殼聚糖-磺酸甜菜堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的siRNA遞送實(shí)驗(yàn)研究

董 偉，李大玉，惠 景，范 芳，李長(zhǎng)福，姜 念，劉 云，朱欣婷

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

殼聚糖-磺酸甜菜堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的siRNA遞送實(shí)驗(yàn)研究

董 偉1,2，李大玉2，惠 景1,2，范 芳1,2，李長(zhǎng)福1,2，姜 念1，劉 云1，朱欣婷1,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 設(shè)計(jì)合成新型高分子材料殼聚糖-磺酸甜菜堿(CS-DMAAPS)化合物，并考察該材料與siRNA復(fù)凝后對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力。方法 采取Michael加成法將含C=C雙鍵的磺酸甜菜堿化合物(DMAAPS)與殼聚糖(CS)偶聯(lián)接枝；利用核磁共振氫譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；CCK-8檢測(cè)材料的細(xì)胞相容性；熒光顯微鏡觀(guān)察siRNA的轉(zhuǎn)染效率；Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)Bcl-2 mRNA的沉默效率。結(jié)果 核磁共振氫譜數(shù)據(jù)表明：DMAAPS已成功枝接到CS上。熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果顯示：質(zhì)量比(m0/mt：CS-DMAAPS/siRNA)為32、16、8、4、2的復(fù)合顆粒分別轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)染率分別為33.78%、45.82%、50.98%、69.89%、81.22%。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：質(zhì)量比為4的CS-DMAAPS/siRNA復(fù)合顆粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的Bcl-2基因沉默效率為26.8%。結(jié)論 殼聚糖-磺酸甜菜堿(CS-DMAAPS)化合物能實(shí)現(xiàn)siRNA對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，且細(xì)胞相容性良好，能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的部分沉默。

殼聚糖；磺酸甜菜堿化合物；復(fù)合顆粒；人肝癌HepG-2細(xì)胞；siRNA

上世紀(jì)60年代，著名分子生物學(xué)家Joshua Lederberg認(rèn)為分子生物學(xué)最終的應(yīng)用將是直接控制人類(lèi)染色體上的某些核苷酸序列[1]。因此科學(xué)家們從上世紀(jì)90年代就開(kāi)始進(jìn)行基因治療試驗(yàn)[2-3]，但隨之發(fā)生的由于受試者對(duì)腺病毒載體的致命免疫反應(yīng)而導(dǎo)致死亡的“杰辛格事件”[4-5]，以及由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的異常整合誘發(fā)患者白血病的惡性事件[6]，人們對(duì)病毒性載體的安全性質(zhì)疑極為強(qiáng)烈。病毒型載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但它具有諸多缺陷，如毒性大、免疫反應(yīng)強(qiáng)烈、基因容量小、靶向性差、制備過(guò)程復(fù)雜等[7]，并且病毒具有一定的致病性，因此安全性成了病毒型載體的致命缺點(diǎn)，并使之臨床應(yīng)用受到極大限制。因此，研究者將目光投向了非病毒載體的構(gòu)建上。在眾多非病毒載體材料中，最受人們關(guān)注的為殼聚糖這一含氮高分子化合物，其具有低毒性、生物安全性好、易修飾等特性；但由于其基因遞送效率極低，獲得高效率基因表達(dá)比較困難[8-11]，嚴(yán)重影響其進(jìn)一步利用。因此，在殼聚糖的基礎(chǔ)上進(jìn)行改性，賦予其更強(qiáng)的基因遞送能力是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

甜菜堿衍生物——N,N-二甲基(丙烯酰胺丙基)丙烷磺酸銨(DMAAPS)是一種兩性鹽，由于內(nèi)鹽分子內(nèi)靜電相互作用使其體現(xiàn)出超親水性，兩性鹽改性的材料表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抵抗非特異性結(jié)合的蛋白吸附、抵抗細(xì)菌粘附和生物膜形成的能力，在其作為基因遞送材料進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，易于形成納米顆粒，并能夠使其在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)之后免受核酸酶的降解，便于細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體逃逸[12]；因此，本研究試圖利用上述甜菜堿衍生物的特性，采用化學(xué)偶聯(lián)的方法將其與殼聚糖(CS)接枝，以期獲得細(xì)胞相容性好，高效遞送siRNA的新型殼聚糖衍生物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó)Hyclone公司；PBS粉末，生工生物工程(上海)有限公司；N,N-羰基二咪唑(CDI)，上海百靈威公司；N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(DMAPPA)、1,3-丙磺酸內(nèi)酯，上海梯希愛(ài)公司；殼聚糖，浙江金殼藥業(yè)有限公司；Bcl-2siRNA序列：sense strand,5’-GUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3’; antisense strand,5’-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3’參考文獻(xiàn)[13]合成，并標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，委托上海吉瑪基因公司合成；Real-time PCR引物：Bcl-2上游5′-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′；下游3′-CCAAACTGAGCAGAGTCTTC-5′。GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；下游3′-CTTCTGACACCTACCGGGGA-5′，委托生工生物工程(上海)有限公司合成；氘代三氟乙酸(TFA)，美國(guó)CIL公司；丙酮、乙酸，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)。

1.1.2 肝癌細(xì)胞株 人肝癌HepG-2細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 主要儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱、Multiskanspectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司； NikonYS100熒光顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 磺酸甜菜堿衍生物(DMAAPS)的制備 稱(chēng)量4.0 g DMAPPA溶于20 mL無(wú)水丙酮中，同時(shí)稱(chēng)取3.0 g 1,3-丙磺酸內(nèi)酯溶于另20 mL無(wú)水丙酮中，待DMAPPA和1,3-丙磺酸內(nèi)酯完全溶解后，將1,3-丙磺酸內(nèi)酯在30 min之內(nèi)逐滴加入到DMAPPA中，并不斷攪拌，在室溫25 ℃環(huán)境下反應(yīng)16 h。反應(yīng)完畢之后，取反應(yīng)液離心過(guò)濾，得到白色沉淀，用無(wú)水丙酮反復(fù)清洗沉淀3～4次，最后真空干燥即得DMAAPS[14-16]。

1.2.2 殼聚糖-磺酸甜菜堿化合物(CS-DMAAPS)的合成 取殼聚糖1.0 g溶于1% 醋酸中，待完全溶解后加入0.223 g CDI(N,N-羰基二咪唑)攪拌1 h，分別取0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 g DMAAPS加入到殼聚糖溶液中，在室溫25 ℃環(huán)境下攪拌反應(yīng)24 h，3.5 KD分子量透析48 h，將透析后的液體真空冷凍干燥即得樣品。

1.2.3 CS-DMAAPS的核磁共振氫譜表征檢測(cè) 稱(chēng)取3 mg樣品溶于 600 μL 5%的氘代三氟乙酸(TFA)溶劑中，利用400 MHZ核磁共振儀進(jìn)行CS-DMAAPS的氫譜檢測(cè)。

1.2.4 CS-DMAAPS與人肝癌HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG-2細(xì)胞接種于96孔培基養(yǎng)板中，8×103個(gè)細(xì)胞/孔，加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)14 h后棄去培養(yǎng)基，置換新鮮含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔90 μL，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；同時(shí)每孔加入10 μL不同濃度的CS-DMAAPS溶液(6.25、12.5、25、50至100 μg/mL)；分別培養(yǎng)12、24、48 h后加入10 μL CCK-8溶液，利用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)其吸光度。

1.2.5 CS-DMAAPS/siRNA復(fù)合顆粒的制備 將4 mg CS-DMAAPS溶于40 mL無(wú)菌水中，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，配成100 μg/mL CS-DMAAPS，53 ℃孵育10 min；用50 mmol/L的無(wú)菌硫酸鈉溶液將siRNA-FAM分別稀釋成3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的濃度，稀釋后分別與CS-DMAAPS等體積混合，間歇渦旋25 s后，在室溫(25 ℃)下靜置30 min，制備出不同濃度的siRNA-FAM的復(fù)合顆粒，即質(zhì)量比(m0/mt)分別為32、16、8、4、2的5個(gè)樣本(m0為CS-DMAAPS，mt為siRNA)。

1.2.6 凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)證明CS-DMAAPS顆粒與siRNA的結(jié)合 將CS-DMAAPS配制成1 μg/μL體系，分別取1、2、4、8 μL與2 μL濃度2 μmol/L的siRNA-FAM結(jié)合，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其結(jié)合吸附情況。

1.2.7 CS-DMAAPS/siRNA復(fù)合顆粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞 將人肝癌HepG-2細(xì)胞以4×105個(gè)/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)75%左右，吸去每孔培養(yǎng)液，用未加血清的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕潤(rùn)洗3次，將質(zhì)量比(m0/mt)32、16、8、4、2的5種CS-DMAAPS/siRNA-FAM復(fù)合顆粒分別加至相應(yīng)培養(yǎng)孔中，每孔100 μL，再用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足至400 μL。轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察、拍照、計(jì)數(shù)，每孔取5個(gè)視野，計(jì)算出每個(gè)視野下的總細(xì)胞數(shù)和相同視野下熒光細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染效率=每個(gè)視野下的熒光細(xì)胞數(shù)/相同視野下的細(xì)胞總數(shù)×100%。隨后選用m0/mt=8和m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA-FAM復(fù)合顆粒分別轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞48、72、96 h后，按上述方法計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.8 Real-time PCR 檢測(cè)Bcl-2 mRNA水平的沉默效率 實(shí)驗(yàn)共分為3 組： Control組、CS-DMAAPS 組、CS-DMAAPS/siRNA-FAM實(shí)驗(yàn)組。用m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞 48 h后，按RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取各組細(xì)胞總RNA，用Real-time PCR儀檢測(cè)(SYBR Green染料法)各組樣品Bcl-2 mRNA 表達(dá)量，根據(jù)Ct值通過(guò)公式2-(△△Ct)進(jìn)行相對(duì)定量分析計(jì)算可得Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CS-DMAAPS高分子材料的核磁共振氫譜 觀(guān)察CS(見(jiàn)圖1A)和CS-DMAAPS(見(jiàn)圖1B)的1HNMR(D2O)譜圖，依據(jù)各物質(zhì)官能團(tuán)特征峰歸屬及峰裂分現(xiàn)象，化學(xué)位移δ：2.0～1.8 ppm處有CS中-COCH3，-CH3的特征峰[17]，以此峰作為兩圖中各自的標(biāo)準(zhǔn)峰作積分高度對(duì)照；圖1B中δ：3.2～3.3 ppm處有專(zhuān)屬DMAAPS中-N+CH3的微小特征吸收峰[15]；對(duì)兩圖化學(xué)位移δ特征峰處進(jìn)行積分比較，B圖中δ：5.92 ppm處有峰且積分面積為1.88，說(shuō)明CS上已經(jīng)成功接枝上DMAAPS；且對(duì)比A、B圖，B圖中δ：5.5 ppm左右處由高峰變?yōu)榈头澹逵辛逊脂F(xiàn)象，由原來(lái)的單峰變?yōu)槎喾逡嗫烧f(shuō)明C-C鍵間-H的增加； A、B圖中δ：3.9 ppm處均有峰且積分面積為1 065.89、31.00，B圖中δ：2.8 ppm處的峰積分面積2.14，在占整個(gè)峰積分面積中的比例相對(duì)于A圖中δ：2.97 ppm處峰積分面積在占整個(gè)峰積分面積中的比例，僅為其比例的4%。受到雜質(zhì)峰或溶劑峰的影響目標(biāo)峰有所偏移屬于正?，F(xiàn)象，但這并不影響DMAAPS已成功接枝上CS的判斷，綜上判斷：CS已經(jīng)成功枝接DMAAPS。

2.2 CS-DMAAPS的細(xì)胞相容性評(píng)價(jià) 不同濃度的CS-DMAAPS作用于人肝癌HepG-2細(xì)胞后，在不同的時(shí)間點(diǎn)利用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：與空白對(duì)照組相比(P<0.05)，各CS-DMAAPS濃度組都表現(xiàn)出很低的細(xì)胞毒性；且當(dāng)CS-DMAAPS高達(dá)100 μg/mL并作用48 h后，其細(xì)胞存活率也在90%左右，由此可見(jiàn)，CS-DMAAPS的細(xì)胞相容性很好。

圖1 核磁共振氫譜峰面積積分?jǐn)?shù)據(jù)圖CS(A)和CS-DMAAPS(B)

圖2 CS-DMAAPS對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的毒性

2.3 瓊脂糖凝膠電泳證明材料與siRNA的結(jié)合 如圖3所示：未經(jīng)包裹的siRNA-FAM能通過(guò)電泳形成明亮的條帶；當(dāng)CS-DMAAPS與siRNA-FAM的體積混合比例為1∶2和1∶1(v/v)時(shí)，siRNA條帶亮度明顯降低；當(dāng)材料與siRNA-FAM濃度比例為2∶1和4∶1(v/v)時(shí)siRNA條帶基本消失；該現(xiàn)象說(shuō)明CS-DMAAPS能通過(guò)表面-NH2和季銨正離子基團(tuán)所攜帶的正電荷能將siRNA-FAM吸附住，并且經(jīng)瓊脂糖電泳也很難將siRNA從CS-DMAAPS上脫離開(kāi)來(lái)；該現(xiàn)象說(shuō)明CS-DMAAPS能與siRNA有效結(jié)合。

圖3 CS-DMAAPS/siRNA復(fù)合物的凝膠阻滯電泳

2.4 檢測(cè)CS-DMAAPS/siRNA-復(fù)合顆粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

2.4.1 不同濃度的CS-DMAAPS/siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 質(zhì)量比(m0/mt)為32，16，8，4，2的CS-DMAAPS/siRNA復(fù)合顆粒分別轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)染效率分別為33.8%、45.8%、51.0%、69.9%、81.2%，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性(見(jiàn)圖4)。另外，熒光顯微鏡成像情況表明，攜有FAM的復(fù)合顆粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞后能夠很容易進(jìn)入胞內(nèi)(見(jiàn)圖5)。

圖4 CS-DMAAPS/siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞的效率

A:m0/mt=0; B:m0/mt= 8; C:m0/mt=4; 熒光光源(A,B,C); 明場(chǎng)(A1,B1,C1); 明場(chǎng)+熒光光源(A2,B2,C2)。
圖5 CS-DMAAPS/siRNA轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡成像情況(×100)

2.4.2 轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響 選用m0/mt=8和m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA復(fù)合顆粒分別觀(guān)察轉(zhuǎn)染后48、72和96 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)染效率。如圖6顯示，隨著轉(zhuǎn)染后持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其轉(zhuǎn)染效率在下降。

圖6 轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)CS-DMAAPS/siRNA的轉(zhuǎn)染效率的影響

2.5 Real-time PCR檢測(cè)Bcl-2 mRNA水平的沉默效率 由圖7可見(jiàn)，將m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，Bcl-2 mRNA的表達(dá)量減少(P<0.05)，且Bcl-2 mRNA 水平的沉默效率為26.8%。

n=3，*：P<0.05。 圖7 RT-PCR CS-DMAAPS/siRNA對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的影響

3 討論

目前，基因治療載體系統(tǒng)主要包括兩類(lèi)：病毒載體和非病毒載體，兩者在使用中都具有局限性。已知的病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但容易引起病毒野生型突變、免疫反應(yīng)、潛在致癌性等[7]；非病毒載體雖難有高效率表達(dá)[8]，但卻有病毒載體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)：如易降解，安全性較高且來(lái)源廣泛。

非病毒載體中的殼聚糖(CS)具有高陽(yáng)離子電勢(shì)和較低的細(xì)胞毒性，是一種具有良好細(xì)胞相容性和生物降解性的天然高分子材料[18]。但是，CS的低轉(zhuǎn)染率極大限制了其在基因遞送中的應(yīng)用[19]。既往研究表明，殼聚糖及其衍生物作為非病毒載體被廣泛用于基因遞送，殼聚糖-聚乙烯亞胺顆粒[20-23]是眾多研究中報(bào)道最多的。隨后，又報(bào)道了眾多殼聚糖衍生物，如殼聚糖-三聚磷酸鹽納米顆粒[24-25]、聚乙烯亞胺-羧甲基殼聚糖聚合物[26]、殼聚糖-磷酰膽堿和大環(huán)多胺[27]、殼聚糖-聚L-精氨酸顆粒[28]、殼聚糖-硫胺素焦磷酸鹽[29]、季銨鹽化的殼聚糖[30]等，這些殼聚糖衍生物在保留了殼聚糖的低細(xì)胞毒性、高生物相容性的基礎(chǔ)上，還具有殼聚糖無(wú)法比擬的高轉(zhuǎn)染效率。分析這些殼聚糖衍生物，可發(fā)現(xiàn)它們具有一個(gè)共同點(diǎn)：殼聚糖接枝的化合物都含有氮元素，這為新型殼聚糖衍生物基因遞送材料的合成提供了參考。

甜菜堿衍生物——N,N-二甲基(丙烯酰胺丙基)丙烷磺酸銨(DMAAPS)作為基因遞送材料進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，易于形成納米顆粒，并能夠使其在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)之后免受核酸酶的降解，便于細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體逃逸[12]。另有研究顯示，高濃度的DMAAPS對(duì)許多酶及其他生物大分子的構(gòu)象不但沒(méi)有影響，甚至有一定保護(hù)作用[31-32]。此外，有研究報(bào)道了PEI枝接DMAAPS后具有良好的轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。受此啟發(fā)，本實(shí)驗(yàn)在CS基礎(chǔ)上成功枝接DMAAPS合成了一種新的基因遞送材料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量比(m0/mt：CS-DMAAPS/ siRNA)為32、16、8、4、2的復(fù)合顆粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)染效率分別為33.78%、45.82%、50.98%、69.89%、81.22%。m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA復(fù)合顆粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，對(duì)HepG-2的Bcl-2基因沉默效率為26.8%。

本實(shí)驗(yàn)首次將CS和DMAAPS枝連，將其作為基因遞送材料轉(zhuǎn)染人肝癌HepG-2細(xì)胞時(shí)，能夠有效裝載siRNA并通過(guò)細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)遞送，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率且保持了良好的細(xì)胞相容性、低細(xì)胞毒性的優(yōu)點(diǎn)，最終實(shí)現(xiàn)基因沉默。研究結(jié)果表明殼聚糖-磺酸基甜菜堿(CS-DMAAPS)化合物在遞送siRNA方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

[1] Lederberg J.Molecular biology,eugenics and euphenics[J].Nature,1963,198(4879):428-429.

[2] Rosenberg S A,Aebersold P,Cornetta K,et al.Gene transfer into humans-immunotherapy of patients with advanced melanoma,using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction[J].New England Journal of Medicine,1990,323(9):570-578.

[3] Blaese R M,Culver K W,Miller A D,et al.T lymphocyte-directed gene therapy for ADA-SCID:initial trial results after 4 years[J].Science,1995,270(5235):475-480.

[4] Fox J.Gene therapy safety issues come to fore[J].Nature Biotechnology,1999,17(12):1153.

[5] Raper S E,Chirmule N,Lee F S,et al.Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer[J].Molecular Genetics & Metabolism,2003,80(2):148-158.

[6] Haceinbeyabina S,Von K C,Schmidt M,et al.A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency[J].New England Journal of Medicine,2003,348(3):255-256.

[7] Lim M J,Min S H,Lee J J,et al.Targeted therapy of DNA tumor virus-associated cancers using virus-activated transcription factors[J].Molecular Therapy the Journal of the American Society of Gene Therapy,2006,13(5):899-909.

[8] Brown M D,Sch?tzlein A G,Uchegbu I F.Gene delivery with synthetic (non viral) carriers[J].International Journal of Pharmaceutics,2001,229(12):1-21.

[9] Hill A B ，Chen M，Chen C K，et al.Overcoming gene-delivery hurdles:physiological considerations for nonviral vectors[J].Trends in Biotechnology,2016,34(2):91-105.

[10] Borchard G.Chitosans for gene delivery[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2001,52(2):145-150.

[11] Akbuga J,OzbasTuran S,Ekentok C.Chitosan Nanoparticles in Gene Delivery[M]// Percutaneous Penetration Enhancers Chemical Methods in Penetration Enhancement,2016.

[12] 張娟.甜菜堿衍生物在基因載體材料中的應(yīng)用[D].浙江大學(xué),2011.

[13] Chen A M,Zhang M,Wei D,et al.Co-delivery of doxorubicin andBcl2 siRNA by mesoporous silica nanoparticles enhances the efficacy of chemotherapy in multidrug-resistant cancer cells[J].Small,2009,5(23):2673-2677.

[14] Gang F,Fang Z,Yu C,et al.Low molecular weight PEIs modified by hydrazine-based crosslinker and betaine as improved gene carriers[J].Colloids & Surfaces B Biointerfaces,2014,122:472-481.

[15] 方剛.低分子量PEI的改性及在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用[D].華南理工大學(xué),2014.

[16] Lee W F,Tsai C C.Synthesis and solubility of the poly (sulfobetaine)s and the corresponding cationic polymers:1.Synthesis and characterization of sulfobetaines and the corresponding cationic monomers by nuclear magnetic resonance spectra[J].Polymer,1994,35(10):2210-2217.

[17] Rekha M R,Sharma C P.Polymers for gene delivery:current status and future perspectives[J].Recent Pat DNA Gene Seq,2012,6(2):98-107.

[18] Miao P,Caixia H E,Gao J,et al.Progress of PEI-based cationicpolymers as non-viral gene vectors[J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy,2011,28(6):505-510.

[19] Gaymes T J,Mohamedali A M,Patterson M,et al.Microsatellite instability induced mutations in DNA repair genes CtIP and MRE11 confer hypersensitivity to poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors in myeloid malignancies[J].Haematologica,2013,98(9):1397-1406.

[20] Poth N,Seiffart V,Gross G,et al.Biodegradable chitosan nanoparticle coatings on titanium for the delivery of BMP-2[J].Biomolecules,2015,5(1):3-19.

[21] Li L,Zhao F,Zhao B,et al.Chitosan grafted with phosphorylcholine and macrocyclic polyamine as an effective gene delivery vector:preparation,characterization and in vitro transfection[J].Macromolecular Bioscience,2015,15(7):912-926.

[22] Arote R,Nah J W,Cho M H,et al.Chitosan-graft-polyethylenimine as a gene carrier[J].Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society,2007,117(2):273-280.

[23] Karimi M,Avci P,Mobasseri R,et al.The novel albuminchitosan core-shell nanoparticles for gene delivery:preparation,optimization and cell uptake investigation[J].Journal of Nanoparticle Research,2013,15(5):122-125

[24] Ragelle H,Colombo S,Pourcelle V,et al.Intracellular siRNA delivery dynamics of integrin-targeted,PEGylated chitosan-poly(ethylene imine) hybrid nanoparticles:A mechanistic insight[J].Journal of Controlled Release,2015,211:1-9.

[25] Chen H,Cui S,Zhao Y,et al.Grafting chitosan with polyethylenimine in an ionic liquid for efficient gene delivery.[J].Plos One,2015,10(4) :e0121817.

[26] Bahreini E,Aghaiypour K,Abbasalipourkabir R,et al.Preparation and nanoencapsulation of L-asparaginase II in chitosan-tripolyphosphate nanoparticles and in vitro release study[J].Nanoscale Research Letters,2014,9(1):1-13.

[27] Park S C,Nam J P,Kim Y M,et al.Branched polyethylenimine-grafted-carboxymethyl chitosan copolymer enhances the delivery of pDNA or siRNA in vitro and in vivo[J].International Journal of Nanomedicine,2013,8(3):3663-3677.

[28] Plianwong S,Opanasopit P,Ngawhirunpat T, et al.Chitosan combined with poly-L-arginine as efficient,safe,and serum-insensitive vehicle with RNase protection ability for siRNA delivery[J].Biomed Research International,2013,2013(4):574136.

[29] Rojanarata T,Opanasopit P,Techaarpornkul S,et al.Chitosanthiamine pyrophosphate as a novel carrier for siRNA delivery[J].Pharmaceutical Research,2008,25(12):2807-2814.

[30] Li G F,Wang J C,Feng X M,et al.Preparation and testing of quaternized chitosan nanoparticles as gene delivery vehicles[J].Applied Biochemistry & Biotechnology,2015,175(7):3244-3257.

[31] Zobel H P,Stieneker F,Aziz A A,et al.Evaluation of aminoalkylmethacrylate nanoparticles as colloidal drug carrier systems.Part II:characterization of antisense oligonucleotides loaded copolymer nanoparticles[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,1999,48(1):1-12.

[32] 梁冬生,蘇曉鷗,陳益眾.甜菜堿[J].飼料工業(yè),1997,18(3):34-37.

[收稿2016-12-10;修回2017-01-22]

(編輯：王靜)

Research on siRNA delivery mediated by chitosan-culfobetaine on human hepatoma HepG-2 cells

DongWei1,2,LiDayu2,HuiJing1,2,FanFang1,2,LiChangfu1,2,JiangNian1,LiuYun1,ZhuXinting1,2

(1.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective The aim of this study is to synthesize the chitosan-sulfobetaine (CS-DMAAPS) copolymer as siRNA delivery vector,and investigate the transfection efficiency on HepG-2 cells.Methods The sulfonic acid betaine (DMAAPS) with C=C was grafted onto chitosan (CS) by Michael addition method,and the structure of the copolymer was characterized with1H-NMR.The cytocompatibility of CS-DMAAPS was examined through CCK-8 method.The transfection efficiency of CS-DMAAPS was observed with fluorescence microscopy.And the silencing efficiency ofBcl-2 gene expression was detected after siRNA gene transfection.Results NMR data showed that DMAAPS had been successfully connected to CS.The transfection efficiencies of the copolymers with different CS-DMAAPS/siRNA mass ratio (m0/mt:32,16,8,4 and 2) were not same.They were 33.78%,45.82%,50.98%,69.89% and 81.22%,respectively.Real-time PCR results showed that the silencing efficiency ofBcl-2 gene expression in HepG-2 cells was 26.8% after transfection by using nanoparticles (m0/mt:4).Conclusion CS-DMAAPS could be a feasible new gene delivery material with good biocompatibility,which could delivery siRNA into HepG-2 to inhibit the expression ofBcl-2 gene.

chitosan; sulfobetaine compound; complex particles; hepatocellular carcinoma cells HepG-2; siRNA

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(NO：黔科合SY[2013]3008); 遵義醫(yī)學(xué)院招標(biāo)項(xiàng)目(NO：F-614)；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(NO：黔教合KY字[2014]212)。

朱欣婷, 女，碩士，副教授，研究方向：小分子抗癌藥物研究與開(kāi)發(fā)，E-mail:xintingzhu@126.com。

R735.7

A

1000-2715(2017)01-0042-07