亮氨酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

趙艷麗 陳 璐 史彬林 郭曉宇 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

亮氨酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

趙艷麗 陳 璐 史彬林 郭曉宇 閆素梅*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

本試驗(yàn)旨在研究亮氨酸(Leu)對泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，以探討Leu對乳脂合成的影響機(jī)理。將第3代BMECs隨機(jī)分為6個處理，每個處理6個重復(fù)。6個處理培養(yǎng)液中Leu濃度分別為0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后測定BMECs內(nèi)甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相關(guān)基因和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1)蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示：Leu濃度對BMECs內(nèi)TG含量無顯著影響(P>0.05)。適宜濃度的Leu顯著促進(jìn)脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰輔酶A羧化酶A(ACACA)基因的表達(dá)(P<0.05)，F(xiàn)ASN基因的相對表達(dá)量以1.80～2.70 mmol/L Leu處理、ACACA基因的相對表達(dá)量以1.80～7.20 mmol/L Leu處理較高。Leu濃度顯著影響B(tài)MECs內(nèi)SREBP1基因及蛋白表達(dá)(P<0.05)，以1.80 mmol/L Leu的促進(jìn)效果最好。雖然Leu顯著抑制BMECs內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6(AGPAT6)、線粒體甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亞家族1成員1(BTN1A1)基因的表達(dá)(P<0.05)，但只有高濃度(3.60～7.20 mmol/L)的Leu抑制作用較大。綜合來看，Leu濃度影響B(tài)MECs乳脂合成相關(guān)基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表達(dá)。Leu濃度為1.80～2.70 mmol/L時，對脂肪酸從頭合成相關(guān)基因及調(diào)控因子SREBP1蛋白表達(dá)的促進(jìn)效果較好，對TG合成及脂滴形成相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用較小。

奶牛；乳腺上皮細(xì)胞；亮氨酸；乳脂

牛奶總固形物中乳脂含量高達(dá)27%，是構(gòu)成牛奶的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)。氨基酸(AA)作為乳蛋白合成的主要前體物，不僅影響乳蛋白合成，對乳脂的合成也有影響[1]，因此，深入研究AA對乳脂合成的影響及其機(jī)理對改善乳品質(zhì)有重要的意義。亮氨酸(Leu)是動物的必需氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠飼糧缺乏Leu后其白色脂肪組織中的脂肪合成受限制，脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰輔酶A羧化酶A(ACACA)基因以及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP1c)和FASN蛋白的表達(dá)顯著下降，血清游離脂肪酸和甘油的含量也顯著下降[2]。體外研究發(fā)現(xiàn)，Leu在影響乳蛋白合成的同時，也促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)內(nèi)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP1)基因的表達(dá)和甘油三酯(TG)的合成[3]。這些結(jié)果提示Leu可能通過影響脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)脂肪合成。然而，采食高脂飼糧的小鼠攝入過量的Leu后，其體重下降，脂肪合成受抑制[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)小鼠日攝入需要量2倍以上的Leu對血漿膽固醇和TG的合成無顯著的影響[5]?？梢?，Leu對動物脂肪代謝的影響在不同的組織中不完全一樣，有關(guān)Leu對奶牛乳脂合成的影響及其機(jī)理的研究報道很少。鑒于此，本試驗(yàn)以BMECs為模型，研究不同濃度Leu對乳脂合成相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討Leu對乳脂合成的影響機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.2 試劑配制

生長培養(yǎng)基的配制：在100 mL的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%胰島轉(zhuǎn)鐵蛋白、1 μg/mL氫化可的松、0.5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、10 ng/mL表皮生長因子、5 μg/mL催乳素、100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素和2.5 μg/mL兩性霉素B。

Leu工作液的配制：稱取0.118 g的Leu粉末溶于10 mL無血清的生長培養(yǎng)基中，配成濃度為90 mmol/L的Leu貯備液，0.22 μm濾器過濾。用無血清的生長培養(yǎng)基按照梯度稀釋法將90 mmol/L的Leu貯備液根據(jù)試驗(yàn)要求配制成不同Leu濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3 BMECs的培養(yǎng)

采用膠原酶消化法培養(yǎng)BMECs，具體方法參照Sheng等[6]的方法進(jìn)行。從內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真屠宰場選取3～5歲經(jīng)產(chǎn)的健康泌乳中期的高產(chǎn)荷斯坦奶牛乳腺組織，0～4 ℃條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從深層取約1 cm3組織塊放入3×雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。隨后分別用3×雙抗的PBS、75%酒精和1×PBS清洗。將腺泡豐富的組織剪成糊狀后加入等體積0.5%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化1 h。80目濾網(wǎng)過濾后，179×g離心5 min，棄上清；PBS沖洗細(xì)胞，179×g離心3 min，重復(fù)沖洗2次。用生長培養(yǎng)基懸浮接種于25 cm2透氣培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，直至原代細(xì)胞貼壁率達(dá)約90%后用0.05%胰蛋白酶-EDTA純化和傳代細(xì)胞。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計

收集第3代BMECs并懸浮于生長培養(yǎng)基中按照試驗(yàn)要求的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計，將BMECs培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為6個處理，每個處理6個重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)液中Leu的濃度是參考龐學(xué)燕[7]和代文婷等[8]的研究結(jié)果，然后利用噻唑藍(lán)(MTT)法通過細(xì)胞的增殖率確定，6個處理Leu的濃度分別為0.45、0.90、1.80、3.60、2.70和7.20 mmol/L，每個處理6個重復(fù)。在BMECs貼壁率為80%～90%時，換為無血清的生長培養(yǎng)基，12 h后按照試驗(yàn)設(shè)計要求換為不同Leu濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.5 測試指標(biāo)與方法

1.5.1 BMECs內(nèi)TG含量的測定

BMECs內(nèi)TG的含量參考Ramírez-Zacarías等[9]的方法測定，用吸光度(OD)值表示其含量，具體方法：將細(xì)胞懸液以5×104個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板，按試驗(yàn)設(shè)計培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，每孔加入4%多聚甲醛溶液0.2 mL固定細(xì)胞1 h后，PBS漂洗2次，0.5 mL油紅O工作液避光浸染2 h。然后用PBS漂洗3次，晾干培養(yǎng)板后，加入0.3 mL異丙醇萃取30 min，用全自動酶標(biāo)儀在波長為510 nm處測定其OD值。

1.5.2 BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的測定

表1 乳脂合成相關(guān)基因的引物序列

續(xù)表1基因GenesGenBank登錄號GenBankaccessionNo.引物序列Primersequences(5'—3')長度Length/bp參考文獻(xiàn)ReferencesXDHBC102076F:GATCATCCACTTTTCTGCCAATGR:CCTCGTCTTGGTGCTTCCAA100自行設(shè)計

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glycerol phosphate dehydrogenase；FASN：脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；ACACA：乙酸輔酶A羧化酶A acetyl-coenzyme A carboxylase α；SCD1：硬脂酰輔酶A去飽和酶1 stearoyl-CoA desaturase 1；FABP3：脂肪酸結(jié)合蛋白3 fatty acid-binding protein 3；LPL：脂蛋白脂酶 lipoprotein lipase；PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma；SREBP1：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1；AGPAT6：乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6；GPAM：線粒體甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶 mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase；LPIN1：磷脂酸磷酸酯酶 1 phosphatidic acid phosphatase 1；BTN1A1：嗜乳脂蛋白亞家族1成員1 butyrophilin subfamily 1 member A1；XDH：黃嘌呤脫氫酶 xanthine dehydrogenase。表2同 The same as Table 2。

1.5.3 BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的測定

BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)蛋白的表達(dá)采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)的方法測定。將細(xì)胞懸液以1×106個/mL的密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，按試驗(yàn)設(shè)計培養(yǎng)48 h后，棄上清，PBS清洗貼壁生長的細(xì)胞2次，棄去上清，加入含0.1%PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液250 μL，4 ℃裂解5 min后收集細(xì)胞懸液，4 ℃、15 455×g離心10 min，收集上清液檢測PPARγ和SREBP1蛋白的表達(dá)。將60 μg待檢測蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混合，100 ℃變性5 min后進(jìn)行電泳，于濃縮膠上80 V電泳40 min，分離膠上120 V電泳100 min。目的蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，用蒸餾水沖洗1 min，室溫封閉1 h后，TBST洗滌3次，每次2 min。然后分別用兔抗PPARγ(1∶250)和鼠抗SREBP1(1∶50)于4 ℃孵育過夜，取出PVDF膜后TBST洗滌3次，每次5 min。分別用山羊抗兔二抗(1∶1 000)和山羊抗鼠二抗(1∶500)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次8 min。用ECL化學(xué)超敏顯色液進(jìn)行顯色，凝膠成像儀上照相分析(Tanongis-1000，上海天能生物科技公司)。圖片用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析，PPARγ和SREBP1蛋白的相對表達(dá)量采用各處理與Leu濃度為0.45 mmol/L的處理的比值表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)利用Excel 2007進(jìn)行計算和整理，采用SAS 9.0軟件的回歸統(tǒng)計程序進(jìn)行一次線性與二次曲線回歸分析，P<0.05表示回歸關(guān)系顯著，0.05≤P<0.10表示回歸關(guān)系趨于顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Leu對BMECs內(nèi)TG含量和乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表2可知，不同濃度(0.45～7.20 mmol/L)Leu處理的BMECs內(nèi)TG含量差異不顯著(P>0.05)，但0.90～2.70 mmol/L Leu處理的TG含量在數(shù)值上高于其他處理。隨著Leu濃度的增加，BMECs內(nèi)FABP3基因的相對表達(dá)量呈顯著的一次線性下降(P=0.018)，LPL基因的相對表達(dá)量呈顯著的二次曲線下降(P=0.016)，二者在3.60～7.20 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量均較低；BMECs內(nèi)FASN和ACACA基因的相對表達(dá)量均呈顯著的二次曲線增加(P=0.013、P=0.002)，F(xiàn)ASN基因的相對表達(dá)量以1.80～2.70 mmol/L Leu處理較高，7.20 mmol/L Leu處理較低；BMECs內(nèi)ACACA基因的相對表達(dá)量以1.80～7.20 mmol/L Leu處理較高，其他處理均較低。BMECs內(nèi)SCD1和PPARγ基因的相對表達(dá)量與Leu濃度無顯著的回歸關(guān)系(P>0.05)，但從數(shù)值上看，PPARγ基因的相對表達(dá)量以0.90～2.70 mmol/L Leu處理較高，7.20 mmol/L Leu處理最低。BMECs內(nèi)SREBP1基因的相對表達(dá)量隨Leu濃度的增加呈顯著的二次曲線增加(P=0.022)，以1.80 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量最高，7.20 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量最低。BMECs內(nèi)AGPAT6、GPAM、LPIN1和BTN1A1基因的相對表達(dá)量隨Leu濃度的增加呈顯著的一次線性下降(P=0.018、P=0.032、P=0.034、P<0.001)，以0.45～2.70 mmol/L Leu處理的AGPAT6、GPAM和BTN1A1基因的相對表達(dá)量較高，以0.45～1.80 mmol/L Leu處理的LPIN1基因的相對表達(dá)量較高。BMECs內(nèi)XDH基因的相對表達(dá)量與Leu濃度無顯著的回歸關(guān)系(P>0.05)。

表2 Leu對BMECs內(nèi)TG含量和乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

P<0.05表示回歸關(guān)系顯著；0.05≤P<0.10表示回歸關(guān)系趨于顯著。下表同。

P<0.05 means regression relationship was significant; 0.05≤P<0.10 means regression relationship tend to be significant. The same as below.

2.2 Leu對BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由表3和圖1可知，BMECs內(nèi)PPARγ蛋白的相對表達(dá)量與Leu濃度無顯著的劑量依賴關(guān)系(P>0.05)，但從數(shù)值上看，以0.90～2.70 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量較高，3.60～7.20 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量較低。BMECs內(nèi)SREBP1蛋白的相對表達(dá)量隨著Leu濃度的增加呈顯著的二次曲線增加(P=0.032)，以0.90～3.60 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量較高，且尤以1.80 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量最高，以7.2 mmol/L Leu處理的相對表達(dá)量最低。

表3 Leu對BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glycerol phosphate dehydrogenase；PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma；SREBP1：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1。

圖1 Leu對BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.1 Effects of Leu on expression of proteins related with milk fat synthesis in BMECs

3 討 論

細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的自由擴(kuò)散效率較低，而且不具有生物靶向性，所以大部分脂肪酸的靶向性運(yùn)輸都需要相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與[14]。LPL和FABP3基因是參與哺乳動物多種組織中長鏈脂肪酸(LCFA)攝取與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要基因[15]。在玉米秸稈為粗飼料的條件下，奶牛陰外動脈灌注AA后，乳腺對LCFA的攝取及乳脂中的C18∶0、c-9,c-12-C18∶2和C18∶3含量也下降[16]。本研究結(jié)果得出，隨著Leu濃度的增加，BMECs內(nèi)FABP3和LPL基因的相對表達(dá)量下降，說明Leu可能抑制BMECs內(nèi)LCFA的攝入與轉(zhuǎn)運(yùn)。目前，關(guān)于Leu對FABP3和LPL基因表達(dá)影響的研究報道極少，有待于進(jìn)一步研究探討。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)和PPARγ是乳脂合成的重要調(diào)控因子。沉默BMECs內(nèi)SREBP1基因后，ACACA和FASN基因的相對表達(dá)量顯著下降[17]。用PPARγ的激活劑羅格列酮處理BMECs后，F(xiàn)ASN和ACACA基因的相對表達(dá)量增加[18]。ACACA是脂肪酸從頭合成的一種限速酶，催化乙酰-輔酶A(CoA)羧化生成丙二酰CoA。FASN是一種多功能的酶系統(tǒng)，以一種代謝酶類參與脂肪的生成和沉積，是體內(nèi)脂肪合成途徑中的一個關(guān)鍵酶。在泌乳期間乳腺內(nèi)FASN基因編碼的蛋白FASN調(diào)控中短鏈脂肪酸(SMCFA)(C4～C16)的合成[19]。Cheng等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠飼糧缺乏Leu后白脂肪組織中FASN和ACACA基因的相對表達(dá)量以及FASN和SREBP1c蛋白的相對表達(dá)量顯著下降。另有研究發(fā)現(xiàn)，Leu上調(diào)BMECs內(nèi)SREBP1基因的表達(dá)[3]。本研究結(jié)果顯示，1.8～2.7 mmol/L的Leu可上調(diào)SREBP1和PPARγ基因和蛋白的表達(dá)，其靶基因ACACA和FASN的表達(dá)也上調(diào)。這說明Leu對乳脂的合成有顯著的影響，且SREBP1和PPARγ可能參與Leu對乳脂合成的調(diào)控；此外，Leu對乳脂合成的影響與劑量有關(guān)，1.8～2.7 mmol/L的Leu可促進(jìn)SMCFA的合成。

GPAM、AGPAT6和LPIN1是參與TG合成的主要基因，同時其編碼的蛋白也是參與乳脂合成的關(guān)鍵酶[20]。GPAM催化脂酰CoA結(jié)合到甘油-3-磷酸的sn-1位點(diǎn)形成溶血磷脂酸，AGPAT催化第2個脂酰輔酶A結(jié)合到甘油-3-磷酸的sn-2位點(diǎn)形成磷脂酸。LPIN1能轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)，將磷脂酸轉(zhuǎn)變成二酰甘油，然后，另外一個脂酰CoA酯化到甘油的sn-3位點(diǎn)形成TG。乳腺細(xì)胞內(nèi)的TG在一系列蛋白的作用下形成脂滴。BTN1A1和XDH是參與脂滴形成的主要蛋白[21]。BTN1A1在乳腺細(xì)胞分泌時幫助形成乳脂滴，XDH在乳脂肪球和細(xì)胞頂膜偶聯(lián)過程中起重要作用。Leu、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)等支鏈氨基酸(BCAA)對飼喂高脂飼糧的小鼠肥胖和脂肪代謝平衡具有一定影響，BCAA組小鼠肝臟和肌肉中TG的含量較對照組顯著降低[22]。然而，日攝入2倍以上需要量的Leu對小鼠血漿膽固醇和TG的合成無顯著的影響[5]。這些研究結(jié)果說明Leu對TG合成的影響結(jié)果不盡一致。本研究結(jié)果表明，高濃度(3.60～7.20 mmol/L)Leu盡管抑制GPAM和AGPAT6基因的表達(dá)，但對TG的合成并沒有顯著的抑制效果；結(jié)果也得出Leu促進(jìn)了脂肪酸的從頭合成，但抑制了與LCFA的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因的表達(dá)，這可能是導(dǎo)致其對TG合成影響不顯著的主要原因。本研究還得出，高濃度Leu下調(diào)脂滴形成相關(guān)基因BTN1A1基因的表達(dá)。在奶山羊BMECs內(nèi)，F(xiàn)ASN基因干擾后BTN1A1基因的相對表達(dá)量和脂滴形成數(shù)量顯著下降[23]，說明高濃度Leu處理BMECs內(nèi)BTN1A1基因表達(dá)的下調(diào)可能與FASN基因表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。綜合結(jié)果得出Leu對脂肪酸從頭合成基因FASN和ACACA基因的表達(dá)均具有促進(jìn)作用，且呈劑量依賴關(guān)系，F(xiàn)ASN基因的表達(dá)以1.80～2.70 mmol/L的Leu促進(jìn)效果較好，ACACA基因的表達(dá)以1.80～7.20 mmol/L的Leu促進(jìn)效果較好；Leu上調(diào)SREBP1基因及蛋白的表達(dá)，1.80 mmol/L的Leu促進(jìn)效果最好；Leu抑制FABP3、LPL、AGPAT6、GPAM和BTNIA1基因的表達(dá)，但只在添加高濃度(3.60～7.20 mmol/L)的Leu時抑制作用較大。綜合乳脂合成的多項指標(biāo)，Leu濃度為1.80～2.70 mmol/L效果較好。

4 結(jié) 論

Leu濃度為1.80～2.70 mmol/L時，對BMECs內(nèi)FASN、ACACA和SREBP1基因及SREBP1蛋白表達(dá)的促進(jìn)效果較好，對TG合成及脂滴形成相關(guān)基因的表達(dá)抑制作用較小。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Effects of Leucine on Expression of Genes and Proteins Related with Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

ZHAO Yanli CHEN Lu SHI Binlin GUO Xiaoyu YAN Sumei*

(CollageofAnimalScience,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot010018,China)

The objects of this study were to study the effects of leucine (Leu) on expression of genes and proteins related with milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs), in order to investigate the mechenism of Leu regulating milk fat synthesis. The third generation of BMECs were divided into six treatments with six replicates per treatment, and cultured in culture mediums with 0.45, 0.90, 1.80, 2.70, 3.60 and 7.20 mmol/L Leu, respectively. The triglyceride (TG) content, the relative expression levels of genes related with milk fat synthesis, as well as the protein relative expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) and sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) in BMECs after 48 h incubation at 37 ℃ and 5% CO2were detected. The results showed that the Leu concentration had no significant effect on TG content in BMECs (P>0.05). The optimal Leu concentration significantly up-regulated the gene expression of fatty acid synthase (FASN) and acetyl-CoA carboxylase A (ACACA) in BMECs (P<0.05). The higher gene relative expression level ofFASNwas observed in 1.80 to 2.70 mmol/L Leu treatments, and the higher gene relative expression level ofACACAwas observed in 1.80 to 7.20 mmol/L Leu treatments. Leu concentration significantly increased the gene and protein expression ofSREBP1 in BMECs (P<0.05), and the best promoting effect was observed in 1.80 mmol/L Leu treatment. Although Leu significantly inhibited the gene expression of fatty acid-binding protein 3 (FABP3), lipoprotein lipase (LPL), 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6 (AGPAT6), mitochondria glycerol-3-phosphate acyltrandferase (GPAM) and butyrophilin subfamily 1 member A1 (BTN1A1)in BMECs (P<0.05), the higher inhibiting effect was only observed in high Leu concentration (3.60 to 7.20 mmol/L) treatments. Taken together, Leu concentration has a significant effect on the expression of genes related with milk fat synthesis and protein expression of PPARγ and SREBP1 in BMECs. The 1.80 to 2.70 mmol/L Leu has a better promoting effect ondenovofatty acid synthesis genes and SREBP1 protein expression, as well as little inhibiting effect on the expression of genes involved in TG synthesis and lipid droplet formation.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1319-1326]

dairy cow; bovine mammary epithelial cells; leucine; milk fat

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.029

2016-09-28

國家奶業(yè)“973計劃”項目(2011CB1008003)

趙艷麗(1986—)，女，陜西榆林人，博士研究生，從事奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂乳蛋白合成調(diào)控研究。E-mail： ylzhao2010@163.com

*通信作者:閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yansmimau@163.com

S827

A

1006-267X(2017)04-1319-08