金釵石斛對(duì)慢性疲勞綜合征大鼠行為學(xué)的改善作用

楊 城，陳 瑩，金 海，周彥娜，陶婷婷，黃厚今

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義市婦幼保健院，貴州 遵義 563000)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

金釵石斛對(duì)慢性疲勞綜合征大鼠行為學(xué)的改善作用

楊 城1,2，陳 瑩1，金 海1，周彥娜1，陶婷婷1，黃厚今1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義市婦幼保健院，貴州 遵義 563000)

目的 研究金釵石斛對(duì)慢性疲勞綜合征(CFS)大鼠行為學(xué)的改善作用。方法 將66只SD雄性大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(N組)、模型組(P1組)、造模+金釵石斛低劑量組(DF組)、造模+金釵石斛中劑量組(DM組)、造模+金釵石斛高劑量組(DH組)，每組各11只。采用睡眠剝奪+力竭游泳法進(jìn)行造模。造模成功后，DL組、DM組、DH組分別給予1、3及5 g/kg金釵石斛水煎液灌胃，N組與P1組灌等體積蒸餾水，1次/d，持續(xù)12 d。灌胃結(jié)束后第2天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，P1組潛伏期明顯高于N組(P<0.05)，與P1組相比，DL組、DM組、DH組潛伏期明顯縮短(P<0.05)；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與N組比較，P1組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，DL組、DM組、DH組與P1組比較，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)，DH組與DL組比較，穿越次數(shù)明顯改善(P<0.05)；有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離實(shí)驗(yàn)中，P1組與N組比較，有效運(yùn)動(dòng)距離明顯減少(P<0.05)，而DL、DM、DH各組較P1組有效運(yùn)動(dòng)距離明顯增加(P<0.05)，DM、DH組與DL組比較，有效運(yùn)動(dòng)距離有所改善(P<0.05)。結(jié)論 金釵石斛可改善CFS大鼠體能狀態(tài)、學(xué)習(xí)記憶能力及行為學(xué)，緩解疲勞癥狀。

金釵石斛；抗疲勞；水迷宮；學(xué)習(xí)記憶

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome,CFS)是由美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心命名的一種新型疾病，其臨床表現(xiàn)為疲乏、頭痛、認(rèn)知功能降低、關(guān)節(jié)痛及咽喉痛等癥狀，患者易出現(xiàn)肥胖或消瘦體型，伴有面容異常、皮膚粗糙、毛發(fā)脫落現(xiàn)象[1-2]。近年來，CFS的發(fā)病率日益增高，關(guān)于CFS的研究目前已成為醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)。

金釵石斛是一種名貴中藥材，有研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛具有抗衰老、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能等作用[3-4]，而有關(guān)抗疲勞和學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)研究較少。本文擬利用CFS大鼠模型，分析金釵石斛對(duì)大鼠行為學(xué)及記憶能力的改善效果，為CFS的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 金釵石斛干(遵義赤水市石堡鄉(xiāng)種植基地)；Fx-200電子分析天平(日本A&D公司)；MT-200 Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；電熱恒溫水浴箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供的66只健康雄性SD大鼠進(jìn)行研究，合格證：SCXK(渝)2012-0005，均為SPF級(jí)，體重180～200 g。飼養(yǎng)間的室內(nèi)溫度18～22 ℃，相對(duì)溫度保持在45%～65%，動(dòng)物室自然節(jié)律采光。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)規(guī)定進(jìn)行操作。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按體重分層采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分成6組：正常對(duì)照組(N組)、模型組(P1組)、造模+金釵石斛水煎劑低劑量組(DL組)、造模+金釵石斛水煎劑中劑量組(DM組)、造模+金釵石斛水煎劑高劑量組(DH組)，每組各11只。

1.2.2 動(dòng)物造模 造模方法參考力竭游泳法[5]+睡眠剝奪Masaaki Tanaka法[6]。每日上午8：00，將大鼠置于水深約60 cm的水池中，負(fù)重5%體重鉛塊游泳，待其游泳至力竭狀態(tài)(力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：運(yùn)動(dòng)范圍縮小，頭部沒入水面下5 s不能浮出水面，認(rèn)為力竭)。游泳結(jié)束1 h后開始睡眠剝奪。在潔凈的飼養(yǎng)籠內(nèi)加入清水至水深約1.5 cm，放入大鼠，常規(guī)喂食，每日剝奪睡眠時(shí)間約為18 h，持續(xù)2周。造模觀察指標(biāo)：精神狀態(tài)、口鼻和尾部外觀、毛發(fā)、體型、糞便形態(tài)顏色、活動(dòng)強(qiáng)度及反應(yīng)力；造模完成之后，參考評(píng)分表[8](見表1)，對(duì)大鼠情況進(jìn)行評(píng)分，情況觀察分值≥3分即為造模成功。

表1 大鼠一般狀態(tài)特征評(píng)分表

分值精神及活動(dòng)狀態(tài)唇、耳、尾顏色毛發(fā)狀況糞便形態(tài)顏色0好動(dòng)、靈活、無瞇眼粉紅色、濕潤(rùn)有光澤毛色有光澤,皮膚有彈性,皮毛整潔糞便成型、干燥、棕黃色1反應(yīng)較慢,自主活動(dòng)減少,瞇眼增加淡粉紅色、略干燥、光澤減少毛發(fā)無光澤、皮膚略松弛,皮下脂肪減少但可觸及,毛發(fā)略有雜亂,輕微脫毛糞便較稀溏,棕黃色2反應(yīng)遲鈍,精神萎靡,對(duì)抗行為基本消失,瞇眼淡白色,干燥,無光澤毛發(fā)無光澤,皮膚松弛,皮下脂肪消失,毛發(fā)雜亂,脫毛嚴(yán)重,斑駁不齊糞便完全稀溏,略帶綠色

1.2.3 金釵石斛水煎液配制 金釵石斛水煎液：以2∶1比例將1 000 mL蒸餾水與500 g生藥進(jìn)行熬制，生藥熬制參照常規(guī)的中藥煎煮方法，在水中泡發(fā)30 min后使用文火熬制，最后熬成1∶1比例的水煎液。熬成的水煎液根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)組所需劑量倍數(shù)，適當(dāng)使用雙蒸水進(jìn)行稀釋。

1.2.4 給藥 采用灌胃方法給予各組動(dòng)物，1次/d，持續(xù)12 d。給藥劑量根據(jù)中國(guó)藥典[9]推薦的金釵石斛劑量，給予DL組1 g/kg、DM組3 g/kg、DH組5 g/kg金釵石斛水煎液。給予N組、P1組灌等體積蒸餾水。

1.2.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 給藥后第2天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。在迷宮注入水，漫過平臺(tái)2 cm，根據(jù)第1至4象限順序在迷宮內(nèi)放入大鼠，象限1個(gè)/d，每只最長(zhǎng)時(shí)限為120 s，2次/d，學(xué)習(xí)4 d，記錄大鼠找到平臺(tái)時(shí)間。訓(xùn)練學(xué)習(xí)4 d后，將平臺(tái)撤除，從第1象限迷宮放入大鼠，測(cè)試并記錄有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、穿過平臺(tái)次數(shù)[10]。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 開始造模后，N組大鼠飲食、飲水正常，無異常表現(xiàn)，其余各組隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠飲水、飲食量逐漸減少，精神狀況差，反應(yīng)遲鈍，對(duì)刺激不敏感，瞇眼明顯，毛發(fā)雜亂，有腹瀉情況。給藥后上述情況有所緩解，DH組效果較為明顯。

2.2 造模結(jié)果 造模結(jié)束后，與N組比較，P1組、DL組、DM組、DH組、DF組評(píng)分明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造模成功(見表2)。

組別分值FPN0.45±0.82P16.82±0.98△DL6.73±0.90△71.380.000DM6.45±1.04△DH6.91±0.94△

△：與N組比較，P<0.05。

2.3 空間探索穿越平臺(tái)次數(shù)、有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離對(duì)比 在穿越平臺(tái)次數(shù)中，P1組穿越平臺(tái)次數(shù)低于N組(P<0.05)；DL組、DM組和DH組穿越平臺(tái)次數(shù)均高于P1組(P<0.05)，DH組穿越平臺(tái)次數(shù)高于DL組(P<0.05)。在有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離中，P1組有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離低于N組(P<0.05)；DL組、DM組和DH組有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離均高于P1組(P<0.05)，且以DH組有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離最長(zhǎng)，其次是DM組；DH組DM組穿越平臺(tái)次數(shù)均高于DL組(P<0.05，見表3)。

2.4 大鼠血清SOD指標(biāo)檢測(cè) 與空白對(duì)照組比較，P1組的血清SOD含量明顯降低(P<0.05)；給予金釵石斛與金釵石斛花水煎液干預(yù)后，各給藥組的血清SOD含量明顯高于P1組(P<0.05)；DM和DH組干預(yù)效果好于DL組(P<0.05，見表3)。

組別穿越平臺(tái)次數(shù)(次)有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離(cm)血清總SOD活力(U/mL)N25.18±8.057977.44±1097.77128.77±28.24P115.00±5.62*5156.02±1062.06*91.17±30.68*DL26.73±4.50#8644.02±2109.09#160.76±33.54*#DM29.55±5.75#10403.23±3062.61*#&191.50±30.64*#&DH36.00±5.85*#&10823.47±4104.64*#&202.45±20.86*#&

*：與N組比較，P<0.05；#：與P1組比較，P<0.05；&：與DL組比較，P<0.05。

3 討論

近年來，隨著我國(guó)居民生活環(huán)境的改變，加之生活節(jié)奏變快、精神壓力大、睡眠質(zhì)量差，導(dǎo)致慢性疲勞綜合征患者數(shù)量不斷增加，過勞死患者例數(shù)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害患者生命安全[11]。目前CFS的治療多選用傳統(tǒng)的滋補(bǔ)益方[12-13]，金釵石斛是一種名貴中藥，被《神農(nóng)百草經(jīng)》列為上品，但有關(guān)治療CFS的報(bào)道甚少。

本實(shí)驗(yàn)采用“力竭游泳+睡眠剝奪”的方法模擬人軀體及心理的復(fù)合因素，使大鼠在過度消耗體力的同時(shí)產(chǎn)生恐懼、焦慮等心理問題，全方位模擬目前國(guó)民生活和工作作息不規(guī)律、精神壓力大等綜合因素。本實(shí)驗(yàn)從造模開始密切監(jiān)測(cè)大鼠一般情況，一定程度上可以反映出大鼠的精神狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，從建模第8天開始，各造模組大鼠飲食和飲水量明顯減少，瞇眼情況嚴(yán)重，皮毛不光滑，提示剝奪睡眠和強(qiáng)迫游泳可能引起大鼠精神抑郁或其他心理問題。張亞軍[14]等也認(rèn)為：長(zhǎng)時(shí)間的束縛和強(qiáng)迫游泳會(huì)引起小鼠抑郁情緒和身體消瘦情況。

Morris水迷宮作為一種經(jīng)典的測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶功能方法，可從客觀角度對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行反映。隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)中，逃避潛伏期反應(yīng)大鼠學(xué)習(xí)能力的變化，移開平臺(tái)空間搜索實(shí)驗(yàn)中，穿越平臺(tái)次數(shù)反應(yīng)小鼠記憶力水平。CFS建模動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力下降[15]，與CFS患者注意力和記憶力衰退的情況相似，提示通過學(xué)習(xí)記憶能力可以評(píng)判CFS模型及金釵石斛的干預(yù)效果。本研究發(fā)現(xiàn)：給予金釵石斛干預(yù)的大鼠空間探索穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于P1組，DH組CFS大鼠干預(yù)效果明顯好于DL組，說明金釵石斛有改善CFS大鼠的空間學(xué)習(xí)能力的作用；有研究認(rèn)為，CFS是一種大腦不能自行停止的的慢性超氧化狀態(tài)疾病[16]。大腦處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)造成海馬神經(jīng)元凋亡增加，惡化空間學(xué)習(xí)記憶能力[17-18]。由表3可以得知，金釵石斛可以明顯增加大鼠血清SOD的含量，提高大鼠抗氧化的能力，由此推測(cè)其改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能是增強(qiáng)大鼠抗氧化能力，繼而可以降低或緩解海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)；此外，陶婷婷[19]等認(rèn)為，體內(nèi)自由基的清除與改善疲勞狀態(tài)有密切關(guān)系，金釵石斛能夠增加血清中SOD的含量，由此推測(cè)金釵石斛可能具有抗疲勞的功效。在有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離實(shí)驗(yàn)中，P1組大鼠的運(yùn)動(dòng)距離明顯低于正常對(duì)照組，給予金釵石斛干預(yù)后有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離明顯得到改善，DM組、DH組干預(yù)效果好于DL組，說明金釵石斛可以改善大鼠空間記憶的能力，其機(jī)制可能與有效清除體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基有關(guān)。

綜上所述，金釵石斛可明顯改善慢性疲勞綜合癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其可能的機(jī)制與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少自由基引起的氧化應(yīng)激有關(guān)。

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[收稿2016-12-13;修回2017-01-21]

(編輯：王靜)

Effects ofDendrobiumNobileon the behavior of rats with chronic fatigue syndrome

YangCheng1,2,ChenYing1,JinHai1,ZhouYanna1,TaoTingting1,HuangHoujin1

(1.Department of Toxicology,School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Zunyi Maternal and Child Health Care Hospital,Zunyi Guizhou 563000,China)

Objective To study the effects ofDendrobiumnobileon the behavior of chronic fatigue syndrome (CFS) rats.Methods 66 SD male rats were randomly divided into five groups (each group of 11 rats),including negative control group (N group),model group (P1 group),Dendrobiumnobileintervention group in dosage of low,medium and high (marked as DL,DM and DH group).Sleep deprivation and exhaustive swimming were used to establish the model.DL,DM and DH group received intragastric administration of 1,3 and 5 g/kg Dendrobium decoction respectively once a day for 12 days.N group and P1group were administrated equal volume of distilled water.On the second day after administration,the Morris water maze test was performed,and the related indexes were detected.Results In the Morris water maze experiment,the escape latent period of P1 group was significantly longer than N group (P<0.05).Compared with P1 group,the escape latency of DL,DM and DH group was shortened (P<0.05).The results of the space exploration experiment indicated that the times of crossing the platform was obviously decreased in P1 group.Compared with P1 group,the times were increased in DL,DM and DH group (P<0.05).The effect of the intervention on DH group was better than on DL group (P<0.05).For the exercise distance within range,it was the shortest in P1 group among all groups (P<0.05).And the distances were farther in DL,DM and DH group than in P1 group (P<0.05).ConclusionDendrobiumnobilecould improve physical state,learning and memory ability,and behavior of CFS rats,and alleviate the symptoms of fatigue.

Dendrobiumnobile; anti-fatigue; water maze; learning and memory

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科教[2009]04)。

黃厚今，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：營(yíng)養(yǎng)毒理學(xué)，E-mail:1026553087@qq.com。

R114

A

1000-2715(2017)01-0049-04