齊墩果酸在人及其他種屬肝微粒體CYP450中代謝的差異研究

邱 敏，周 林，徐亞沙，魯艷柳，陸遠富

(遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學研究

齊墩果酸在人及其他種屬肝微粒體CYP450中代謝的差異研究

邱 敏，周 林，徐亞沙，魯艷柳，陸遠富

(遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室，貴州 遵義 563099)

目的 比較齊墩果酸在人和其他種屬肝微粒體CYP450酶中的代謝差異。方法 采用基于多重質(zhì)量虧損(Multiple mass defect filter, MMDF)的四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜色譜聯(lián)用儀，分析齊墩果酸經(jīng)人及昆明小鼠、C57小鼠、SD大鼠、豬、牛、羊、兔肝微粒體體外代謝的產(chǎn)物及種屬差異。利用與CYP450各亞型酶的特異性抑制劑共孵育，對比不同種屬參與齊墩果酸特征性代謝產(chǎn)物M-469的主要代謝亞型酶。結(jié)果 齊墩果酸不同種屬的肝微粒體體外代謝存在明顯差異。齊墩果酸特征性代謝產(chǎn)物M-469，在昆明小鼠的肝微粒體中生成最多，其次是C57小鼠、SD大鼠、人、豬、兔，而牛、羊體外不生成此產(chǎn)物。在人肝微粒體CYP450酶中，CYP3A4是齊墩果酸特征性代謝產(chǎn)物M-469的主要代謝酶。昆明小鼠CYP450酶中，CYP3A、CYP2E1參與了此代謝產(chǎn)物的生成。結(jié)論 齊墩果酸在人和不同種屬肝微粒體CYP450代謝中存在差異，因此，本實驗將為齊墩果酸進一步代謝研究及安全性評價提供重要參考價值。

四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜色譜聯(lián)用儀；齊墩果酸；細胞色素P450酶；種屬差異

齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)，化學式C30H48O3，是一種五環(huán)三萜類化合物，以游離體或配糖體的形式廣泛存在于豆科、木犀科、龍膽科、傘形科、五加科、葫蘆科等食物和藥用植物中[1-2]，許多臨床常用中藥如：人參[3]、三七[4]、青葉膽、山楂、連翹、女貞子、青梅、木瓜等[5]都含有齊墩果酸。已有大量文獻報道，齊墩果酸具有良好的藥理作用，如保肝、降糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抗氧化作用[6-10]，臨床上用于急、慢性肝炎的輔助治療，需要長期用藥，以口服制劑為主，但其口服生物利用度較低[11]。

近年來，藥物代謝分析經(jīng)過快速的發(fā)展已成為藥物代謝動力學研究中的一個重要部分，而不斷完善的高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)被廣泛應用于藥物代謝分析研究中[12]，如次烏頭堿在大鼠肝微粒體的體外代謝[13]，荷葉堿在不同種屬肝微粒體的代謝差異[14]。大部分藥物進入體內(nèi)后會被代謝，然后以代謝產(chǎn)物的形式排出體外，不經(jīng)代謝以原藥形式排出體外的很少[15]。因此，對代謝產(chǎn)物研究就越來越受到人們關(guān)注。然而關(guān)于齊墩果酸的國內(nèi)外研究主要集中在提取分離、藥效學等相關(guān)領(lǐng)域，而在其藥物代謝產(chǎn)物方面的研究較少，且不深入[16]。齊墩果酸在不同種屬肝微粒體代謝及其代謝產(chǎn)物的研究鮮見報道。

本文擬采用UPLC-MS/MS的方法，觀察齊墩果酸在人、SD大鼠、昆明小鼠、C57小鼠、豬、兔、牛、羊肝微粒體中的體外代謝過程，對其在人及其他種屬肝微粒體中的體外代謝進行種屬差異研究，利用各亞型酶的特異性抑制劑，比較不同種屬CYP450酶的代謝亞型，為齊墩果酸的藥物代謝研究以及藥物安全性評價提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Q-Exactive高性能臺式四級桿-軌道阱UPLC-MS/MS(HESI離子源)系統(tǒng)(美國Thermo公司)；Genius 1022液氮發(fā)生器(英國PEAK公司)；Excellence Plus天平(美國梅特勒-托利多公司)；YQ-720醫(yī)用超聲波清洗機(上海易凈超聲波儀器有限公司)；ZWY-110X50恒溫水浴箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；XW-80A 漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)； MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Optima Max-XP超速離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)；LG-22立式高速冷凍離心機(四川蜀科儀器有限公司)。

齊墩果酸、大豆苷元(批號：110709-201206、111502-200402，重慶對照品科技有限公司)；磺胺苯吡唑、奎尼丁、氯美噻唑鹽酸鹽、酮康唑(批號：DRE-C17000080、ASB-00017180、ZTO-C3020、ASB-00011350，上海甄準生物科技有限公司)；D-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽水化合物、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、β-煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽(批號：0003671996、0009001405、0001184163)；乙腈、甲醇、甲酸均為質(zhì)譜級，購自Sigma-Aldrich化學制品有限公司；其它試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑公司；人肝微粒體(批號：SUBK，瑞德肝臟疾病研究上海有限公司)。

1.2 實驗動物 雄性健康SPF級SD大鼠、昆明小鼠、C57小鼠各6只，由重慶第三軍醫(yī)大實驗動物中心提供，生產(chǎn)合格證號：SCXK(渝)2012-0005。健康的雄性豬、牛、羊、新西蘭白兔肝臟樣品各6份，由遵義醫(yī)學院動物實驗中心提供。

1.3 肝微粒體的制備 實驗動物斷頭處死后立即取肝臟，用含0.15 mol/L KCl的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液清洗，稱重，按1 g∶4 mL的比例加入磷酸鉀緩沖液(pH=7.4)，勻漿，所有操作均在冰上進行。采取差速離心法[17]，制備好分裝后于-80 °C冰箱中保存?zhèn)溆?，用BCA法測定肝微粒體蛋白濃度。按照“1.4”操作方法，定量測定孵育體系中4個CYP450亞型酶CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A探針底物的代謝產(chǎn)物生成量，計算肝微粒代謝酶的活性，測得其活性與文獻[18]報道相一致。

1.4 孵育條件和樣品處理 體外孵育系統(tǒng)總體積100 μL，含齊墩果酸(50 μmol/L)、肝微粒體(0.5 mg/mL)、磷酸鉀緩沖液(K2HPO4-KH2PO4，100 mmol/L，pH 7.4)、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽水化合物(10 mmol/L)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(1 unit/mL)、氯化鎂(4 mmol/L)、β-煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽(1 mmol/L)。體系在37 ℃恒溫水浴搖床上孵育45 min后，加入100 μL乙腈終止反應并沉淀蛋白。14 000 rpm，4oC離心10 min，取上清進樣分析。體外孵育系統(tǒng)，空白對照組不加齊墩果酸，陰性對照組不加β-煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽，均以等體積緩沖液代替，其余組成和樣品組一致。體系孵育條件、樣品處理方法均和樣品組相同。

采用特異性抑制劑共孵育，包括磺胺苯吡唑(10 μmol/L)、奎尼丁(10 μmol/L)、氯美噻唑鹽酸鹽(50 μmol/L)、酮康唑(1 μmol/L)，分別抑制CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A等主要CYP450代謝酶活性。

1.5 UPLC-MS/MS分析條件 色譜條件：Hypersil Gold C18(150×2.1 mm，1.9 μm) 色譜柱，流動相為0.1%的甲酸水(A)和乙腈(B)，洗脫條件：0～0.5 min，5% B；0.5～15 min，5%～95% B；15～18 min，95% B，18～20 min，5% B。流速為0.3 mL/min，柱溫45 °C，進樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：HESI 離子化方式，負離子Full-ddMS2掃描模式，m/z檢測范圍100～1 500，毛細管溫度350 °C，霧化溫度300 °C，鞘氣和輔助氣流速分別為35、15 arb。分辨率采用MS Full Scan 70000 FWHM，MS/MS Full Scan 15000 FWHM。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸質(zhì)譜信息分析 陰性對照組樣品采用1.5項下方法進行分析，結(jié)果(見圖 1)。齊墩果酸保留時間為17.23 min，在負離子掃描模式下，具有明顯的分子離子峰[M-H]-m/z 455.351 9。

A：總離子流圖；B：齊墩果酸選擇離子圖；C：齊墩果酸質(zhì)譜圖。圖1 陰性對照樣品總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖

2.2 齊墩果酸人肝微粒體代謝產(chǎn)物分析 借助Meta軟件，采用MMDF方法，對人肝微粒體孵育反應后的樣品與空白對照組、陰性對照組進行比較，分析代謝產(chǎn)物。由結(jié)果可知，齊墩果酸可以經(jīng)人肝微粒體CYP450酶代謝，在保留時間12～17 min處色譜峰發(fā)生明顯變化(見圖2)。

采用精確分子量，對齊墩果酸代謝產(chǎn)物進行信號提取和分析，代謝產(chǎn)物M-469的母離子峰[M-H]-m/z為469.331 2，在16.72 min發(fā)現(xiàn)對應色譜峰(見圖3)。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：齊墩果酸樣品組。圖2 齊墩果酸經(jīng)人肝微粒體CYP450酶代謝產(chǎn)物總離子流圖

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：齊墩果酸樣品組。圖3 齊墩果酸人肝微粒體代謝產(chǎn)物M-469選擇離子圖

2.3 比較齊墩果酸體外代謝產(chǎn)物的種屬差異 比較人與SD大鼠、昆明小鼠、C57小鼠、豬、兔、牛、羊體外代謝齊墩果酸的種屬差異。采用精確分子量，代謝產(chǎn)物M-469選擇離子圖顯示，SD大鼠、昆明小鼠、C57小鼠、豬、兔肝微粒體代謝與人肝微粒體，均能生成該代謝產(chǎn)物，在16.72 min出現(xiàn)m/z 469.331 2的色譜峰；而牛、羊肝微粒體中在16.72 min無色譜峰(見圖4)。比較相對峰面積得知，代謝產(chǎn)物M-469在昆明小鼠肝微粒體的生成量最高(見圖5)。

A：人；B：SD大鼠；C：昆明小鼠；D：C57小鼠；E：豬；F：兔；G：牛；H：羊。圖4 齊墩果酸不同種屬肝微粒體代謝產(chǎn)物M-469提取圖

#：與人肝微粒體比較，P<0.05。 圖5 齊墩果酸不同種屬肝微粒體生成代謝產(chǎn)物M-469的比較±s，n=6)

2.4 不同種屬參與齊墩果酸代謝產(chǎn)物M-469的CYP450亞型酶比較 在人肝微粒體中，分別加入CYP450酶特異性抑制劑共孵育。結(jié)果顯示，CYP3A特異性抑制劑酮康唑能顯著抑制M-469生成(見圖6A)。提示在人肝微粒體中，CYP3A4參與了齊墩果酸代謝物M-469生成。

在昆明小鼠的肝微粒體中，分別加入CYP450酶特異性抑制劑共孵育。結(jié)果顯示，CYP2E1特異性抑制劑氯美噻唑鹽酸鹽、CYP3A特異性抑制劑酮康唑均能顯著抑制M-469的生成(見圖6B)，提示在昆明小鼠的肝微粒體中，CYP2E1、CYP3A參與了齊墩果酸代謝物M-469代謝物的生成。

#：與齊墩果酸組比較，P<0.05。圖6 人(A)和昆明小鼠(B)參與齊墩果酸代謝產(chǎn)物M-469的CYP450亞型酶比較

3 討論

近年推出的四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，通過測定各離子的震蕩頻率，運用傅里葉變換計算質(zhì)核比(m/z)，其分辨率可達100 000。采用精確質(zhì)量數(shù)提取獲得相應化合物的質(zhì)譜響應，將充分保證方法的高選擇性。齊墩果酸代謝產(chǎn)物M-469分子離子峰[M-H]-m/z 469.331 2，與原型分子離子峰[M-H]-m/z 455.351 9比較，分子量發(fā)生13.979 3的變化，該代謝產(chǎn)物可能是在CYP450酶作用下加雙羥基后脫水生成，有文獻報道該種代謝模式下可能產(chǎn)生環(huán)氧化合物[19]。由于質(zhì)譜碎片信息量較少，需要進一步實驗以推測其結(jié)構(gòu)。

本實驗采用四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜色譜聯(lián)用儀，基于多重質(zhì)量虧損(MMDF)方法，比較相同蛋白濃度、不同種屬肝微粒體與齊墩果酸共同孵育的結(jié)果，研究齊墩果酸種屬間的代謝差異。進一步利用CYP450各亞型酶的特異性抑制劑與其共孵育，判斷不同種屬齊墩果酸代謝產(chǎn)物M-469的主要代謝亞型酶。結(jié)果顯示，昆明小鼠生成齊墩果酸代謝產(chǎn)物M-469的活性最強；CYP3A參與了齊墩果酸在人和小鼠肝微粒體中M-469化合物形成，CYP2E1[20]只參與了齊墩果酸在小鼠肝微粒體中M-469代謝物的形成。

CYP450 酶在不同種屬肝臟中的組成和相對含量存在差異[21]，由于不同的 CYP450酶介導不同的代謝反應，因而CYP450酶介導的代謝反應和生成的代謝產(chǎn)物種類或量也存在著種屬差異[22]。齊墩果酸在不同種屬肝微粒體中的代謝差異性，很可能與不同種屬肝臟中與齊墩果酸代謝相關(guān)的CYP450 酶有關(guān)，在本實驗中也反應出此問題。參與人體藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1-3家族，臨床約90%以上藥物經(jīng)過這些酶代謝。CYP2E1廣泛分布于肝、腎、肺等各器官，肝臟為最主要的表達器官，其在毒理學研究有重要的意義[23]。CYP3A4是CYP450中最重要的組成成分，在大鼠肝臟中對應的亞型為CYP3A1/2，而在小鼠肝臟中CYP3A11與其對應，在臨床半數(shù)以上的藥物都要經(jīng)它轉(zhuǎn)化，許多藥物也是它的誘導劑和抑制劑[24]。

齊墩果酸在SD大鼠、昆明小鼠、C57小鼠肝微粒體中的代謝與人肝微粒體中代謝相似，進一步對齊墩果酸在人和小鼠代謝產(chǎn)物M-469主要代謝酶研究，發(fā)現(xiàn)盡管代謝產(chǎn)物相似，參與的代謝酶也不盡相同。齊墩果酸曾經(jīng)被用于保肝，最近已有報道齊墩果酸具有一定的肝毒性。但是其毒性和活性是其自身的直接效應還是其代謝產(chǎn)物的效應尚不清楚。因此，代謝途徑及模式的不同對毒性及活性的影響仍可能存在。在這種情況下，選擇代謝產(chǎn)物、代謝活性、代謝模式相近的動物進行其臨床前研究及后期臨床試驗就顯得尤其重要。

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[收稿2016-12-28;修回2017-01-18]

(編輯：王靜)

Study on the differences in oleanolic acid metabolism in liver microsomes of human and other species

QiuMing,ZhouLin,XuYasha,LuYanliu,LuYuanfu

(Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To compare the metabolism of oleanolic acid in liver microsomes of human and other species.Methods An ultra-high performance liquid chromatography/mass spectrometry (UPLC/MS) method was applied to systemically study the oleanolic acid metabolism in liver microsomes of human, rat, mouse, pig, rabbit, cattle, and sheep, and comprehensively evaluate oleanolic acid metabolitesinvitroand metabolism differences between species. The research also tested the metabolites after incubation with selective inhibitors of 4 main P450s including CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, and CYP3A4 in liver microsomes.Results The results showed that the most metabolite M-469 was generated in Kunming mouse liver microsomes, followed by C57 mouse, SD rat, human, pig, and rabbit. However, in the cattle and sheep liver microsome incubation system, the metabolite M-469 was not found. For human, CYP3A4 was identified as the main enzyme responsible for the metabolite M-469 of oleanolic acid. For Kunming mouse, CYP3A and CYP2E1 were involved in the production of this metabolite.Conclusion There was significant species difference in oleanolic acid metabolisminvitrobetween human and other species, providing important reference value for the further metabolism study and safety evaluation of oleanolic acid.

UPLC-MS/MS; oleanolic acid; cytochrome P450s; species differences

國家自然科學基金資助項目(NO：81460632)。

陸遠富，男，博士，教授，研究方向：藥物代謝與毒理學研究，E-mail:luyuanfu2000@163.com；魯艷柳，女，博士，副教授，研究方向：藥物代謝與毒理學研究，E-mail:yanliu.lu@foxmail.com。

R969.1

A

1000-2715(2017)01-0027-06