河蜆酶解物對乙醇誘導(dǎo)肝細胞LO2損傷的保護作用*

任嬌艷 尚帥明 梁明 張婷 周勇 李海龍 袁爾東?

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640； 2.無限極(中國)有限公司， 廣東 廣州 510665)

酒精性肝病(ALD)是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的一大主要疾病.其發(fā)病機制比較復(fù)雜，可能與乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛、氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素、脂質(zhì)過氧化、細胞凋亡等多種因素有關(guān)[1].肝臟是乙醇在人體內(nèi)的最重要的代謝器官，研究表明乙醇脫氫酶(ADH)、肝微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS)以及過氧化氫酶(CAT)是參與乙醇代謝的3條途徑[2].其中MEOS中核心的酶是細胞色素P4502E1(CYP2E1)，該酶會被乙醇誘導(dǎo)而激活，參與大部分乙醇代謝，并產(chǎn)生過量的活性氧(ROS).細胞內(nèi)累積的ROS會攻擊細胞膜和線粒體，造成細胞結(jié)構(gòu)和功能上的損傷，使得細胞內(nèi)的氧化還原失衡，從而導(dǎo)致肝細胞損傷或凋亡，進一步造成酒精性肝損傷[3].因此，這種具有抗氧化能力的化合物潛在具備對酒精性肝損傷保護的功能.

河蜆(Corbiculafluminea)是雙殼類軟體動物，其營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖原、必需氨基酸等物質(zhì)，同時具備食用價值、保健作用以及藥用價值，因其具有利尿、治療肝病等功效而廣受歡迎[4].研究發(fā)現(xiàn)[5]，河蜆活性成分多糖CFPS-2具有很強的抗氧化活性且呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，對人的胃癌細胞和卵巢癌細胞的生長也具有顯著的抑制作用.河蜆的脂質(zhì)成分可使高膽固醇食物誘發(fā)的高膽固醇血癥小鼠血清中膽固醇濃度顯著降低，促進膽固醇代謝為膽汁酸[6].

文中主要研究河蜆不同酶解物的抗氧化活性，建立乙醇誘導(dǎo)肝細胞(LO2)損傷模型，并利用此模型評價河蜆不同酶解物對乙醇致LO2細胞損傷的保護作用，篩選所得的河蜆酶解物可作為護肝健康食品中的活性功能因子.

1 實驗

1.1 材料與試劑

河蜆干粉購自臺灣；人正常肝細胞由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供.

堿性蛋白酶(Alcalase，200 U/mg)、中性蛋白酶(Neutrase，200 U/mg)、木瓜蛋白酶(Papain，600 U/mg)、胰酶(Pancreatin，600 U/mg)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme，30 U/mg)，均由廣州華琪生物科技有限公司提供.

DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖溶液，美國Cibco公司生產(chǎn)；胎牛血清，杭州四季青有限公司生產(chǎn)；四氮唑藍(MTT)、Trolox、熒光素鈉(FL)，美國Sigma公司生產(chǎn)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn).

1.2 儀器與設(shè)備

Synerg Neo2全功能微孔板檢測儀，美國BioTek公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，德國Leica公司生產(chǎn).

1.3 方法

1.3.1 河蜆不同蛋白酶酶解物的制備

蛋白質(zhì)含量測定參考GB 5009.4—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮自動分析儀測定；

蛋白酶酶解物制備過程如下：河蜆原料→按比例加水勻漿→酶解(酶解過程中兩次調(diào)pH)→滅酶(沸水浴，10 min)→冷卻→離心(8 000 r/min，20 min)→上清液過濾→酶解液濃縮→凍干→酶解物.

采用鄰苯二甲醛(OPA)法測定各河蜆酶解物的水解度.400 μL 待測液加入3 mL OPA試劑中，室溫下準確反應(yīng)2 min，以去離子水調(diào)零后，于340 nm波長測定吸光值，以去離子水代替樣品液作為對照，標準溶液為絲氨酸溶液(0.05 g/L).水解度(DH，%)計算式為

DH=h/htot×100%.

式中，h為蛋白水解后肽鍵的平均數(shù)，htot為每個蛋白分子的肽鍵總數(shù).5種蛋白酶的酶解條件參數(shù)如表1所示.

1.3.2 酶解物抗氧化能力測定

(1)酶解物DPPH自由基清除率的測定

參考Luo等[7]的方法，并作適當修改.2 mL樣品待測液和2 mL 95%乙醇混合后在測定波長的吸

表1 5種蛋白酶的酶解條件參數(shù)Table 1 Hydrolysis conditions of 5 kinds of proteases

光值為Aj；在2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)中加入2 mL 樣品，在測定波長下的吸光值為Ai；對照樣為2 mL DPPH溶液加2 mL 95%乙醇，在測定波長下的吸光值為Ac.將待測溶液避光放置30 min，在517 nm處測其對應(yīng)吸光值，樣品對DPPH的清除率R為

分別測定50、75、100、125、150 mg/L質(zhì)量濃度下樣品的DPPH自由基清除率，繪制曲線并利用方程計算不同樣品DPPH自由基清除率為50%時所對應(yīng)的樣品的濃度，即為IC50值.

(2)酶解物氧化自由基吸收能力ORAC值測定

ORAC方法參照Huang等[8]的方法并略有改動.反應(yīng)于75 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.4)環(huán)境中進行，具體操作如下：在96孔板各微孔中分別加入20 μL待測樣品和Trolox標準液(6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每個孔加入200 μL的熒光素納溶液(0.096 μmol/L)，于37 ℃孵育20 min，迅速在各孔中加入20 μL AAPH溶液(119.4 μmol/L)，在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm下連續(xù)測定熒光強度，間隔2 min，測定90次.繪制Trolox標準曲線，并以Trolox當量來表示樣品的ORAC值.

1.3.3 細胞培養(yǎng)

LO2細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗.

1.3.4 乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷模型的建立

(1)MTT法測定細胞存活率

取處于對數(shù)生長期的LO2細胞接種于96孔細胞板中，每孔5 000個細胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實驗組加入乙醇濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的培養(yǎng)液，空白對照組加等量的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個平行，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h.每孔加20 μL MTT 溶液(5 g/L)，于培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，在490 nm波長下測各孔的吸光值D(490).計算不同濃度乙醇處理后各組細胞的存活率：

(2)ALT和AST酶活性檢測

將處于對數(shù)生長期的LO2細胞按1×105個/孔的密度接種于24孔細胞板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清，實驗組加入1 mL乙醇濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的培養(yǎng)液，空白對照組加等量的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h.取培養(yǎng)液以10 000 r/min的速度離心10 min，取上清，按照ALT和AST檢測試劑盒上方法測定各自的酶活性，單位用U/L表示.

1.3.5 酶解物的護肝活性

(1)MTT法評價酶解物的護肝活性

方法步驟同1.3.4節(jié)所述，實驗組更換為不同酶解物，濃度梯度設(shè)為100、200、300、400、500 mg/L，分別計算各種酶解物在各個濃度下的細胞存活率.

酶解物的護肝活性評價：LO2細胞鋪板步驟同上，鋪板24 h后，實驗組400 mg/L不同酶酶解物預(yù)孵育24 h，模型組加入等量的培養(yǎng)液孵育24 h，棄上清，實驗組加入含有400 mg/L相對應(yīng)的酶解物和0.8 mol/L 乙醇的培養(yǎng)液，模型組加入0.8 mol/L乙醇的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，空白對照組始終用培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別計算各組的細胞存活率.

(2)ALT和AST酶活性檢測

將LO2細胞按1×105個/孔的密度接種于24孔細胞板，接下來的步驟同本節(jié)(1)和1.3.4節(jié)中(2).

1.3.6 分子量分布測定

分子量分布測定采用GB/T22729—2008《海洋低聚肽》中的凝膠過濾色譜法.采用的分離柱為TSK Gel G2000 SWXL，流動相為45%(體積分數(shù))的乙腈水溶液(含0.1%三氟乙酸)，流速為0.5 mL/min，檢測波長為214 nm.

1.3.7 氨基酸組成分析

采用A300自動氨基酸分析儀測定樣品氨基酸組成.樣品經(jīng)6 mol/L 鹽酸在110 ℃下水解后用HPLC進行分析.測定條件為:membraPureT259鈉離子交換柱，反應(yīng)器溫度為115 ℃，流動相速度為160 μL/min，茚三酮溶液流速為80 μL/min，進樣體積為20 μL，在570和440 nm處進行檢測.

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 河蜆不同酶解物的水解度

經(jīng)計算得，河蜆干粉的蛋白質(zhì)含量高達56.59%±0.50%.如表1所示，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶酶解河蜆所得酶解物的水解度最高，可分別達到24.23%和24.09%，而木瓜蛋白酶酶解河蜆所得酶解物的水解度最低，表明木瓜蛋白酶不適合酶解河蜆蛋白質(zhì).

2.2 河蜆不同酶解物的抗氧化能力

2.2.1 河蜆不同酶解物清除DPPH自由基的活性

DPPH·是一種穩(wěn)定的氮自由基，由于本研究中采用無水乙醇作為溶劑，抗氧化劑與溶劑之間會產(chǎn)生氫鍵作用力，不利于氫原子的釋放，因此實驗中DPPH自由基清除反應(yīng)是基于ET反應(yīng)機制[9].經(jīng)計算得堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH自由基的IC50分別是104.69±2.05、108.02±0.38、85.31±0.19、112.56±0.11、102.18±3.44 mg/L.同時由圖1可以看出木瓜蛋白酶的酶解物的DPPH自由基清除能力顯著性的強于其他酶解物(P<0.05).

a、b、c表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.2 河蜆不同酶解物的ORAC值

ORAC方法原理是基于偶氮化合物AAPH在O2的作用下產(chǎn)生ROO·，而ROO·與熒光素鈉作用生成沒有熒光的物質(zhì)，使總熒光強度減弱,通過延緩熒光強度衰減的能力評價抗氧化活性[10].國際上以Trolox為當量表示抗氧化劑的ORAC值，通過設(shè)置不同濃度的Trolox延緩熒光強度衰減，其標準曲線方程為：y=0.355 8x+1.803 1，r2=0.992 3.如圖2所示，胰蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的ORAC值顯著高于其他三者(P<0.05)，表明胰蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物清除過氧自由基的能力強于其他酶解物，且計算得胰蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的ORAC值分別為(2.54±0.18)和(2.59±0.06) mmol Trolox/g.

a、b、c表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.3 乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷模型的建立

2.3.1 乙醇對LO2細胞的毒性作用

采用MTT法檢測乙醇對LO2細胞的毒性作用，如圖3所示，0.4 mol/L乙醇作用24 h后，細胞存活率已經(jīng)出現(xiàn)顯著性的降低，達到86%(P<0.05)，而當乙醇濃度大于0.6 mol/L時，LO2細胞的存活率低于79%(P<0.01)，且呈現(xiàn)出劑量效應(yīng).當乙醇濃度達到0.8 mol/L時，細胞存活率接近50%.

2.3.2 乙醇對LO2細胞中ALT和AST的影響

乙醇對肝毒性的體外實驗可直接通過測量肝細胞轉(zhuǎn)氨酶釋放到培養(yǎng)基中的水平來完成[11].實驗中用乙醇孵育LO2細胞，發(fā)現(xiàn)從細胞質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中的ALT和AST量會隨著乙醇濃度的增加而增加，這與其他人的研究結(jié)果相吻合[12].如表2所示，當乙醇的濃度增加到0.8 mol/L及以上時，培養(yǎng)液中的ALT和AST的活性顯著高于空白組(P<0.01).由此可知，本實驗的乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷模型建立成功，并選擇0.8 mol/L為模型中乙醇的濃度.

相對于空白對照組，*—P<0.05,**—P<0.01

Fig.3 Viability of LO2 cells treated with different EtOH concentrations

表2 乙醇對LO2細胞中ALT和AST的影響1)

Table 2 Effects of EtOH on ALT and AST contents in LO2 cells

乙醇濃度/(mol·L-1)ALT酶活/(U·L-1)AST酶活/(U·L-1)0.013.21±1.0711.84±2.460.415.77±1.4719.63±0.400.623.86±2.37*19.95±2.040.844.25±0.69**39.40±0.69**1.045.91±3.05**51.16±1.28**

1)相對于空白對照組，*—P<0.05，**—P<0.01.

2.4 河蜆酶解物對LO2細胞的增殖影響

采用MTT法研究河蜆酶解物對LO2細胞生長增殖的影響，結(jié)果如表3所示，其中堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶的河蜆酶解物在各個濃度下的細胞存活率與空白組相比沒有顯著性差異，說明對LO2細胞的增殖沒有影響.而復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的河蜆酶解物在質(zhì)量濃度為100和200 mg/L時，細胞存活率顯著性高于空白對照組(P<0.05)，這是因為該酶解物中的一些多肽作為營養(yǎng)物質(zhì)被細胞吸收，從而促進了LO2細胞的增殖.體外多肽促進細胞增殖已有文獻報道[13].

表3 不同質(zhì)量濃度(100～500 mg/L)酶解物對LO2細胞增殖的影響1)Table 3 Effect of the different mass concentrations(100～500 mg/L) of hydrolysates on proliferation of LO2 cells

1)相對于空白對照組，*—P<0.05.

2.5 河蜆酶解物對乙醇致LO2細胞毒性的影響

研究河蜆酶解物的護肝活性,MTT實驗的結(jié)果如圖4所示，乙醇組細胞的存活率顯著低于空白組(P<0.05)，而河蜆酶解物組的細胞存活率比乙醇組顯著增加(P<0.05)，說明河蜆酶解物抑制了乙醇對LO2細胞的毒性作用，而其中胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的酶解物組的細胞存活率也顯著高于其他酶解物組(P<0.05)，證明兩者緩解乙醇致LO2細胞損傷的能力強，護肝活性好，而這結(jié)果與各酶解物的ORAC活性強弱一致.乙醇在體內(nèi)代謝過程中會產(chǎn)生大量的包括O2·-在內(nèi)的ROS，其中CYP2E1催化乙醇代謝為乙醛和乙醛的進一步代謝過程是產(chǎn)生O2·-的主要來源，這些自由基可造成DNA損傷、蛋白質(zhì)變性、增加細胞膜的脂質(zhì)過氧化和破壞細胞內(nèi)氧化平衡等危害，引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細胞凋亡，酶解物通過清除的自由基，平衡細胞內(nèi)的氧化與抗氧化體系，進而保護細胞免受損傷.而ORAC實驗的實質(zhì)也是清除過氧自由基，故在理論上解釋了兩者的實驗結(jié)果一致性.

相對于空白對照組，*—P<0.05;相對于乙醇組，#&—P<0.05

Fig.4 Effect of different hydrolysates on ethanol-induced LO2 cytotoxicity

2.6 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞ALT和AST的影響

ALT和AST作為評價對酒精性肝損傷保護作用的一項指標已經(jīng)有研究報道[14].實驗中選用兩個對乙醇致LO2細胞損傷保護作用好的酶解物，即胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物，實驗結(jié)果如圖5所示，由于乙醇對LO2細胞的損傷作用，與空白組相比，乙醇組的LO2細胞向培養(yǎng)液中釋放ALT和AST的顯著性增加，而經(jīng)過酶解物預(yù)孵育后，樣品組培養(yǎng)液中的ALT和AST活性顯著低于乙醇組，說明兩者均可抑制乙醇導(dǎo)致LO2細胞中ALT和AST的釋放，減緩乙醇對LO2細胞的損傷，進一步證明河蜆經(jīng)胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得的酶解物具有很好的護肝作用.

相對于空白對照組，*—P<0.05;相對于乙醇組，#—P<0.05

Fig.5 Effect of hydrolysates on the ALT and AST activity in EtOH-induced LO2 cells

2.7 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的分子量分布

由表4可得河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物分子量小于1 000 u的占大部分，其中復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的占比高達86.93%，這是由于復(fù)合風(fēng)味蛋白酶是外切酶，從肽鏈末端酶切，并且此結(jié)果與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的較高水解度相符.

表4 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的分子量分布

Table 4 Relative molecular weight distribution of Pancreatin and Flavourzyme hydrolysates ofCorbiculafluminea

分子量/u不同酶解物的占比/%胰酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶>300036.513.553000～100010.129.51<100053.3786.93

2.8 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的氨基酸組成

上述實驗表明,河蜆由胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物中的活性肽的抗氧化活性和保護酒精性肝損傷活性優(yōu)于其他，故對兩者進行氨基酸分析.研究表明[15]氨基酸的組成和序列極大地影響著活性肽的活性，且多種氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等可以螯合金屬離子，本身就具有抗氧化活性；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸的分子結(jié)構(gòu)與表面活性劑類似，具有抑制脂質(zhì)過氧化的能力；酸性氨基酸即天冬氨酸和谷氨酸，其側(cè)鏈羧基具有螯合金屬離子的能力.由表5可知，河蜆由胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物活性肽中，具有抗氧化能力的氨基酸含量分別是50.253%、49.008%，各占到總氨基酸含量的75.69%、75.06%，由此也證明河蜆經(jīng)胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物中的活性肽具備良好的抗氧化活性.

表5 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的氨基酸組成

Table 5 Amino acid composition of pancreatin and flavourzyme hydrolysates ofCorbiculafluminea

氨基酸名稱氨基酸含量1)/%胰酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶天冬氨酸8.1947.852蘇氨酸3.5253.422絲氨酸3.6033.511谷氨酸11.01011.032甘氨酸3.4183.452丙氨酸3.8713.927半胱氨酸1.0531.092纈氨酸3.5913.534蛋氨酸1.1581.295異亮氨酸2.8262.768亮氨酸4.8674.442酪氨酸3.6093.484苯丙氨酸3.3913.073組氨酸2.1782.043賴氨酸4.1364.171精氨酸3.7183.883脯氨酸2.2452.311酸性氨基酸19.20518.883抗氧化氨基酸10.2319.692疏水性氨基酸20.81720.433對抗氧化有貢獻的氨基酸50.25349.008

1)質(zhì)量分數(shù).

3 結(jié)論

文中通過實驗研究了河蜆酶解物對乙醇致LO2細胞損傷的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)河蜆不同酶解物均具備一定的DPPH自由基清除能力，且木瓜蛋白酶酶解河蜆所得酶解物的清除能力最強，而胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的ORAC值顯著高于其他酶解產(chǎn)物.乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷，導(dǎo)致其細胞存活率顯著降低，并使得ALT和AST釋放到細胞外.MTT實驗表明，在300和400 mg/L的質(zhì)量濃度下酶解物對細胞的增值無顯著性差異.酶解物預(yù)孵育可降低乙醇對LO2細胞的毒性，提高細胞存活率，其中胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解河蜆所得酶解物的效果最好，同時二者均可抑制乙醇導(dǎo)致的LO2細胞中ALT和AST的釋放，證明二者可保護受到乙醇損傷的LO2細胞.氨基酸組成分析顯示河蜆經(jīng)胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得活性肽中，對抗氧化有貢獻的氨基酸分別占總氨基酸量的75.69%、75.06%.文中結(jié)論為開發(fā)河蜆護肝產(chǎn)品提供了理論支撐.

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