小分子干擾RNA沉默RhoGDI2基因表達對結腸癌細胞增殖侵襲的影響及其機制①

王文睿 顏宏利 馬俐君 柳思琪 金珍婧

(吉林大學第二醫(yī)院肝膽胰內科，長春130041)

小分子干擾RNA沉默RhoGDI2基因表達對結腸癌細胞增殖侵襲的影響及其機制①

王文睿 顏宏利②馬俐君③柳思琪 金珍婧

(吉林大學第二醫(yī)院肝膽胰內科，長春130041)

目的：應用小分子干擾RNA(siRNA)沉默RhoGDI2基因的表達，初步探討其對結腸癌細胞增殖、遷移能力的影響及可能的機制。方法：分別運用Western blot和RT-qPCR檢測結腸癌細胞株RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116基因RhoGDI2的表達情況。設計并合成RhoGDI2 siRNA干擾序列，按照LipofectamineTM2000轉染方法將siRNA干擾序列轉染到目的細胞，設置實驗干擾組、空白對照和陰性對照組；CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，細胞劃痕試驗和Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲能力。結果：人結腸癌細胞株RhoGDI2表達量由高到低依次是RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116；RKO細胞siRNA干擾后RhoGDI2表達抑制率大于70%：實驗干擾組、陰性對照組、空白對照組細胞增殖率分別是(0.683±0.013)、(0.866±0.088)、(0.905±0.008),P<0.05；實驗干擾組細胞遷移、侵襲速率較對照組均減慢。沉默RhoGDI2基因的表達，實驗組細胞E-Cadherin較對照組表達量高，Vimentin蛋白表達下降。結論：結腸癌RhoGDI2基因沉默可能通過抑制EMT進程阻止腫瘤惡性生物學行為。

siRNA；RhoGDI2；結腸癌；上皮間質轉化

鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子2(Rho GDP dissociation inhibitor ,RhoGDI2)，屬于Rho家族一員，通過調節(jié)細胞骨架活動、細胞分裂增殖及細胞變形等活動，從而在腫瘤細胞遷移及浸潤等過程中發(fā)揮重要的作用[1]，由于腫瘤組織及惡性程度不同，其對腫瘤惡性行為學具有雙重調節(jié)作用，其在膀胱癌中作為抑癌基因負向調控腫瘤增殖，該基因高表達與患者生存率呈正相關[2]，其抑制腫瘤轉移的機制可能與c-Src激酶有關，在膀胱腫瘤中兩者均表達減少，同時c-Src與磷酸化的RhoGDI2結合可增強抑制腫瘤轉移能力[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中有著雙重調節(jié)作用，RhoGDI2一方面可抑制乳腺癌發(fā)展，另一方面可增強Cox-2表達而促進乳腺癌發(fā)展，最終效果取決于二者中作用較強的方面[4]。有研究認為RhoGDI2主要通過影響Rac GTPases調控細胞功能[5]，在乳腺癌發(fā)生中可能起著重要作用，RhoGDI2可能是乳腺癌干預治療的新靶點。RhoGDI2在胃癌、結腸癌等消化道腫瘤中發(fā)揮著促進腫瘤增殖、侵襲轉移的作用，其調控腫瘤侵襲及轉移的機制尚不十分清楚[6]。結腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，50%以上患者可發(fā)生肝轉移或肺轉移，腫瘤轉移是影響患者生存率的重要原因，在結腸癌中，RhoGDI2調控腫瘤惡性行為學的生物學作用和分子機制研究仍有爭議。近年來有研究顯示RhoGDI2的表達水平與患者預后、總體生存期有關，RhoGDI2低表達者總體生存率高，該基因對腫瘤的進展和轉移起促進作用。本研究通過RNA干擾的方法，沉默結直腸癌RKO細胞中RhoGDI2基因的表達，觀察RhoGDI2基因對RKO細胞增殖、周期、凋亡的影響，希望進一步揭示抑制RKO細胞侵襲、轉移和增殖的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人結直腸癌RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116細胞購自中國科學院上海細胞庫；RhoGDI2一抗購自美國Abcam公司；PVDF膜和化學發(fā)光液購自美國Millipore公司；LipofectaminTM2000購自Invitrogen公司；表達質粒(RhoGDI2-shRNA)、對照質粒購自上海吉瑪生物有限公司；RhoGDI2靶序列為5′-TTTATGGTTGGCAGCTATG-3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及總蛋白的提取 結直腸癌細胞株SW480、SW620采用含10%胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基，RKO、HCT116、HT29采用含10%胎牛血清的DMEM置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞傳代生長至對數(shù)期、密度為70%～80%，依次提取其總蛋白，按說明書測定其蛋白含量。

1.2.2 Western blot測定RhoGDI2蛋白含量 按比例配制12% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠，取20 μg蛋白質樣品，加樣、恒壓100 V電泳至溴酚藍進入分離膠底部停止電泳。根據(jù)蛋白質Marker所指示的條帶位置，選取合適大小凝膠，按照凝膠大小準備PVDF膜，300 mA恒進行轉膜。配置5%脫脂奶粉用于封閉PVDF，小心棄去封閉液，加入兔抗人RhoGDI2單克隆抗體和鼠抗人β-actin 單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST液洗膜3次，加入辣根過氧化酶標記的抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST液洗膜3次。將TBST洗液吸盡，于膜上加入化學發(fā)光試劑，滴加AB顯影液(A∶B=1∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配)顯影。

1.2.3 RhoGDI2-shRNA質粒轉染RKO細胞 轉染前24 h將RKO細胞接種至6孔培養(yǎng)板中，1×106/孔，使細胞達到80%匯合，轉染前2 h時將完全培養(yǎng)基換為Opti-MEM培養(yǎng)基400 μl。分別用50 μl的Opti-MEM稀釋2 μg待轉染質粒DNA和5 μl LipofectamineTM2000，室溫孵育5 min，將50 μl的LipofectamineTM2000混合物加入質粒DNA中，總體積為100 μl，輕輕混勻，室溫孵育20 min。將100 μl的DNA-LipofectamineTM2000輕柔加入6孔板中，輕輕混勻，培養(yǎng)6 h后更換完全培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d用于后續(xù)實驗。細胞轉染率(%)=熒光蛋白表達細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4 PCR檢測基因沉默效率 轉染RhoGDI2-shRNA實驗組細胞、空質粒對照組細胞、未轉染空白組于培養(yǎng)24、48、72 h抽提RNA，反轉為cDNA,利用PCR驗證RhoGDI2基因沉默效率。

1.2.5 細胞增殖實驗 待測RKO細胞分為三組，RhoGDI2-shRNA組、空質粒對照組及未轉染空白對照組，三組細胞培養(yǎng)于96孔板，待細胞密度為40%～50%，經上述轉染處理RKO細胞，并于轉染0、24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，輕搖混勻后用錫箔紙包裹培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)80 min后，酶標儀450nm波長處檢測各孔光密度(OD)值，每組設5個復孔。計算三組細胞的相對增殖率，細胞相對增殖率=(實驗組OD值-空白組OD 值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.6 細胞侵襲實驗 提前將Transwell小室從-20℃冰箱內取出，置于24孔板內，向上室及下室內分別加入200 μl及500 μl的無血清培養(yǎng)基，37℃，5%CO2孵箱內孵育2 h后棄去培養(yǎng)基。Tra-nswell小室下室每孔加入500 μl完全培養(yǎng)液，上室內每孔加入含1×105個細胞的無血清培養(yǎng)液200 μl，37℃，5%CO2孵箱內孵育48 h。用0.01%結晶紫染液500 μl染色15 min。每孔加入1 ml PBS洗液，清洗2 min，3次。用棉簽輕拭凈小室上層細胞，于倒置顯微鏡下拍照。

1.2.7 細胞劃痕愈合實驗 于6孔板接種細胞，細胞達到70%融合度時，分別轉染RhoGDI2-shRNA、空質粒，同時設立空白對照組，無血清培養(yǎng)基饑餓細胞12 h。用10 μl槍頭垂直劃痕，須避免傾斜。用PBS輕柔洗滌細胞3次，除去劃痕處劃下的懸浮細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)0、24、48 h于顯微鏡下測量劃痕的距離，劃痕愈合率/相對遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h、48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2 結果

2.1 Western blot 檢測RhoGDI2蛋白表達的結果顯示，在5種結直腸癌細胞株RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116中RhoGDI2的表達水平不同，RhoGDI2在RKO、HT-29、和SW620細胞株中的表達明顯較高，SW480、HCT116細胞株的表達量較低(圖1)。與實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)結果基本吻合。檢測轉染RhoGDI2-shRNA質粒后的RKO細胞，與對照組相比，RhoGDI2蛋白表達明顯減少(圖2)，說明RhoGDI2基因已被成功沉默。

2.2 siRNA干擾 選取RhoGDI2表達量高的RKO細胞作為目的細胞進行RMA干擾，其中RKO細胞的空白對照組、空質粒對照組、基因干擾組的RhoGDI2表達量分別是(0.785±0.017)、(0.824±0.029)、(0.153±0.005)，P<0.01，對RhoGDI2蛋白表達的抑制率達70%以上。

2.3 沉默RhoGDI2基因后RKO細胞增殖速率減

圖1 RhoGDI2在結腸癌細胞中的表達情況Fig.1 Expression of RhoGDI2 in colorectal cancer cell lines

圖2 RhoGDI2基因沉默效率Fig.2 Efficiency of RhoGDI2 gene silencing

慢 RKO細胞轉染RhoGDI2-shRNA質粒0、24、48、72 h后，測定細胞增殖周期，RKO細胞RhoGDI2基因干擾組、空質粒對照組、空白對照組細胞增殖速率分別是(0.683±0.013)、(0.866±0.088)、(0.905±0.008)，P<0.05，轉染組與對照組相比，細胞增殖周期速率減慢(圖3)。

2.4 RhoGDI2基因沉默RKO細胞遷移速率減慢 RhoGDI2-shRNA質粒轉染RKO細胞后，倒置顯微鏡下觀察各組細胞劃痕愈合程度，各組細胞傷痕愈合程度結果如下圖(圖4A、B)。如圖顯示沉默基因RhoGDI2后，實驗組細胞遷移速率較對照組細胞遷移速率減慢。

2.5 RhoGDI2基因沉默RKO細胞侵襲速率減慢RhoGDI2-shRNA質粒轉染RKO細胞后，Transwell細胞侵襲實驗結果顯示結果如下圖(圖5)。如圖顯示沉默基因RhoGDI2后，實驗組細胞侵襲速率較對照組細胞減慢。

圖3 CCK8實驗檢測細胞增殖速率Fig.3 Effect of RhoGDI2 expression on proliferation of RKO cells by CCK8Note：*.P<0.05.

圖4 劃痕愈合實驗、Transwel實驗檢測細胞侵襲Fig.4 Migration and invasion ability reduced in Rho cells silencing of RhoGDI2 expression by siRNANote: A.Effect of RhoGDI2 expression on migration of Rho cells by wound healing;B.Effect of RhoGDI2 expression on invasion of Rho cells by Transwell.

圖5 Western blot法檢測RhoGDI2沉默對EMT相關蛋白表達的影響Fig.5 Effects of RhoGDI2 gene siliencing by siRNA on expression of E-cadherin and Vimentin

2.6 RhoGDI2沉默對EMT相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，RKO細胞沉默RhoGDI2基因表達后，E-cadherin蛋白表達增加，Vimentin蛋白表達減少(圖5)。

3 討論

腫瘤侵襲、轉移是其惡性行為學標志之一，同時是導致患者死亡的重要原因之一，腫瘤發(fā)生轉移的過程復雜，探討腫瘤轉移的分子機制有望為腫瘤治療新靶點提供新思路。RhoGDI2可與RhoGTPases結合，RhoGTPases與GTP連接后被活化，繼而經鳥苷酸交換因子(Guaninenucleotide exchanging factor，GEF or RhoGEF)、GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP or RhoGAP)、RhoGDI三種調節(jié)因子，使GTP失活為GDP，成為失活狀態(tài)，形成GTP連接形式的活化型和GDP連接形式的失活型的循環(huán)[7]。其中RhoGDI是RhoGTP酶的調節(jié)中樞，具有雙重功能：RhoGDI位于細胞質時，處于溶解狀態(tài)，優(yōu)先與GDP連接形式的RhoGTP酶結合形成復合物，使結合GDP的RhoGTP酶處于非活化狀態(tài)；當RhoGDI位于質膜上時，通過與GTP結合形式的RhoGTP酶相互作用，抑制GTP酶水解，使RhoGTP酶維持活化狀態(tài)[8-11]。

在胃癌中，RhoGDI2表達多見于細胞核，且在惡性度高的細胞中表達量上升，胃癌細胞過表達RhoGDI2后其侵襲能力增強[12]。Cho等[13]研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞過表達RhoGDI2后，通過Rac1介導的NF-kB信號通路上調Snail表達，激活NF-κB信號通路，促進腫瘤EMT進程。同時也發(fā)現(xiàn)增強RhoGDI2表達后，細胞實驗水平顯示可增強腫瘤細胞侵襲轉移能力，體外荷瘤實驗發(fā)現(xiàn)可促進瘤體生長、血管形成與遠處轉移[14]，其可能是通過促進VEGF及HGF介導的腫瘤轉移、侵襲等惡性生物學行為[15]，在胃癌中，血管內皮生長因子可能是RhoGDI2的靶蛋白。另有學者認為環(huán)氧合酶-2，是調控乳腺癌細胞侵襲和轉移的重要調節(jié)因子，也是RhoGDI2的靶蛋白之一[16-19]。然而，在胃癌細胞中β-整合素、環(huán)氧合酶-2的表達與RhoGDI2無關，這可能與腫瘤微環(huán)境異質性有關。RHOGDI在腫瘤中的表達與作用機制比較復雜，與腫瘤特質性有關。同時RhoGDI與RhoGTPases相互作用時，其活化方式多樣，這可能是影響其在不同腫瘤中功能差異的原因之一[20]。

同樣有學者發(fā)現(xiàn)胃癌細胞過表達RhoGDI2后[21]，通過上調CATD及PAK2的表達，導致腫瘤化療耐藥性增強。李守峰[22]研究發(fā)現(xiàn)結腸癌組織中RhoGDI2表達量較癌旁組織明顯升高。組織芯片進一步驗證CRC組織中RhoGDI2的表達與臨床病理參數(shù)間的相關性，RhoGDI2表達陽性率與腫瘤臨床TNM分期呈正相關，但還需擴大樣本量進一步研究。石干等[23]發(fā)現(xiàn)CIAPIN1可能為RhoGDI2在胃癌浸潤轉移過程中的下游靶基因, 兩者相互作用共同調節(jié)胃癌的侵襲轉移。陳穎等[24]通過對80例結腸癌患者隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，基因RhoGDI2可能通過促進EMT發(fā)生增強腫瘤侵襲、轉移等惡性生物學行為。

本研究在mRNA及蛋白水平分別檢測RhoGDI2在5種結腸癌細胞中的表達情況，結果顯示RhoGDI2在RKO、HT29細胞中表達較高，選取RhoGDI2高表達的RKO細胞利用小干擾RNA沉默RhoGDI2基因后，分別檢測細胞增殖、遷移速率，進一步探討結腸癌中RhoGDI2表達與腫瘤惡性行為學之間的關系。RhoGDI2基因表達沉默后，細胞增殖、侵襲、遷移速率均較對照組減慢，提示RhoGDI2可能與促進結腸癌侵襲轉移有關。本研究結果提示RhoGDI2基因沉默后EMT進程被抑制，阻止腫瘤增殖、遷移及侵襲等惡性生物學行為。因此，RhoGDI2可能是結腸癌的轉移促進基因。通過抑制RhoGDI2基因表達，干擾其介導的腫瘤侵襲及轉移，有望為腫瘤靶向治療提供新思路。

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[收稿2016-11-03 修回2016-12-18]

(編輯 許四平)

Effects of RhoGDI2 gene silencing by siRNA on proliferation and invasion of colon carcinoma cell lines

WANGWen-Rui,YANHong-Li,MALi-Jun,LIUSi-Qi,JINZhen-Jing.

TheDepartmentofHepatopancreatobiliary,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China

Objective:To study the silencing gene expression level of RhoGDI2 small interfering RNA(siRNA)and the colorectal cancer cell malignant behaviors such as cell proliferation,migration,invasion.Methods：Testing RhoGDI2 expression using Westen blot analysis and Real-time reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR)in the colorectal cancer cell lines of RKO,HT29,SW620,SW480,HCT116.The siRNA of RhoGDI2 with Lipofecta mineTM2000 was transfected into target cells,as well as negative control and normal control groups.Cell counting kits(CCK-8)to detect proliferation，Wound healing assay and the Transwell plate migration and invasion was detected.The epithelial-mesenchymal transition(EMT)relevant protein E-cadherin/Vimentin expression was detected.Results：Human colon cancer cell lines RhoGDI2 expression levels decreased in the order of RKO,HT29,SW620,SW480,HCT116：siRNA inhibited RhoGDI2 expression rate of RKO cell by 70%；in silence group，negative control group and blank contro1 group，the proliferation rates were(0.683±0.013),(0.866±0.088),(0.905±0.008)，P<0.05；Wound healing assay and Transwell assay suggested RhoGDI2 silencing could inhibit migration；siRNA interference of colon cancer cells downregulated Vimentin，but upregulated E-Cadherin protein.Conclusion：RhoGDI2 down-regulation could significantly inhibit the cell proliferation，migration，invasion of colon cancer cell.

Small interfering RNA； RhoGDI2； Colon cancer； Epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.015

王文睿(1990年-)，女，在讀碩士，醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤的臨床及基礎研究。

及指導教師：金珍婧(1965年-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤、肝硬化的臨床及基礎研究，E-mail:jinyu0429@sina.com。

R735.3+5

A

1000-484X(2017)04-0549-05

①本文為吉林省科技廳科研基金課題(2013c026-1)。

②第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院檢驗科，上海200336。

③上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院腫瘤科，上海200336。