超高濃釀造中小麥面筋蛋白水解物對釀酒酵母代謝的影響*

趙海鋒 盧敏 周永婧 陽輝蓉 孟赫誠

(華南理工大學 食品科學與工程學院, 廣東 廣州 510640)

啤酒是一種低酒精度發(fā)酵酒,含有各種營養(yǎng)物質(zhì),成分均衡,適度飲用有益于健康[1- 2].傳統(tǒng)的啤酒釀造是常濃釀造,現(xiàn)在的啤酒生產(chǎn)企業(yè)則主要采用高輔料釀造和高濃釀造技術(shù)[3].高濃釀造技術(shù)的應(yīng)用可以降低生產(chǎn)成本、提高設(shè)備利用率,改善啤酒風味，但同時也會產(chǎn)生一系列的問題,例如高滲透壓、高酒精毒性會使酵母的生長代謝受到影響,營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏(主要是氮源)會阻礙酵母的生長,使發(fā)酵延緩甚至停滯,從而影響啤酒發(fā)酵[4].而在提高酵母生長代謝和發(fā)酵效率的各種方法中,氮源補充被認為是最有效的方式.Vu等[5]發(fā)現(xiàn)添加0.25%的酵母抽提物和0.8%的吐溫80可以縮短發(fā)酵時間和提高乙醇產(chǎn)量.Kitagawa等[6]證實了大豆肽的添加可以提高酵母的抗凍壓力,使得酵母更能忍受低溫環(huán)境,但是大豆肽影響酵母生長代謝的機制還不明確.Kemsawasd等[7]發(fā)現(xiàn)氮源對酵母生長代謝的影響是有菌株特異性的,不同酵母影響也不同.文中研究了超高濃釀造中小麥面筋蛋白水解物的水解度和添加量對釀酒酵母生長和發(fā)酵性能的影響,以期探討釀酒酵母對小分子肽的吸收和代謝機制,并拓展小麥面筋蛋白的應(yīng)用范圍.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

釀酒酵母(Saccharomycespastorianus) FBY0095，華南理工大學食品生物技術(shù)研究室保藏;小麥面筋蛋白(蛋白含量76.1%)，安徽瑞福祥食品有限公司提供;胰酶(酶活力2.7×107U/g)，重慶市全新祥盛生物制藥有限公司提供;大麥芽、60 °P高濃麥葡糖漿,廣州珠江啤酒有限公司提供;其他試劑均為分析純.

冷凍離心機,3-18K,德國Sigma公司出品;全自動糖化儀,杭州博日科技有限公司出品;高效液相色譜儀,Waters2695,美國Waters公司出品;低溫培養(yǎng)箱,LRN-250CL,上海一恒科技有限公司出品;紫外分光光度計,UV-721,上海精密科學儀器儀表有限公司出品.

1.2 實驗方法

小麥面筋蛋白水解物的制備:參照萬春艷[8]制備大豆分離蛋白水解物的方法并加以改進,其中蛋白與水配比為1∶10(質(zhì)量體積比(g/mL)),調(diào)pH至9.0,胰酶添加量為蛋白質(zhì)量的1%.

麥汁制備、酵母活化和擴培:參照萬春艷等[9- 11]的方法,使20 °P麥汁的游離氨基氮(FAN)的含量控制在180 mg/L.

酵母發(fā)酵:將不同酶解時間的水解物分別添加至麥芽汁培養(yǎng)基中作為實驗組,不添加水解物的作為空白對照組(CK),調(diào)pH至5.5，高壓滅菌后,按每升培養(yǎng)基6.8 g酵母泥接入擴培后的酵母,在12 ℃的培養(yǎng)箱發(fā)酵,厭氧,隔天搖瓶.

1.3 分析方法

1.3.1 水解度(DH)測定

參照王劍鋒等[12- 14]的水解度測定方法測水解度.

1.3.2 酵母增殖和發(fā)酵性能指標測定

參照宗緒巖等[15- 16]的發(fā)酵過程各指標測定方法測量乙醇、表觀發(fā)酵度、發(fā)酵液降糖、生物量等.

1.3.3 游離氨基氮的測定

采用茚三酮比色法,樣液稀釋100至200倍,在1、2號玻璃試管中加入2 mL的蒸餾水,2、4號試管中加入2 mL甘氨酸標準液,其余試管則加入稀釋后的樣液,然后各試管中加入1 mL的發(fā)色劑,加玻璃珠,蓋上螺帽,將試管放于沸水浴中,精確反應(yīng)16 min,在20 ℃的水浴中冷卻20 min,再各加入稀釋劑5 mL,充分混勻.用空白液管(1、2 號試管)調(diào)節(jié)分光光度計零點,于570 nm 下測定吸光值,盡量在30 min內(nèi)測完.

FAN含量(mg/L)=樣液吸光值×2(mg/L)×稀釋倍數(shù)/甘氨酸標準液的吸光值

FAN含量消耗率(%)=(FAN初始量-FAN最終量)/FAN初始量×100%

稱取0.107 2 g甘氨酸用水溶解,定容至100 mL,從中取1 mL用水稀釋至100 mL,即為甘氨酸標準液,游離氨基酸質(zhì)量濃度為2 g/L.

發(fā)色劑的制備：取10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4、0.5 g茚三酮、0.3 g果糖溶于 100 mL 去離子水.

稀釋劑的制備：稱取碘酸鉀2 g溶于600 mL水中,加入96%(體積分數(shù))乙醇400 mL.

1.3.4 小麥面筋蛋白水解物分子量分布的測定

高效液相色譜法,參照莫芬等[17]的方法測定.色譜柱：TSK gel 2000SXL凝膠柱，7.8 mm×300 mm；預柱：C18；柱溫：30 ℃.流動相：100%磷酸鹽緩沖液(pH 7.2);流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；洗脫時間：20 min.檢測波長：214 nm.

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以3次平行實驗的平均值作為最終結(jié)果，用Origin 8.0和Excel 軟件數(shù)據(jù)作圖處理,利用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗分析，以P<0.05為差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 小麥面筋蛋白胰酶酶解過程中水解度的變化

小麥面筋蛋白可以被不同種類的蛋白酶酶解得到水解物,前期的研究發(fā)現(xiàn)[18],胰酶處理過的小麥面筋蛋白水解物具有良好的生理活性,所以文中選擇胰酶水解小麥面筋蛋白.酶解過程中水解度的變化如圖1所示.酶解的36 h內(nèi),水解度在6.8%～22.4%之間變化.前24 h隨著時間的增加水解度不斷增大,在24 h時水解度達到了22.4%,但是在24～36 h間水解度基本趨于穩(wěn)定,酶解36 h時水解度為21.7%.隨著反應(yīng)的進行底物濃度變小,可以被胰酶水解的肽鍵數(shù)目逐漸減少,同時酶活力也逐漸下降,因此隨著時間的延長,在24～36 h之間水解度并無顯著變化.

不同字母表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異

Fig.1 Changes in degree of hydrolysis of wheat gluten protein treated by pancreatic enzymes

不同水解度的酶解液中肽的分子量分布也不同,結(jié)果如表1所示.隨著水解度的增大,各水解物中10 ku的大分子肽類物質(zhì)逐漸減少,被水解成小分子肽或氨基酸,3 ku以下的多肽則逐漸增加,所占比例最多,從最初的32.8%到最終的62.7%.水解度為22.4%的酶解液中小分子肽最多,而酶解至36 h時,水解度和小分子肽含量均未進一步增大和提高.

表1 不同DH的水解物中肽的分子量分布

Table 1 Molecular weight distribution of hydrolysates with different DH

水解物編號DH/%基于分子量的肽的分布/%>10ku5～10ku3～5ku<3kuWG26.7923.7621.4022.0232.82WG49.0411.4218.8225.0844.68WG812.326.1315.7626.7551.36WG1215.744.3513.8926.8754.89WG2422.451.749.4826.0762.71WG3621.731.869.8126.0262.31

2.2 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對酵母生長的影響

將不同水解度的酶解物以1%的量添加到20 °P的超高濃麥汁中進行酵母發(fā)酵,觀察其對酵母生長和活性的影響,結(jié)果見圖2.水解度在6.8%～22.4%之間時,隨著水解度的增大,酵母凈增長量也增大,水解度22.4%組的酵母細胞凈增長量為6.0 g/L,達到最大值,說明酶解物的促酵母生長作用與其水解度有一定的相關(guān)性.發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液中酵母活性均保持在85%以上,其中WG24組的酵母活性明顯高于其他組,達到94.8%.

不同字母表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異

圖2 不同DH的小麥面筋蛋白水解物對酵母增殖和活性的影響

Fig.2 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different DH on the proliferation and viability of brewer’s yeast

小麥面筋蛋白水解后的主要物質(zhì)是肽類物質(zhì),而肽類物質(zhì)的生理活性與其分子量的大小有關(guān).小麥面筋蛋白水解物中3 ku以下的多肽所占比例最多,說明對促進酵母生長起主導作用的是小分子肽,與以往研究得出的結(jié)論一致.已有研究證實了有生理活性的主要是小分子肽,Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)3 ku以下的大豆肽能顯著促進酵母細胞的生長與代謝.張清麗[20]發(fā)現(xiàn)3 ku以下的酪蛋白活性肽對乳酸菌的生長代謝及乳酸發(fā)酵有很好的促進作用.以上結(jié)果說明，水解度為22.4%的小麥面筋蛋白酶解物的促酵母生長效果最好,因此最佳的酶解時間為24 h.

2.3 小麥面筋蛋白水解物(WG24)添加量對酵母生長代謝的影響

將酶解24 h得到的小麥面筋蛋白水解物以不同的量添加至培養(yǎng)基中，觀察酵母的生長代謝.從圖3中的生物量曲線圖可以看出,酵母生長經(jīng)過了延滯期和對數(shù)期后第8天生物量達到最大,經(jīng)過了兩天的穩(wěn)定期后進入了衰亡期,細胞逐漸自溶,生物量降低.在第23天時最大生物量的WG1.0%組為6.4 g/L,對照組生物量最少為5.5 g/L,4組樣的最大凈增長量與最大生物量結(jié)果一致,均為WG1.0%組>WG2.0%組>WG0.1%組>對照組,相比之下,添加1.0%的水解物對酵母的促生長效果最好.這印證了上面的實驗結(jié)果,即水解物的添加可以促進酵母生長,但是其促進作用并不總隨著水解物添加量的增大而增加,過多的水解物在一定程度上會抑制酵母細胞的生長,抑制原因尚待進一步探究.

圖3 小麥面筋蛋白水解物添加量對釀酒酵母增殖的影響

Fig.3 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different amounts on proliferation of brewer’s yeast

2.4 小麥面筋蛋白水解物添加量對酵母發(fā)酵性能的影響

游離氨基氮(FAN)是麥汁中能夠被酵母直接利用的含氮物質(zhì),主要是游離氨基酸和銨離子以及小分子肽(二肽和三肽),酵母的生長代謝伴隨著氮源的吸收利用[21].從圖4可知,20 °P的超高濃麥汁最初FAN含量是180 mg/L左右,添加不同量的小麥面筋蛋白水解物(WG24)后,FAN含量均有不同程度提高,WG0.1%組的最初FAN是200 mg/L,而WG1.0%和WG2.0%組的FAN含量分別是390和580 mg/L,充足的氮源可以保證酵母細胞的快速生長,從而有利于啤酒的發(fā)酵.在發(fā)酵前12 d,酵母細胞大量生長繁殖,伴隨著氮源物質(zhì)的大量消耗,而前2 d的FAN下降速度相對較快,12 d之后,FAN含量又有小幅度的上升,然后趨于平穩(wěn).這是因為隨著發(fā)酵的進行,在后期由于乙醇的大量產(chǎn)生和其他產(chǎn)物的積累,對細胞產(chǎn)生了毒害作用,從而使其自溶,胞內(nèi)的氮類物質(zhì)進入發(fā)酵液中,FAN含量小幅地上升[22].發(fā)酵結(jié)束后,各組殘留FAN含量不同,并不是所有的氮源都能被吸收利用,有些多肽類氮源要用于穩(wěn)定啤酒的泡沫和多肽類復雜物質(zhì)的代謝合成[23].各組的FAN利用率分別是71%、60%、47%和41%,說明初始FAN含量越低,利用量越少,但是利用率卻越高.WG1.0%組添加了水解物后FAN含量比對照組增加了200 mg/L,結(jié)束時FAN消耗比對照組多50 mg/L,說明水解物在高濃麥汁中能被酵母有效的利用25%,WG2.0%組也有同樣的結(jié)果.

圖4 小麥面筋蛋白水解物添加量對釀酒酵母發(fā)酵利用FAN的影響

Fig.4 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on FAN utilization rate of brewer’s yeast

在釀酒酵母生長代謝的過程中不僅有氮源物質(zhì)的消耗吸收,同時也伴隨著糖的吸收利用,如圖5所示.在20 °P的超高濃麥汁發(fā)酵中,4組最初的糖度基本一致,隨著酵母的生長繁殖,營養(yǎng)物質(zhì)被消耗,在前4天,4組的降糖速率差距不大,而從第4天到第12天之間,各自的耗糖速度出現(xiàn)差異,WG2.0%組最慢,發(fā)酵12天之后,酵母停止生長,糖度基本保持穩(wěn)定.此時,WG1.0%組的表觀發(fā)酵度達到了84%,WG0.1%組的發(fā)酵度則是82%左右,對照組也發(fā)酵結(jié)束,達到了80%,但是WG2.0%組卻只有76%,氮源的充足可以使酵母快速生長繁殖,大量消耗營養(yǎng)物質(zhì),但是過量的氮源在某種程度上又會抑制酵母的生長,所以氮源的適量補充是很有必要的.

圖5 小麥面筋蛋白水解物添加量對釀酒酵母降糖的影響

Fig.5 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on sugar consumption of brewer’s yeast

酵母細胞吸收氮源和糖類以及其他營養(yǎng)物質(zhì)的過程中,一部分用于自身的繁殖,另一部分則用于乙醇以及其他高級醇和酯類等風味物質(zhì)的合成.發(fā)酵過程中的乙醇含量如圖6所示,在酵母生長的前12 d內(nèi),乙醇含量逐漸增加,之后發(fā)酵結(jié)束,乙醇含量保持恒定.在乙醇生成的整個過程中,WG1.0%組的乙

圖6 小麥面筋蛋白水解物的添加量對釀酒酵母乙醇生成的影響

Fig.6 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on ethanol yield of brewer’s yeast

醇含量始終是4組中最高的,達7.6%之多,比乙醇含量最少的對照組提高了15%,而WG0.1%和WG2.0%組的乙醇含量相對于對照組也有一定的提高.綜合以上結(jié)果,可以得出小麥面筋蛋白水解物的最適添加量為1.0%(見表3).這進一步說明了小麥蛋白水解物在超高濃度麥汁中能夠有效促進釀酒酵母的生長和發(fā)酵,是啤酒釀造的一種有效氮源.

表3 添加1.0%的小麥蛋白水解物對釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

Table 3 Effects of 1.0% wheat gluten hydrolysates on fermentation performance of brewer’s yeast

項目發(fā)酵周期/d凈增長量/(g·L-1)表觀發(fā)酵度/%終殘?zhí)?°PFAN利用量/(mg·L-1)乙醇產(chǎn)量/%對照組125.81803.72131.06.6WG1.0%126.08843.02185.07.6變化率/%04.6523.2041.215.2

3 結(jié)語

小麥面筋蛋白水解物在20 °P的超高濃麥汁中對釀酒酵母的增殖、活性保持以及發(fā)酵代謝具有促進作用,在啤酒發(fā)酵中可作為酵母的有效氮源.胰酶處理小麥面筋蛋白時,其中水解度達22.4%的水解物添加量為1.0%時對酵母的促進效果最佳,可使酵母活性達94.8%,殘?zhí)橇拷档?3.2%,乙醇產(chǎn)量提高15.2%.文中的研究明確了小麥面筋蛋白水解物對于提高酵母生長和發(fā)酵性能的作用,在啤酒生產(chǎn)中有潛在的應(yīng)用價值和指導意義.

參考文獻：

[1] 楊靜靜,鐘俊輝,杜綠君,等.啤酒與健康 [J].啤酒科技,2016(1):14- 25.

YANG Jing-jing,ZHONG Jun-hui,DU Lü-jun,et al.Beer and health [J].Beer Science and Technology,2016(1):14- 25.

[2] TIAN J.Determination of several flavours in beer with headspace sampling-gas chromatography [J].Food Chemistry,2010,123(4):1318- 1321.

[3] 孫燕,林劍,徐世艾.啤酒高濃釀造技術(shù)的研究進展 [J].釀酒科技,2013,3:78- 81.

SUN Yan,LIN Jian,XU Shi-ai.Progress of beer high gra-vity brewing technology [J].Liquor-Making Science & Technology,2013,3:78- 81.

[4] 薛軍俠.釀酒酵母的篩選鑒定及耐受性初步研究 [D].咸陽:西北農(nóng)林科技大學,2007.

[5] VU T K L,LE V V M.Using fed-batch fermentation in high-gravity brewing:effects of nutritional supplementation on yeast fermentation performance [J].International Food Research Journal,2010,17(1):117- 126.

[6] KITAGAWA S,SUGIYAMA M,MOTOYAMA T,et al.Soy peptides enhance yeast cell growth at low temperatures [J].Biotechnology Letters,2012,35(3):375- 382.

[7] KEMSAWASD V,VIANA T,ARDO Y,et al.Influence of nitrogen sources on growth and fermentation performance of different wine yeast species during alcoholic fermentation [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99(23):10191- 10207.

[8] 萬春艷.大豆活性肽對酵母增殖代謝及啤酒發(fā)酵的影響研究 [D].廣州:華南理工大學,2012.

[9] 萬春艷,趙海鋒,趙謀明.超高麥汁濃度釀造對啤酒酵母代謝的影響 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(12):55- 58.

WAN Chun-yan,ZHAO Hai-feng,ZHAO Mou-ming.Effects of very high gravity brewing on the metabolism of saccharomyces cerevisiae [J].Food and Fermentation Industry,2010,36(12):55- 58.

[10] 管敦儀.啤酒工業(yè)手冊 [M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1998:1- 95.

[11] 莫芬.小麥面筋蛋白水解物對酵母增殖代謝及啤酒發(fā)酵的影響研究 [D].廣州:華南理工大學,2014.

[12] 王劍鋒,孫爽,李瑤,等.甲醛滴定法測定牛血清白蛋白的酶解度 [J].大連民族學院學報,2012,14(5):441- 444.

WANG Jian-feng,SUN Shuang,LI Yao,et al.Determination of degree of enzymatic hydrolysis of BSA by formol titration method [J].Journal of Dalian Nationalities University,2012,14(5):441- 444.

[13] 史瑋,孫瑩,徐振斌.凱氏定氮法測定糧食蛋白質(zhì)含量方法研究 [J].糧食科技與經(jīng)濟,2013,38(5):31- 32.

SHI Wei,SUN Ying,XU Zhen-bin.Determination of protein content in grain by Kjeldahl method [J].Grain Science and Technology and Economy,2013,38(5):31- 32.

[14] 萬春艷,趙謀明,趙海鋒.大豆蛋白水解物對釀酒酵母生長和發(fā)酵性能的影響 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(9):50- 53.

WAN Chun-yan,ZHAO Mou-ming,ZHAO Hai-feng.Effects of soy protein hydrolysates on the growth and fermentation characteristics of brewer’s yeast [J].Food and Fermentation Industries,2011,37(9):50- 53.

[15] 宗緒巖.啤酒分析檢測技術(shù) [M].西安：西南交通大學出版社,2012.

[16] 趙謀明,莫芬,趙海鋒,等.小麥面筋蛋白活性肽對啤酒超高濃度釀造的影響 [J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(6):36- 41.

ZHAO Mou-ming,MO Fen,ZHAO Hai-feng,et al.Effects of wheat gluten protein peptides on the fermentation performance of yeast under super high gravity brewing [J].Modern Food Science and Technology,2014,30(6):36- 41.

[17] 莫芬,趙謀明,趙海鋒.小麥面筋蛋白水解物對釀酒酵母增殖和發(fā)酵性能的影響 [J].食品工業(yè)科技,2012,33(22):222- 225.

MO Fen，ZHAO Mou-ming，ZHAO Hai-feng.Effect of wheat gluten protein hydrolysates on the propagation and fermentation performance of brewer’s yeast [J].Science and Technology of Food Industry,2012,33(22):222- 225.

[18] MO Fen,ZHAO Hai-feng,LEI Hong-jie,et al.Effects of nitrogen composition on fermentation performance of brewer’s yeast and the absorption of peptides with different molecular weights [J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2013,171(6):1339- 1350.

[19] ZHAO Hai-feng,WAN Chun-yan,ZHAO Mou-ming,et al.Effects of soy protein hydrolysates on the growth and fermentation performances of brewer’s yeast [J].International Journal of Food Science and Technology,2014,49(9):2015- 2022.

[20] 張清麗.酪蛋白活性肽對乳酸菌生長代謝及酸乳發(fā)酵影響的研究 [D].廣州:華南理工大學,2011.

[21] LEKKAS C,STEWART G G,HILL A,et al.The importance of free amino nitrogen in wort and beer [J].Technical Quarterly-Master Brewers Association of the Americas,2005,42(2):113- 116.

[22] 譚玉,孫玉梅,曹方.啤酒高濃度發(fā)酵酵母的擴培方式 [J].大連工業(yè)大學學報,2013,32(2):91- 93.

TAN Yu,SUN Yu-mei,CAO Fang.The method of yeast propagation for beer high gravity brewing [J].Journal of Dalian University of Technology,2013,32(2):91- 93.

[23] INGLEDEW W M,PATTERSON C A.Effect of nitrogen and concentration on the uptake of peptides by a lager yeast in continuous culture [J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,1999,57(1):9- 17.