attacin.The crude proteins were extracted from the culture supernatant and cells,and then purified with the nickel column.The protein expression was detected by SDS-PAGE and Western Blot.Results The housefly embryonic cells could be successfully transfected by recombinant baculovirus.And the transfected cells showed series of abnormal phenomena such as separation,growth arrest,bigger diameter,etc.The crude proteins extracted from the culture supernatant and cells were analyzed by SDS-PAGE.In the results,a specific band with the molecular weight of 22 KD was observed,which was identified as Attacin through Western Blot.The peptide was certified to have a good antibacterial activity.Conclusion Compared with the prokaryotic expression of antimicrobial peptide inE.coliBL21,the eukaryotic expression in MDEC-07114 cell is more sensitive,but there is still room for improvement.

antibacterial peptide; housefly embryos cells; baculovirus expression vector; eukaryotic expression

衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(NO：WSBKTKT201101)；貴州省教育廳醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)資源開(kāi)發(fā)利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(NO：黔合教人才團(tuán)隊(duì)字[2014]39)。

劉暉，女，碩士，教授，研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)資源開(kāi)發(fā)，E-mail:179433317@qq.com。

R384.2

A

1000-2715(2017)01-0053-06