腦皮質撞擊法致創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型的構建

付 浩，孫中磊，楊小颯，閆海洋，孫圣凱，陳孝儲，陳旭義，王志宏

(1.武警后勤學院附屬醫(yī)院 腦科醫(yī)院，天津 300162；2.錦州醫(yī)科大學 研究生學院，遼寧 錦州 121300；3.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室，天津 300162)

基礎醫(yī)學研究

腦皮質撞擊法致創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型的構建

付 浩1,3，孫中磊2,3，楊小颯1,3，閆海洋1,3，孫圣凱1，陳孝儲1，陳旭義1,3，王志宏1

(1.武警后勤學院附屬醫(yī)院 腦科醫(yī)院，天津 300162；2.錦州醫(yī)科大學 研究生學院，遼寧 錦州 121300；3.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室，天津 300162)

目的 通過腦皮質撞擊法構建不同損傷程度創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，以探討腦皮質撞擊儀參數(shù)的選取，為創(chuàng)傷性腦損傷的研究提供實驗基礎。方法 雌性SD大鼠48只，隨機等分為6組：即T1模型組、T2模型組、T3模型組、T4模型組、T5模型組(打擊深度分別為1、2、3、4、5 mm)和正常對照組。模型組應用皮質和打擊儀，通過設定共同的打擊速率(5 m/s)、共同的打擊最低點持續(xù)時間(200 ms)和不同的打擊深度，造成不同程度的創(chuàng)傷性腦損傷，對照組不進行任何操作。術后24 h進行神經(jīng)功能損傷評分(mNSS)、網(wǎng)屏實驗評分和曠場試驗評分。結果 各TBI模型組的mNSS評分與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，隨著打擊深度的增加，評分依次增高，但T1組與T2組差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T2組、T3組、T4組和T5組的網(wǎng)屏實驗評分與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；曠場試驗中，各TBI模型組僅T3組垂直得分與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。水平得分和大便粒數(shù)兩項指標，各組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 以5 m/s為打擊速率，200 ms為打擊最低點持續(xù)時間，打擊深度分別為1、3、4 mm可有效構建模擬輕、中、重度創(chuàng)傷性腦損傷的大鼠模型。

創(chuàng)傷性腦損傷；腦皮質撞擊法；動物模型；改良神經(jīng)功能損傷評分;SD大鼠

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury，TBI)是一種破壞性極大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，全世界每年有大約1 000萬人因創(chuàng)傷性腦損傷住院治療或死亡[1]，給各國帶來了較為沉重的經(jīng)濟和社會負擔。因此構建與臨床類似的不同損傷程度的動物模型，對于TBI的相關機制和診療研究尤為重要。目前，腦皮質撞擊儀致傷法是一種較為常用的造模方法，但具體打擊參數(shù)尚無統(tǒng)一標準，且國內鮮有報道。本研究擬利用腦皮質撞擊儀構建不同損傷程度TBI大鼠模型，為相關參數(shù)的選取提供更多基礎研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料 取7～8周齡雌性SD大鼠48只(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)，體質量220～250 g。實驗開始前均適應性喂養(yǎng)1周，自由飲食、飲水。按處理方式隨機分為6組：即T1模型組、T2模型組、T3模型組、T4模型組、T5模型組和正常對照組，每組8只大鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 模型制備術前1 h，各模型組腹腔注射青霉素10萬單位。采用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)將各模型組大鼠麻醉。暴露右側頂骨，用手術刀片刮凈顱骨表面軟組織。顱鉆鉆孔(直徑約4.5 mm)，進行打擊前準備。將電子腦皮質撞擊儀(eCCI，美國Custom&Design公司)打擊臂調整至與垂直方向呈20 °夾角，使打擊面與腦皮質基本平行。應用3 mm打擊帽精確打擊各組大鼠大腦皮層。打擊共同參數(shù)如下：打擊速率(velocity)為5 m/s ，打擊最低點持續(xù)時間(dwell)為200 ms。T1-5模型組的打擊深度(depth)分別為1、2、3、4、5 mm。打擊完成后用沾過生理鹽水的棉簽止血，縫合皮膚。正常對照組則不進行任何操作。造模后24 h由經(jīng)過培訓且不知分組情況的實驗員進行相關評分實驗評分。

1.2.2 改良神經(jīng)功能損傷程度評分(mNSS) 按照Chen等[2]的方法，分數(shù)越高表明神經(jīng)功能損傷癥狀越嚴重，正常為0分，損傷最嚴重為18分。

1.2.3 網(wǎng)屏實驗 將網(wǎng)屏水平放置，下方鋪以12 cm厚的海綿。網(wǎng)屏各參數(shù)如下：網(wǎng)屏為50 cm×50 cm網(wǎng)帶，網(wǎng)眼為1 cm×1 cm，網(wǎng)屏距地面高度約80 cm。將大鼠放在網(wǎng)屏上，以網(wǎng)屏一邊為軸，轉動135 °。觀察各組大鼠在網(wǎng)屏上的停留時間，進而評價前爪抓握能力及肌力情況。評分標準分為5個等級，即0分：在網(wǎng)屏上停留達20 s以上，未跌落；1分：在網(wǎng)屏上停留16～20 s；2分：在網(wǎng)屏上停留11～15 s；3分：在網(wǎng)屏上停留達6～10 s；4分：在網(wǎng)屏上停留0～5 s。

1.2.4 曠場實驗 于安靜環(huán)境中依次將各組大鼠自尾根部1/3處提起，輕輕放入自制礦場試驗箱正中央的方格內。實驗箱參數(shù)如下：敞箱為正方形，長、寬各80 cm，高40 cm；底面由面積相等、邊長16 cm的25塊正方形組成。觀察各組大鼠3 min內在陌生環(huán)境中的行為。包括水平得分：記錄大鼠水平穿越的格子數(shù)，以3只或4只爪子跨入1格記為1分，代表自主運動能力；垂直得分：記錄大鼠站立次數(shù)，雙前爪抬離地面超過1 cm以上或者攀附箱壁視為站立，記為1分，代表探索行為能力；糞便粒數(shù)：記錄大鼠5 min內的糞便粒數(shù)，代表緊張程度。每只大鼠完成實驗后，須對曠場實驗箱進行清洗方可進行下一只大鼠的曠場實驗評分。

2 結果

2.1 各組存活情況 T4模型組死亡1只，T5模型組死亡4只，其余各組均成活。

2.2 神經(jīng)功能損傷評分 各TBI模型組的mNSS評分與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，隨著打擊深度的增加，評分依次增高，但T1組與T2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖1)。

mNSS為改良神經(jīng)功能損傷程度評分；*：與對照組比較，P<0.05；#：與其他各組比較，P<0.05。圖1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評分比較

2.3 網(wǎng)屏實驗 T2組、T3組、T4組和T5組的網(wǎng)屏實驗評分與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T1組與對照組比較，網(wǎng)屏實驗評分有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖2)。

*：與對照組比較，P<0.05圖2 各組大鼠網(wǎng)屏實驗評分比較

2.4 曠場試驗 各TBI模型組中，僅T3組與對照組垂直得分比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。水平得分和大便粒數(shù)兩項指標，各組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

組別水平得分垂直得分大便粒數(shù)對照47.83±16.4718.83±7.884.67±1.75T137.50±22.7111.50±3.502.67±2.25T236.00±27.2613.00±3.934.67±2.94T354.80±10.306.67±2.80*2.60±1.67T431.16±20.5613.14±4.604.71±2.29T535.50±17.7112.00±4.324.00±2.31

*：與對照組比較，P<0.05。

3 討論

目前常用的TBI動物模型構建方法主要有自由落體法、爆炸致傷法、液壓沖擊法和腦皮質撞擊法[3]。其中自由落體法最為簡單易行，但重復性低，致傷程度不確定，且易受多種因素干擾，較難建立一個標準化的操作方法[4-5]；爆炸致傷法多用于爆炸傷研究，應用范圍較小[6]；液壓沖擊法可以精確控制致傷部位和打擊方向，并輸出精準的沖擊壓力，但骨窗處需應用骨水泥連接打擊帽，每次打擊前均需矯正，造模效率較低，且器材昂貴，不易推廣[7]；腦皮質撞擊法打擊力度可精確控制，且不需要應用骨水泥，造模效率高且簡單易行，應用廣泛，但缺點在于具體打擊參數(shù)尚未達成共識，這不利于模型的標準化[8]。本實驗通過固定打擊速率和打擊最低點持續(xù)時間，改變打擊深度，為構建不同損傷程度TBI模型提供了理論依據(jù)。

實驗結果可見，打擊深度1 mm時，大鼠神經(jīng)功能損傷程度較低，抓握能力和肌力無明顯下降，探索行為能力略降低；打擊深度2 mm時，神經(jīng)功能損傷程度與1 mm時無差別，抓握能力和肌力明顯下降，探索行為能力降低，但總體來看與T1組區(qū)分度不大；打擊深度為3 mm時，神經(jīng)功能損傷程度中等，抓握能力和肌力顯著降低，探索行為能力降低；打擊深度為4 mm時，神經(jīng)功能損傷程度較高，抓握能力和肌力顯著降低，探索行為能力進一步降低；打擊深度為5 mm時，雖然損傷癥狀最為嚴重，但造模死亡率顯著升高，表明該參數(shù)過大，并不適合應用于模型的構建。上述結果表明，腦皮質撞擊法可穩(wěn)定構建大鼠TBI模型，且利用打擊深度的不同對損傷進行分級，效果明顯；選取打擊深度1、3和4 mm或可分別模擬輕度、中度和重度TBI。曠場實驗是評價創(chuàng)傷后應激障礙的重要方法之一，應激障礙的發(fā)生與創(chuàng)傷程度密切相關[9-10]。但本實驗中，精神癥狀差別不顯著，可能由于創(chuàng)傷后精神癥狀需要較長時間才能出現(xiàn)，24 h內尚不能發(fā)生顯著改變。因此在評價短期造模效果時，或許不宜再進行曠場實驗。

綜上所述，本實驗通過固定打擊速率和打擊最低點持續(xù)時間，改變打擊深度，成功構建了不同損傷程度TBI模型，為打擊參數(shù)的選取及模型構建的評價提供了更多的理論依據(jù)。

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[收稿2016-11-29;修回2016-12-22]

(編輯：王靜)

The establishment of traumatic brain injury rat model by cerebral cortex impact method

FuHao1,3,SunZhonglei2,3,YangXiaosa1,3,YanHaiyang1，3,SunShengkai1,ChenXiaochu1,ChenXuyi1,3,WangZhihong1

(1.Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of PAP, Tianjin 300162, China; 2.Graduate School,Jinzhou Medical University, Jinzhou Liaoning 121300, China; 3.Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair, Tianjin 300162, China)

Objective To explore the best parameter of controlled cortical impactor，in order to establish traumatic brain injury rat model with different severity for further TBI study.Methods 48 female SD rats were randomly divided into T1 group, T2 group, T3 group, T4 group, T5 group (the striking depth were 1,2,3,4 and 5 mm, respectively) and control group equally. TBI group were conducted by controlled cortical impact injury technics with the same striking velocity (5 m/s), the same dwell at the bottom (200 ms) and different striking depth, so as to make different severity of TBI. No operation was carried out in control group. At 24 h after operation, neurological function was evaluated according to modified neurological severity score (mNSS), screen test and open field test.Results The mNSS of TBI group was significantly higher than control group, and the more severe the TBI was, the higher mNSS (allP<0.05), but the difference between T1 and T2 group was not statistically significance (P>0.05). The screen test score of T2, T3, T4, and T5 group were different from control group (P<0.05). In the open field test, only the horizontal score of T3 group was significantly different from control group (P<0.05), there was no significant difference (P>0.05) among the six groups in vertical score and stool grain number.Conclusion Different severity TBI rat model can be established by cerebral cortex impactor with the same striking velocity (5 m/s), the same dwell at the bottom (200 ms) and different striking depth (1,3,4 mm), which can represent light TBI, moderate TBI and severe TBI.

traumatic brain injury (TBI); controlled cortical impact injury (CCI); animal model; modified neurological severity score (mNSS);SD rats

國家自然科學基金資助項目(NO：11672332)；天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目(NO：2015KZ126)；天津市衛(wèi)生和計劃生育委員會中醫(yī)中西醫(yī)結合科研課題(NO：2015155)；天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室開放基金(NO：WYKFZ201602)；武裝警察部隊后勤學院基礎研究項目(NO：WHJ2015013)；武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院種子基金(NO：FYM201517、FYQ201560)。

王志宏，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：老年醫(yī)學，E-mail:yjb_office@126.com。

R651

A

1000-2715(2017)01-0038-04