靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制備及其體外活性測定①

毛春燕 安鋼力 王祥嶺 翟曉晨 孟會敏 游鳳濤 楊 林

(蘇州大學唐仲英血液學研究中心，江蘇省血液學協(xié)同創(chuàng)新中心，蘇州215123)

靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制備及其體外活性測定①

毛春燕②安鋼力③王祥嶺②翟曉晨②孟會敏 游鳳濤④楊 林

(蘇州大學唐仲英血液學研究中心，江蘇省血液學協(xié)同創(chuàng)新中心，蘇州215123)

目的：構建基于EGFR納米抗體的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL，并檢測其對EGFR腫瘤細胞的細胞毒作用。方法：采用分子克隆技術，將靶向EGFR的納米抗體7D12以二價的形式，通過柔性連接肽(G4S)4與銅綠假單胞菌外毒素的截斷形式PE38KDEL連接，構建原核表達載體pET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞，用IPTG進行誘導表達。通過鎳柱親和層析法純化目的蛋白，并經(jīng)Western blot驗證。通過流式細胞技術檢測該免疫毒素與EGFR陽性細胞A549、HT29、MCF-7和EGFR陰性細胞CEM、Jurkat的結(jié)合能力后，將其按照一定的濃度梯度進行細胞毒實驗研究，72 h后，使用WST-1試劑檢測BI7D12-PE38KDEL對上述細胞的殺傷效果。結(jié)果：通過SDS-PAGE和Western blot實驗驗證，成功的制備了重組免疫毒素BI7D12-PE38KDEL，該毒素大部分以可溶性的方式表達。BI7D12-PE38KDEL能夠與EGFR陽性的A549、HT29、MCF-7腫瘤細胞特異性的結(jié)合，并且對上述細胞的細胞毒作用與陰性對照組CEM和Jurkat相比具有極其顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論：成功地構建了基于EGFR納米抗體的重組免疫毒素BI7D12-PE38KDEL，該免疫毒素能特異性的結(jié)合并殺傷EGFR陽性的腫瘤細胞。

表皮生長因子受體；納米抗體7D12；免疫毒素；銅綠假單胞菌外毒素PE38KDEL

EGFR是HER家族中的一員，在大多數(shù)的上皮性腫瘤細胞上過度表達。當EGFR與其配體結(jié)合后，受體之間發(fā)生同源或異源二聚化，激活下游細胞信號通路，引起腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等[1]。因此，針對EGFR的治療具有特別重要的意義。免疫毒素，作為一種新穎的治療藥物已經(jīng)得到了廣泛的研究。它是將具有靶向識別作用的抗體、配體或細胞因子等與具有毒性殺傷作用的細胞毒素通過化學方法耦合或基因工程手段融合在一起而形成[2]。就目前的研究而言，將單克隆抗體與細胞毒素組裝而成的免疫毒素最受研究者的關注和青睞。但由于單克隆抗體分子量大、組織穿透性差、親和性低等一些缺陷，這些免疫毒素的治療效果沒有達到理想的效果，阻礙了其在臨床中的應用。因此，能夠得到可以克服傳統(tǒng)免疫毒素缺點，具有較好治療效果的新穎免疫毒素是目前研究迫切需要的。

本實驗構建的免疫毒素，其抗體部分選擇的是靶向EGFR的納米抗體7D12。與傳統(tǒng)單克隆抗體相比，納米抗體具有一些獨特的優(yōu)勢，包括分子量小，親和力強，免疫原性低等。前期的研究顯示納米抗體7D12具有較高的親和力和靶向性?？紤]到納米抗體分子量小，在體內(nèi)半衰期短的特點，我們將納米抗體7D12以二價形式，然后通過(G4S)4連接肽融合銅綠假單胞菌外毒素的截斷形式PE38KDEL，得到免疫毒素BI7D12-PE38KDEL，并初步在體外進行了該毒素對EGFR陽性腫瘤細胞的殺傷效果，獲得了較為理想的殺傷結(jié)果，為以后靶向EGFR的治療提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；質(zhì)粒小提試劑(Plasmid miniprep Kit)、DNA凝膠提取試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)購自Axygen scientific；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ，T4DNA連接酶均購自New England Biolabs；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Sangon；抗His標簽鼠單克隆抗體和Goat Anti-Rabbit IgG,HRP Conjugated均購自Cwbio tech；抗His標簽兔單克隆抗體和Anti-mouse IgG Fab2 Alexa Flour(R)647均購自Cell Signaling Technology；Cell Proliferation Reagent WST-1購自Dojindo。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株和細胞株 質(zhì)粒PUC57-BI7D12、PUC57-PE38KDEL均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；原核表達載體pET28a由本實驗室保存；大腸桿菌Trans1-T1、BL21(DE3)均購自北京全式金生物技術有限公司；人肺腺癌細胞A549、人結(jié)腸癌細胞HT29、人乳腺癌細胞MCF-7、人T淋巴白血病細胞Jurkat、CEM均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 PE38KDEL基因擴增 設計引物F-P：CGC-GGATCCGCCGCAGCACTGGAAGGCGGTAG，R-P：C-CCTCGAGTTACAGTTCATCTTTCGGCGG；質(zhì)粒PUC 57-PE38KDEL作為模板，通過DreamTaq DNA聚合酶擴增PE38KDEL片段。PCR反應程序如下：預變性94℃ 4 min，變性94℃ 25 s，退火63℃ 30 s，延伸72℃ 70 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠跑膠回收，然后按照DNA凝膠提取試劑盒操作說明得到PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組表達質(zhì)粒pET28a(+)-BI7D12-PE38K DEL的構建 用NcoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒PUC57-BI7D12、pET28a(+)，37℃5 h，分別經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠跑膠回收目的片段，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，經(jīng)菌落PCR鑒定，小提質(zhì)粒后送測序公司測序，得到pET28a(+)-BI7D12載體。將構建好的pET28a(+)-BI7D12載體、PCR產(chǎn)物PE38KDEL片段用BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，分別37℃酶切5 h和酶切過夜，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠跑膠回收目的片段，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，經(jīng)菌落PCR鑒定，小提質(zhì)粒后送測序公司測序，得到pET28a(+)-BI7D12-PE38KDEL表達載體。

1.2.3 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的表達及純化 將重組的表達質(zhì)粒pET28a(+)-BI7D12-PE38KD EL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單菌落，接種于4 ml含100 mg/ml Kana+的LB中，37℃ 250 r/min過夜培養(yǎng)。然后以1∶100的比例接種到新鮮的LB中擴大培養(yǎng)，37℃ 250 r/min，待OD值約0.6～0.8時，加入IPTG(1 mmol/L)至終濃度為0.5 mmol/L，20℃，200 r/min誘導培養(yǎng)過夜。4℃離心收集菌體，PBS重懸，冰上超聲破碎，4℃離心收集上清和沉淀。然后通過SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況。經(jīng)蛋白純化儀，用含300 mmol/L咪唑洗脫緩沖液收集目的蛋白。純化得到的目的蛋白經(jīng)濃縮過濾后，經(jīng)BCA法測定其濃度，置于-80℃保存。

1.2.4 Western blot鑒定免疫毒素BI7D12-PE38KD EL 取適量蛋白用PBS稀釋后，進行SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，以5%的脫脂奶粉封閉后，依次孵育一抗抗His兔單克隆抗體(1∶1 000)，二抗Goat Anti-Rabbit IgG,HRP Conjugated(1∶5 000)，經(jīng)DAB顯色，洗片分析。

1.2.5 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的抗原結(jié)合特異性測定 收集對數(shù)期生長良好的A549、HT29、MCF-7、Jurkat、CEM細胞，經(jīng)PBS多次清洗后，分別加入適量的BI7D12-PE38KDEL，冰上孵育1 h。然后用PBS處理后加入二抗抗His標簽鼠單抗，冰上孵育1 h。最后加入三抗Anti-mouse IgG Fab2 Alexa Flour(R)647，冰上避光孵育1 h。用PBS重懸后，通過BD流式細胞分析儀檢測細胞的熒光強度。

1.2.6 WST-1檢測免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的細胞毒作用 取適量對數(shù)期生長良好的A549、HT29、MCF-7細胞，接種于96孔板，分別加入不同濃度的BI7D12-PE38KDEL，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h后，每個孔加入10 μl的WST-1試劑，混勻后細胞培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)。1.5 h后，置于酶標儀測450 nm波長下的OD值。將EGFR陰性的人T淋巴白血病細胞Jurkat、CEM同樣地采用上述方法處理，作為陰性對照組。細胞抑制率按照以下公式計算：抑制率(%)=1-(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照物-OD空白組)×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗結(jié)果通過GraphPad軟件進行Student′sttest分析，P<0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增PE38片段 經(jīng)PCR擴增PE38KDEL基因片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1 170 bp處得到與預期結(jié)果一致的條帶(圖1)。

2.2 成功構建pET28a(+)-BI7D12-PE38KDEL 分別用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒PUC57- BI7D12、

圖1 PE38KDEL的PCR結(jié)果Fig.1 PCR result of PE38KDELNote：M.5000 DNA marker;1-2.The amplification of PE38KDEL fragment by PCR.

pET28a后進行了16℃過夜連接并轉(zhuǎn)化TransT1感受態(tài)，菌落PCR(圖2A)后，挑取陽性克隆進行測序，測序結(jié)果正確，并經(jīng)雙酶切實驗(圖2B)進行驗證，結(jié)果顯示酶切后能得到預期大小一樣的片段，即成功構建pET28a(+)-BI7D12。將測序正確的質(zhì)粒pET28a(+)-BI7D12和PE38KDEL片段用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，16℃過夜連接，菌落PCR(圖3A)后，挑取陽性克隆進行測序，測序結(jié)果正確，雙酶切結(jié)果(圖3B)同樣地證實酶切能得到預期大小的兩個片段，即成功構建重組質(zhì)粒pET28a(+)-BI7D12-PE38KDEL。

2.3 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的表達純化和鑒定 將IPTG誘導表達后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，

圖2 載體pET28a-BI7D12的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification result of pET28a-BI7D12 by PCR and restriction enzyme digestionNote：M.5000 DNA marker;A.The Colony PCR result of pET28a-BI7D12-PE38,and 1,2 were positive colonies；B.The identification of pET28a-BI7D12-PE38KDEL by restriction enzyme digestion.

圖3 載體pET28a-BI7D12-PE38DEL的鑒定結(jié)果Fig.3 Identification result of pET28a-BI7D12-PE38KD-EL by PCR and restriction enzyme digestionNote：M.5000 DNA marker;A.The Colony PCR result of pET28a-BI7D12-PE38KDEL,and 2,4,5 were positive colonies；B.The identification of pET28a-BI7D12-PE38KDEL by restriction enzyme digestion.

圖4 BI7D12-PE38KDEL純化后的SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 Identification of purified BI7D12-PE38KDEL by SDS-PAGENote：M.Protein marker;1-3.Purified fusion protein.

圖5 BI7D12-PE38KDEL的Western blot 鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of BI7D12-PE38KDEL by West-ern blot

結(jié)果顯示目的蛋白主要以可溶性的方式表達。將收集得到的上清，用蛋白純化儀純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在74 kD處得到與理論結(jié)果一致的目的蛋白條帶(圖4)。通過Western blot驗證，同樣地在74 kD處得到與預期結(jié)果一致的條帶(圖5)。

2.4 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL特異性地結(jié)合EGFR陽性的腫瘤細胞株 為了確定重組免疫毒素BI7D12-PE38KDEL是否可以特異性的結(jié)合EGFR陽性的細胞，使用EGFR陽性的人肺腺癌細胞A549、人結(jié)腸癌細胞HT29、人乳腺癌細胞MCF-7和EGFR陰性的T淋巴瘤白血病細胞CEM、Jurkat，采用了流式細胞技術檢測免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的抗原特異性結(jié)合能力。結(jié)果顯示，重組免疫毒素BI7D12-PE38KDEL均能與EGFR陽性的A549、HT29、MCF-7細胞很好地結(jié)合，且結(jié)合能力均較強(圖6A)；而與EGFR陰性的CEM、Jurkat細胞幾乎無結(jié)合能力(圖6B)。

2.5 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL對EGFR陽性細胞株的殺傷作用 不同濃度的BI7D12-PE38KDEL與A549、HT29、MCF-7細胞作用72 h后，與對照組Jurkat、CEM細胞相比，免疫毒素BI7D12-PE38KDEL對EGFR陽性的上述細胞均有顯著的殺傷作用(P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(圖7)。在最高濃度1 000 ng/ml時，殺傷率依次為78%、76%、54.3%，而對EGFR陰性的Jurkat、CEM細胞幾乎無殺傷作用，說明BI7D12-PE38KDEL能夠特異性地靶向EGFR將毒素分子運送到腫瘤細胞內(nèi)達到特異性殺傷作用。

圖6 BI7D12-PE38KDEL的抗原結(jié)合特異性測定Fig.6 Determination of antigen-binding specificity of BI7D12-PE38KDELNote：A.The binding ability of BI7D12-PE38KDEL with EGFR-positive cells;B.The binding ability of BI7D12-PE38KDEL with EGFR-negative cells.

圖7 BI7D12-PE38KDEL對多種腫瘤細胞的殺傷作用Fig.7 Cytotoxicity of BI7D12-PE38KDEL on several tumor cell lines

3 討論

近年來，針對EGFR過表達腫瘤的治療主要有兩種，包括靶向EGFR功能部分的單克隆抗體和活性區(qū)的小分子蛋白酶抑制劑，其作用機制一樣，均是通過靶向作用直接抑制EGFR信號通路，進而影響EGFR下游的其他重要通路[3]。這兩種治療方法雖早已進入了臨床應用，但卻對患者產(chǎn)生了一些副作用?；颊叩脑S多健康組織，如胃腸道、皮膚等表達低水平的EGFR，通過EGFR抗體或小分子蛋白酶抑制劑對EGFR信號通路的抑制后，大約50%～100%的患者出現(xiàn)了皮疹，胃腸道紊亂等癥狀[4]。因此，尋找一種基于不依賴直接抑制細胞內(nèi)信號通路的機制來治療EGFR陽性腫瘤患者是非常值得探索的。免疫毒素是近年來新興的一種腫瘤靶向治療方法。一般是將植物或細菌來源的生物毒蛋白與抗體組合一起，定向攻擊腫瘤細胞，而其對正常組織的殺傷較小，因此又被形象地稱為“生物導彈”。

目前，免疫毒素的毒素部分，應用較廣泛的是細菌來源的銅綠假單胞菌外毒素PE。它是銅綠假單胞桿菌分泌的，由613個氨基酸組成的一條單鏈多肽，包括三個結(jié)構域：DⅠ、DⅡ和DⅢ，其中DⅡ的功能尚不清楚，但大部分氨基酸缺失之后不會影響PE活性；DⅢ由第253～364位氨基酸殘基組成，是ADP核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性區(qū)，可以抑制細胞的蛋白質(zhì)合成[5]。其DⅠ部分包括DⅠa和DⅠb，由于DⅠa部分能通過細胞膜上PE受體使PE與靶細胞結(jié)合，因此在毒素部分我們通常去除PE的細胞結(jié)合部位DⅠa區(qū)，得到PE類衍生物，如PE38、PE40等。該類衍生物均去除了PE的細胞結(jié)合部位，既可以降低非特異細胞結(jié)合能力，又保留了細胞毒活性。目前，用于構建免疫毒素的PE類衍生物用的較普遍成熟的是PE38KDEL。PE38KDEL去除了PE的DⅠa全部和DⅠb的一部分，并將PE羧基端的REDLK換成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列KDEL，其細胞毒作用得到了明顯的提高[5]。近年來隨著免疫毒素的發(fā)展，從第一代免疫毒素慢慢發(fā)展到現(xiàn)如今比較成熟的第三代免疫毒素，其各方面也得到了很好地改善，但仍然存在一些問題，影響了免疫毒素在臨床的應用。目前，基于單克隆抗體的免疫毒素應用居多，但單克隆抗體分子量大，大約150 kD，致使最終免疫毒素分子量很大，組織滲透性差。另一方面，其大部分免疫毒素以包涵體的形式誘導出來，純化過程比較費時費力。因此，對于免疫毒素的抗體部分，我們可以進行改進。納米抗體是目前已知的可結(jié)合目標抗原的最小單位[6]，只包含重鏈可變區(qū)，在1993年，首次由比利時的一位科學家在羊駝外周血液中發(fā)現(xiàn)。基于羊駝重鏈抗體的VHH單域抗體的特殊結(jié)構，納米抗體諸多方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的單克隆抗體：①分子量小，大約15 kD，組織滲透性強；②特異性強，親和力高；③可溶性高，不易聚集；④原核系統(tǒng)表達容易，降低成本；⑤對人的免疫原性低[7]。綜合以上優(yōu)勢，這種小型的納米抗體在未來的基礎研究、新藥開發(fā)和疾病的診斷治療等方面展現(xiàn)出了廣闊的應用研究價值，包括將納米抗體與毒素結(jié)合，制備成免疫毒素。目前，基于納米抗體巨大的優(yōu)勢和潛力，我們實驗室已經(jīng)篩選得到了特異性的CD7納米抗體VHH6，構建了基于CD7納米抗體的免疫毒素PG001和PG002，體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示，PG001和PG002均能在納摩爾濃度級別強有力的抑制CD7陽性的T-ALL細胞系，與之前報道的基于CD7單鏈抗體的免疫毒素相比效果更好[8]。

本研究的免疫毒素，抗體部分選擇靶向EGFR納米抗體7D12。7D12與西妥昔單抗一樣，結(jié)合EGFR相同的表位[9]。當7D12與EGFR結(jié)合后會阻止EGFR胞外區(qū)構象改變，而這種改變的構象正是EGFR受體同源或異源二聚化所需要的。目前，納米抗體7D12已經(jīng)在一些方向進行了研究。Maria等[10]將7D12與68Ga、雙功能螯合劑對異硫氰酸芐基去鐵胺耦合，運用正電子發(fā)射型計算機斷層顯像技術，在腫瘤模型中成功地檢測了EGFR的表達。Roovers等[11]制備了基于7D12的雙表位納米抗體，其親和力大幅度提高，并具有較好的體內(nèi)外腫瘤生長抑制效果?；诩{米抗體優(yōu)越的條件及上述資料，本實驗選擇制備基于EGFR納米抗體7D12的免疫毒素?？紤]到納米抗體分子量小，體內(nèi)半衰期短，將7D12以二價形式，用連接肽(G4S)4與銅綠假單胞菌外毒素的截斷形式PE38KDEL融合，通過基因工程手段構建到原核表達載體pET28a(+)上，經(jīng)IPTG(0.5 mmol/L)誘導后，大部分以可溶的形式在上清中表達。利用給抗體基因前設計的6×His標簽，使用鎳柱親和層析法進行了蛋白的純化，超濾濃縮之后，最終得到目標蛋白BI7D12-PE38KDEL，并經(jīng)Western blot得到了驗證。同時，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示重組蛋白BI7D12-PE38KDEL仍然能與EGFR陽性的A549、HT29、MCF-7細胞表面抗原保持較好的結(jié)合能力，并對其具有較好的靶向殺傷能力。綜上所述，BI7D12-PE38KDEL作為一種靶向EGFR的重組免疫毒素，為EGFR陽性腫瘤的治療帶來了新的治療策略，同時，為靶向其他抗原基于納米抗體的免疫毒素的研究提供了新的思路。

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[收稿2016-10-21 修回2016-11-21]

(編輯 張曉舟)

Preparation of immunotoxin BI7D12-PE38KDEL directed to EGFR and determination of its activity in vitro

MAOChun-Yan，ANGang-Li，WANGXiang-Ling，ZHAIXiao-Chen，MENGHui-Min，YOUFeng-Tao，YANGLin.

CyrusTangHematologyCenter,SoochowUniversity,CollaborativeInnovationCenterofHematology,SoochowUniversity,Suzhou215123，China

Objective:To prepare nanobody-based immunotoxin BI7D12-PE38KDEL targeting EGFR and to examine its cytotoxicity against EGFR positive tumor cells.Methods：By using molecular cloning strategy,prokaryotic expression construct of pET28a-BI7D12-PE38KDEL was generated which consisted of nanobody 7D12 targeting EGFR in the form of a divalent fused with PE38KDEL,a truncated form of pseudomonas exotoxin A via a flexible peptide(G4S)4,and then transformed into E.coli BL21(DE3).Protein expression was induced by adding IPTG,purified by Ni-affinity column chromatography,and verified by Western blot.The binding capacity of the resulted immunotoxin to EGFR-positive cells A549,HT29,MCF-7 and EGFR-negative cells CEM,Jurkat were determined by flow cytometry assay,and its cytotoxicity against the target cells was examined.Briefly,tumor cells were treated with different dosage of the immunotoxin,and the killing efficacy of BI7D12-PE38KDEL on these cells were assessed by WST-1 assay after 72 hours.Results：The SDS-PAGE and Western blot results showed the recombinant immunotoxin BI7D12-PE38KDEL was successfully prepared,and majority of them was expressed in soluble form.BI7D12-PE38KDEL could selectively bind to EGFR-positive cells of A549,HT29,and MCF-7.More importantly,the immunotoxin exhibited much more significant killing effect on these EGFR positive cells compared to the negative control group of CEM and Jurkat cells(P<0.01).Conclusion：In the current study,the nanobody-based immunotoxin BI7D12-PE38KDEL targeting EGFR was successfully prepared and exhibited a superior inhibition effect for the growth of EGFR-positive cells.

Epidermal growth factor receptor(EGFR);Nanobody 7D12;Immunotoxin;Pseudomonas exotoxin PE38KDEL

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.017

①本文為山東省自然科學基金資助項目(ZR2015PH029)。

毛春燕(1991年-)，女，碩士，主要從事免疫毒素方面的研究，E-mail：cy141229@163.com。

及指導教師：楊 林(1965年-)，男，教授，博士生導師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail：yanglin@suda.edu.cn。

R392.11

A

1000-484X(2017)04-0558-06

②同時就讀于西安交通大學蘇州研究生院，蘇州215123。

③并列第一作者。

④博生吉醫(yī)藥科技(蘇州)有限公司，蘇州215123。