miR-148a通過DNMT1調(diào)控MSCs向心肌分化的內(nèi)在作用機(jī)制研究①

賴卓莉 蔣昌科

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院兒科，重慶402160)

miR-148a通過DNMT1調(diào)控MSCs向心肌分化的內(nèi)在作用機(jī)制研究①

賴卓莉 蔣昌科

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院兒科，重慶402160)

目的：驗(yàn)證DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)是miR-148a直接調(diào)控的靶基因，探究miR-148a通過靶向DNMT1調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向心肌分化的作用機(jī)制。方法：MSCs細(xì)胞經(jīng)5′-氮胞苷(5′-aza)誘導(dǎo)向心肌分化后，使用miRNA芯片篩選出誘導(dǎo)前后表達(dá)差異的miRNAs。Targetscan軟件分析異常表達(dá)的miR-148a的靶基因，將野生型或突變型DNMT1的3′-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告基因的下游(DNMT1-wt或DNMT1-mut)并分別與miR-148a mimics(miR-148a模擬物)或scramble(miR-148a陰性對照)共轉(zhuǎn)染，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證所預(yù)測的靶基因DNMT1，qRT-PCR和Western blot分別檢測轉(zhuǎn)染miR-638 mimics和scramble后，對DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建miR-148a慢病毒質(zhì)粒，分別在轉(zhuǎn)染到MSCs后的第1、7、14和28天后檢測miR-148a對GATA結(jié)合因子4(Gata-4)基因上游DNA調(diào)控序列CpG甲基化水平的影響、qRT-PCR和Western blot分別檢測轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒質(zhì)粒后對心肌特異蛋白：球蛋白重鏈(MHC)和心臟肌鈣蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表達(dá)的影響，以及對心肌特異轉(zhuǎn)錄因子心臟特異性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表達(dá)的影響。結(jié)果：miRNA芯片篩選5′-aza誘導(dǎo)MSCs向心肌分化后表達(dá)異常的miRNAs，包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等，其中miR-148a表達(dá)明顯上調(diào)。Targetscan、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和qRT-PCR驗(yàn)證DNMT1是miR-148a直接調(diào)控的靶基因。miR-148a慢病毒感染MSCs細(xì)胞，證實(shí)在轉(zhuǎn)染的不同時(shí)間，Gata-4上游基因甲基化水平發(fā)生改變，且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，Gata-4甲基化水平呈不斷降低趨勢，MSCs細(xì)胞內(nèi)MHC和cTnT表達(dá)提高，CD90和CD29表達(dá)降低，Nkx2.5和Gata-4表達(dá)提高，MSCs細(xì)胞出現(xiàn)向心肌分化。結(jié)論：miR-148a可通過靶向調(diào)控DNMT1而調(diào)控MSCs細(xì)胞的向心肌分化。

miR-148a；DNMT1；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；向心肌分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中的干細(xì)胞，不同誘導(dǎo)條件下，MSCs可分化為中胚層或外胚層組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、口腔黏膜、唾液腺等[1]。其中心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，不具備分化和增殖能力，一旦損傷便不能再生。目前心腦血管疾病是威脅人類健康的主要疾病之一，將MSCs細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，利用體外組織工程技術(shù)構(gòu)建工程化心肌組織，為臨床上心臟疾病的治療提供全新的治療思路[2-4]，因此研究和控制MSCs細(xì)胞的向心肌分化具有十分重要的意義。microRNAs(miRNAs)為內(nèi)源性非編碼RNA分子，其在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。MSCs的發(fā)育和分化過程涉及到眾多基因的時(shí)序性激活，受多種轉(zhuǎn)錄因子或細(xì)胞內(nèi)分子調(diào)控，而基因的時(shí)序性激活由基因的表達(dá)模式(基因的表觀遺傳修飾)所決定[6-8]。miRNA通過沉默或過表達(dá)其靶基因可誘導(dǎo)或抑制MSCs細(xì)胞的向心肌分化[9]。例如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methylt-ransferase 1，DNMT1)在基因的表觀遺傳修飾中發(fā)揮重要作用，DNMT1可維持DNA甲基化狀態(tài)，使組織或階段特異性基因關(guān)閉，DNMT1的去甲基化可使這些基因活化，使基因表達(dá)具有時(shí)序性[10]。已有文獻(xiàn)研究顯示，miR-148及其靶基因DNMT1均與DNA甲基化狀態(tài)的改變密切相關(guān)[11]。因此，我們猜測在MSCs向心肌分化過程中miR-148和DNMT1可能起著關(guān)鍵作用。本研究通過miRNA芯片篩選出在MSCs向心肌分化過程中異常表達(dá)的miRNA，其中就包括miR-148，通過驗(yàn)證miR-148的靶基因?yàn)镈NMT1。該研究初步明確miR-148和DNMT1在MSCs向心肌分化過程中的調(diào)控機(jī)制，將有助于MSCs的定向分化的控制及運(yùn)用，對臨床心腦血管疾病的治療具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 miR-148a模擬物(miR-148a mimics)及陰性對照scramble購于美國GeneCopoeia公司。內(nèi)參β-actin、兔抗人DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)、肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain，MHC)、心臟肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)、CD29、CD90均從美國CST公司購買。辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗購于武漢博士德公司。突變型DNMT1-mut和野生型DNMT1-wt均由GeneCopoeia公司構(gòu)建。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購于Promega公司，Lipofectamine 2000和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司。蛋白提取試劑盒、ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒均購于美國Thermo公司?；蚪M提取試劑盒zymoD3065和DNA甲基化修飾試劑盒GoldKit均購于美國Sigma公司。Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(天津，TBD生物技術(shù)公司)，無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒(Tiangen)，芯片雜交及測序由北京睿博興科公司完成。

1.1.2 臨床樣本 骨髓血(共5例)為臨床骨髓穿刺檢查為正常的患者，且所有患者均不存在任何家族遺傳病史和血液系統(tǒng)疾病，所有樣本均保存于-20℃冰箱，5名患者均為男性，年齡25～30歲，平均年齡為(26.9±0.8)歲，其中3名已婚，2名未婚，均無吸煙史。將無菌操作條件下抽取的健康骨髓收集到真空抗凝采血管中，迅速保存于-20℃冰箱，后續(xù)用所抽取的骨髓血培養(yǎng)MSCs需在1 d內(nèi)進(jìn)行。所有過程均遵從赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，本次研究的方案已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。所有入組的患者均被如實(shí)告知了可能的風(fēng)險(xiǎn)且與他們簽署了知情同意書，患者的所有臨床資料均被妥善保存且可隨時(shí)查閱。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取無菌操作條件下抽取的正?；颊呓】倒撬? ml(骨髓臨床穿刺檢查時(shí)抽取)，將骨髓細(xì)胞簡單離心使其沉至管底，加入DMEM培養(yǎng)基等體積稀釋混勻，500 r/min離心10 min，將上清和上層脂肪吸出，等體積DMEM混勻稀釋，輕輕將其轉(zhuǎn)移至含有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的試管中，隨后進(jìn)行30 min的2 200 r/min離心，將單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至干凈EP管中(界面處霧狀層)，D-Hank′s洗滌液洗滌細(xì)胞共2次，隨后將細(xì)胞重懸至含有10%胎牛血清(FBS，Gibco)及雙抗(100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml，Gibco)的DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d后換液，保留貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)傳代，用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化傳代。

人胚腎細(xì)胞293FT培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco，英濰捷基)，1%青霉素-鏈霉素(Gibco)溶液的DMEM-F12培養(yǎng)基中(Gibco)中，于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，棄培養(yǎng)液，1 ml PBS洗2遍，棄去PBS，0.25%胰酶(含EDTA，Gibco)消化，鏡下觀察，細(xì)胞間隙增大時(shí)，添加完全培養(yǎng)基終止消化，離心并收集細(xì)胞，將293FT細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，常規(guī)傳代。

1.2.2 體外誘導(dǎo)MSCs向心肌分化 將體外培養(yǎng)至第8代的MSCs按1×105ml-1接種于6孔板的已消毒的多聚賴氨酸包被的蓋玻片上制備細(xì)胞爬片，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶2)。接種48 h后，更換培養(yǎng)基。將5′-氮胞苷(5′-azacytidine，5′-aza)10 μmol/L加入到培養(yǎng)基中，恒溫37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)24 h后換液，1次/3 d，在此期間不進(jìn)行細(xì)胞傳代，顯微鏡(OLYMPUS IX73奧林巴斯倒置顯微鏡)下觀察細(xì)胞的形態(tài)改變，共連續(xù)觀察8周。在5′-氮胞苷誘導(dǎo)前，MSCs的形態(tài)為纖維細(xì)胞樣，且在藥物誘導(dǎo)后MSCs的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變。在使用藥物誘導(dǎo)1周后，MSCs細(xì)胞的體積變大，且為球形狀，藥物誘導(dǎo)2周后，在細(xì)胞的集落內(nèi)部和相鄰的集落細(xì)胞間出現(xiàn)了分支狀的連接。在誘導(dǎo)3周時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)肌管樣結(jié)構(gòu)，增殖分化能力有所增加。在藥物誘導(dǎo)第8周時(shí)，MSCs細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)開始保持穩(wěn)定，停止分化。此時(shí)可收集細(xì)胞，準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)miR Base中提供的miR-148a序列，設(shè)計(jì)寡核苷酸序列(TuD miR-148a)，根據(jù)載體pLKO.1-pure質(zhì)粒序列，選定酶切位點(diǎn)序列，委托GeneCopoeia公司合成miR-148a的寡核苷酸序列及其陰性對照序列，并將合成的序列以質(zhì)粒的形式保存在大腸桿菌中，成功構(gòu)建PLKO.1-TuD-miR148a質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒vector。按無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒(Tiangen)的說明書進(jìn)行操作，將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒的提取。將提取的PLKO.1-TuD-miR148a質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒vector用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)基上清，用0.45 μm濾膜過濾后，收集病毒液并分裝，進(jìn)行滴度測定后存于-80℃。

1.2.4 miRNA/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 收集細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基稀釋，吹打制成密度為5×104ml-1細(xì)胞的MSCs懸液，6孔板中每孔加入2 ml細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞匯合度約80%～90%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，用無菌EP管配制Lipofectamin 2000和轉(zhuǎn)染試劑(miR-148a mimics、scramble、PLKO.1-TuD-miR148a及其對照質(zhì)粒vector)；兩者混勻并室溫放置20 min。將混合物加入到無血清培養(yǎng)液(不含抗生素)中混勻，加入待轉(zhuǎn)染6孔板中；培養(yǎng)6 h后換成常規(guī)DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基。48 h后，收集細(xì)胞提取蛋白或RNA，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將miR-148a慢病毒質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到MSCs細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染第1、7、14和28天后分別提取總RNA/蛋白用于后續(xù)的qRT-PCR或Western blot檢測。

1.2.5 熒光素酶活性檢測 將實(shí)驗(yàn)分成四組：miR-148a與DNMT1-wt(野生型DNMT1的3′-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告基因下游的質(zhì)粒)、scramble與DNMT1-wt、miR-148a與DNMT1-mut(突變型DNMT1的3′-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告基因下游的質(zhì)粒)、scramble與DNMT1-mut，分別共轉(zhuǎn)染到MSCs細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞。按雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Promega，USA)的說明書操作，單光子檢測儀(Biorad，USA)用于檢測熒光素酶活性。其中相對熒光素酶活性的計(jì)算公式為螢火蟲熒光素酶活性值與海腎熒光素酶活性值的比值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 RNA提取和qRT-PCR檢測 每個(gè)6孔板中加入100 μl的TRIzol裂解液，室溫放置5 min后加入140 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上層液體到另一干凈的EP管中，每0.5 ml的異丙醇中加入1 ml 的Trizol試劑，混勻后于室溫放置10 min，離心去上清。1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，轉(zhuǎn)速7 500 r/min，4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μl無RNase雙蒸水溶解，取1 μl測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。將分裝的1 μl總RNA用于濃度測定，紫外可見分光光度計(jì)(Thermo，Nanodrop 2000)用于檢測A260/A280的比值，用1 μl 無酶水作空白校對測定，在檢測值小于3時(shí)，即可開始正常的樣本測定。在RNA樣本濃度檢測前需將樣本進(jìn)行充分混勻。當(dāng)A260/A280在1.8～2.0之間時(shí)表示RNA濃度合適，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

以提取的組織或細(xì)胞總RNA為模板，按TaqMan的miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies，UK)說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，按qSYBR-Green-containing PCR kit(Qiagen，USA)說明書進(jìn)行操作，檢測設(shè)備為BioRad IQTM5 Multicolor實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)(USA)。DNMT1、CD90、CD29、MHC、cTnT、心臟特異性同源盒基因(NK2 homeobox 5，Nkx2.5)和GATA結(jié)合因子4(GATA binding factor-4，Gata-4)的所有引物及內(nèi)參β-actin、miR-148a的引物及其內(nèi)參U6均由Invitrogen公司合成。2-ΔΔCt用于計(jì)算相對表達(dá)量，ΔΔCt=(Ct目的-Ct內(nèi)參)target-(Ct目的-Ct內(nèi)參)control。反應(yīng)體系為20 μl，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 Western blot 將實(shí)驗(yàn)共分兩組：miR-148a mimics(miR-148a)組及其陰性對照組(scramble)。將miR-148a mimics和scramble分別轉(zhuǎn)染至MSCs細(xì)胞中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后提取細(xì)胞蛋白，然后用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣本30 μg，進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上，隨后進(jìn)行5%的BSA封閉，1～2 h，室溫。分別加入1∶10 000的兔抗人DNMT1、MHC、cTnT、CD29、CD90和內(nèi)參β-actin抗體，4℃過夜。用TBST洗膜共3次，每次洗10 min，隨后進(jìn)行二抗的孵育，1∶10 000二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔)，室溫，1 h，隨后進(jìn)行TBST的洗膜，共3次，每次洗10 min。最后加入ECL發(fā)光劑，進(jìn)行發(fā)光，X片曝光、顯影和定影、掃描并保存條帶的圖片。

1.2.8 甲基化檢測 按照試劑商提供的基因組提取試劑盒zymo D3065說明書進(jìn)行操作，分別提取轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒的MSCs細(xì)胞在第1、7、14和28天的基因組，并用DNA甲基化修飾試劑盒GoldKit對基因組進(jìn)行修飾。提取的模板DNA在經(jīng)過亞硫酸鹽處理后，在發(fā)生甲基化的基因啟動子區(qū)域的CpG島的范圍內(nèi)，其中CpG位點(diǎn)5′端的胞嘧啶不會改變，而在未發(fā)生甲基化的CpG島中CpG位點(diǎn)的5′端胞嘧啶則轉(zhuǎn)變?yōu)榱四蜞奏?C-U互換)，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增的測序，結(jié)果可顯示Gata-4基因的上游DNA調(diào)控序列中CpG的甲基化水平，測序由北京優(yōu)博蘭基因公司完成。其中Gata-4的甲基化引物為Gata-4-M sense：5′-GTA-TAGTTTCGTAGTTTGCGTTTAGC-3′，antisense：5′-A-ACTCGCGACTCGAATCCCCG-3′。Gata-4的非甲基化引物為Gata-4-U sense：5′-TTTGTATAGTTTTGTAGTTTGTGTTTAGT-3′，antisense：5′-CCCAACTCACAACTCAAATCCCCA-3′。

1.2.9 miRNA芯片的制作、掃描及數(shù)據(jù)處理 按照實(shí)驗(yàn)方法1.2.6中所述分別提取5′-aza誘導(dǎo)分化前后的MSCs細(xì)胞總RNA，將樣品提供給公司，后續(xù)miRNA芯片的制作由北京睿博興科公司完成。芯片掃描采用LuxScan10 K/A雙通道激光掃描儀，將圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(GenePix Pro 4.0圖像分析軟件)。刪除壞點(diǎn)(基準(zhǔn)為信號值<1 000)，進(jìn)行片間校正，對所有的miRNA信號值取平均值。用Significance Analysis of Microarrays軟件(SAM，version 2.1)篩選出所有差異表達(dá)的miRNAs，最后采用Cluster3.0對所有差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 miRNA芯片篩選出5′-aza誘導(dǎo)MSCs向心肌分化后表達(dá)異常的miR-148a 利用miRNA芯片技術(shù)，選取5′-aza誘導(dǎo)分化前后的MSCs細(xì)胞，提取RNA后送測序公司進(jìn)行miRNA芯片雜交，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs出現(xiàn)了差異表達(dá)，包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等miRNAs(圖1)，其中經(jīng)5′-aza誘導(dǎo)向心肌分化后，miR-148a的表達(dá)明顯上調(diào)，選取miR-148a進(jìn)行下一步研究。

2.2 DNMT1是miR-148a直接調(diào)控的靶基因 通過Targetscan軟件分析，預(yù)測DNMT1是miR-148直接調(diào)控的靶基因(圖2A)。檢測熒光素酶活性，結(jié)果顯示：共轉(zhuǎn)染DNMT1-wt和miR-148a mimics時(shí)，熒光素酶活性強(qiáng)度下降了約52.3%(圖2B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染DNMT1-mut的miR-148a mimics與scramble之間的熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，即DNMT1是miR-148a直接調(diào)控的靶基因。

圖1 miRNA芯片篩選5′-aza誘導(dǎo)MSCs向心肌分化后差異表達(dá)的miRNAFig.1 miRNA chip screening of 5′-aza induces differenti-ation of MSCs into cardiomyocytes after differenti-ation of miRNANote：miRNA microarray screened out the abnormally expressed miRNAs in MSCs after 5′-aza-induced.The MSCs cells before induced was numbered 1, 2,3；MSCs cells myocardial differentiation after 5′-aza-induced was numbered 4,5,6.

分別轉(zhuǎn)染miR-148a mimics和scramble到MSCs細(xì)胞中，48 h后Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-148a后，DNMT1的mRNA水平顯著下調(diào)(圖2C，P<0.05)，轉(zhuǎn)染成功。Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-148a后MSCs中DNMT1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示DNMT1的蛋白水平下調(diào)(圖2D)。

2.3 miR-148a對Gata-4基因上游DNA調(diào)控序列的CpG甲基化水平的影響 為了檢測轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒質(zhì)粒的不同時(shí)間，MSCs細(xì)胞的Gata-4基因上游甲基化水平的變化。首先查詢數(shù)據(jù)庫得知，人類Gata-4基因上游共含有204個(gè)CpG島序列(其中豎線代表CpG位點(diǎn)，圖3A)。miR-148a慢病毒質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒感染MSCs細(xì)胞后，分別提取第1、7、14和28天的DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增及測序，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染的不同時(shí)間，Gata-4基因上游甲基化的水平發(fā)生了變化，并且轉(zhuǎn)染時(shí)間不斷增加時(shí)，Gata-4甲基化水平呈不斷降低趨勢(圖3B)。

圖2 DNMT1是miR-148a直接調(diào)控的靶基因Fig.2 DNMT1 is the target gene directly regulated by miR-148aNote：A.TargetScan software predicts that DNMT1 is the target gene of miR-148a;B.Luciferase reporter gene experiments confirmed that the 3′-UTR region of DNMT1 could bind to miR-148a,Co-transfection containing fluorescent reporter vectors of DNMT1-wt or DNMT1-mut,and when miR-148a mimics or scramble into MSCs cells.The luciferase activity was significantly reduced in Co-transfected miR-148a and DNMT1-wt (*.P<0.05 vs.scra-mble);C.mRNA expression level of DNMT1 in MSCs cells was detected by qRT-PCR.After transfection with miR-148a mimics, the mRNA level of DNMT1 was significantly decreased (*.P<0.05 vs.scramble);D.Expression of DNMT1 protein was detected by Western blot after transfection with miR-148a,compared with scramble transfection, the expression of DNMT1 protein was significantly decreased after transfection with miR-148a mimics.

2.4 miR-148a對心肌特異蛋白和分化特征蛋白及DNMT1表達(dá)的影響 為了檢測MSCs細(xì)胞的具體的向心肌分化程度，在轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒的不同的時(shí)間，使用qRT-PCR和Western blot分別檢測心肌特異蛋白MHC和cTnT,MSCs分化特征蛋白CD90和CD29以及DNMT1的表達(dá)改變。

隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，qRT-PCR結(jié)果顯示：MHC和cTnT的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，而CD90和CD29的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(圖4A，P<0.05)，DNMT1的mRNA表達(dá)也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(圖4B，P<0.05)。Western blot檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染后的7、14、28 d時(shí)，心肌特異蛋白MHC和cTnT的表達(dá)表現(xiàn)出不斷增加的趨勢，其中在28 d時(shí)表達(dá)量最大；而同時(shí)MSCs的分化特征蛋白CD90和CD29以及DNMT1的蛋白表達(dá)則表現(xiàn)為不斷減少的趨勢，且在28 d時(shí)呈現(xiàn)最小表達(dá)量(圖4C)。

圖3 miR-148a對MSCs細(xì)胞Gata-4基因上游甲基化水平的影響Fig.3 Effect of miR-148a on upstream methylation level of Gata-4 gene in MSCs cellsNote：A.Sketch map of Gata-4 gene and CpG island sequence upstream of Gata-4 gene.The rectangular box represents the outer part,wherein,the black box was the coding area,and the white box was non coding area. The vertical line represents the CpG site,CpG beneath the black arrows represent the Methylation specific PCR analysis region (MSP),sequencing analysis region (BS),real time fluorescence quantitative PCR analysis region (RT-PCR).B.In the different time of transfection of miR-148a lentivirus,the methylation level of Gata-4 upstream gene was changed,showing a decreasing trend,*.P<0.05 vs.vector.

圖4 miR-148a對心肌特異蛋白和分化特征蛋白及DNMT1表達(dá)的影響Fig.4 Effects of miR-148a on expression of myocardial specific proteins,differentiation proteins and DNMT1Note：A.qRT-PCR was used to detect the expression of MHC,cTnT of cardiac marker molecule and CD90,CD29 of MSCs differentiation molecule at different time of transfection of miR-148a lentivirus.Compared with the mRNA expression at the first day of transfection with miR-148a lentivirus,the expression of mRNA in MHC and cTnT increased gradually,but the expression of CD90 and CD29 decreased gradually (*.P< 0.05 vs.1 d);B.qRT-PCR was used to detect the changes of mRNA expression level in DNMT1 at different time of transfection of miR-148a lentivirus,the mRNA expression of DNMT1 showed a decreasing trend (*.P<0.05 vs.1 d)；C.Western blot was used to detect the expression of MHC and cTnT,CD90,CD29 of MSCs differentiation molecule and DNMT1 in different time,Comparison with the protein expression at the first day of transfection with miR-148a lentivirus,the expression level of MHC and cTnT was gradually increased,and the expression levels of CD90,CD29 and DNMT1 were decreased gradually compared.

圖5 miR-148a對心肌特異轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和Gata-4表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-148a on the expression of cardiac specific transcription factor Nkx2.5 and Gata-4Note：Transfection of miR-148a lentivirus into MSCs cells,The mRNA levels of Nkx2.5 and Gata-4 were significantly increased compared with the expression of mRNA at 1 d of transfection with miR-148a lentivirus.*.P<0.05 vs.1 d

即隨著轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒質(zhì)粒的時(shí)間增加，MSCs細(xì)胞內(nèi)心肌特異蛋白的表達(dá)水平會表現(xiàn)為不斷增加的趨勢，且MSCs的分化特征蛋白則表現(xiàn)為表達(dá)不斷降低的趨勢，MSCs細(xì)胞出現(xiàn)向心肌分化。

2.5 miR-148a對心肌特異轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和Gata-4表達(dá)的影響 通過qRT-PCR，檢測轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒的不同時(shí)間，心肌早期發(fā)育基因Nkx2.5和Gata-4的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，Nkx2.5和Gata-4的mRNA表達(dá)不斷增加(圖5，P<0.05)。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，經(jīng)誘導(dǎo)可定向分化為心肌樣細(xì)胞。目前普遍認(rèn)為誘導(dǎo)MSCs向心肌分化的主要誘因包括：細(xì)胞因子誘導(dǎo)、藥物誘導(dǎo)和基因調(diào)控等[12-14]。誘導(dǎo)劑5-氮胞苷(5′-aza)可通過下調(diào)甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1的表達(dá)，抑制DNA甲基化，從而誘導(dǎo)MSCs的向心肌分化[15]。MSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率會隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加而降低[16]。目前對DNMT1的活性研究多從基因水平入手，阻斷或抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量從而控制基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，使一些因超甲基化而沉默的基因重新激活，發(fā)揮其應(yīng)有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。研究表明，miRNAs誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率比轉(zhuǎn)錄因子要高20倍[17]。因此miRNAs是調(diào)節(jié)MSCs細(xì)胞向心肌分化的極有潛力的工具。研究報(bào)道，在肝癌[18]、膀胱癌[19]、胰腺癌[20]等癌癥中，miR-148a的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展，該過程與miR-148a引起DNMT1的甲基化狀態(tài)改變有關(guān)，而DNMT1在維持細(xì)胞DNA持續(xù)甲基化狀態(tài)，維持干細(xì)胞更新和分化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[21,22]，其對DNA甲基化的調(diào)控在間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程中起著至關(guān)重要的作用[23,24]。

因此，本研究從臨床骨髓穿刺檢查為正常的患者骨髓血中培養(yǎng)MSCs，通過藥物5′-aza誘導(dǎo)DNA的甲基化改變，隨后miRNA芯片篩選出5′-aza誘導(dǎo)MSCs向心肌分化后表達(dá)異常的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括miR-148a在內(nèi)的多個(gè)miRNAs在MSCs細(xì)胞心肌分化后，其差異表達(dá)特征十分顯著，且其中miR-148a的表達(dá)明顯上調(diào)，隨后通過生物信息學(xué)軟件分析及驗(yàn)證miR-148的潛在靶點(diǎn)為DNMT1。而本課題組前期研究結(jié)果顯示：沉默DNMT1基因表達(dá)可誘導(dǎo)大白鼠MSCs向心肌樣細(xì)胞分化，DNA甲基化分析顯示采用DNMT1 siRNA敲減DNMT1后，Gata-4基因上游DNA調(diào)控序列CpG甲基化水平明顯降低，Gata-4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，心肌相關(guān)基因MHC和cTnT表達(dá)上調(diào)，而骨髓干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和CD29則表達(dá)下調(diào)[9]。因此，隨后我們將繼續(xù)探究在人體中miR-148a是否也可以通過DNMT1調(diào)控MSCs向心肌分化。

由于在發(fā)育的不同時(shí)間點(diǎn)，相關(guān)基因的順序激活和表達(dá)是個(gè)體發(fā)育的生物學(xué)基礎(chǔ)，而基因的時(shí)序性激活很大程度上由基因的表達(dá)模式即基因的表觀遺傳修飾所決定。而在基因表達(dá)模式的信息標(biāo)記中，DNA甲基化起著十分重要的作用，其中CpG島甲基化(CpG methylation)是主要修飾方式[25]。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的活性是CpG島的甲基化狀態(tài)的主要調(diào)節(jié)酶，DNMT1是最主要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。正常發(fā)育的胚胎依賴DNMT1的作用以維持DNA甲基化狀態(tài)，組織或階段特異性基因可被CpG島的甲基化所關(guān)閉，CpG島的去甲基化則可以使這些基因活化，從而基因的表達(dá)呈現(xiàn)出時(shí)空性[26]。因此，MSCs向心肌分化過程中，DNMT1對DNA甲基化的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。在轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒質(zhì)粒的不同時(shí)間，檢測miR-148a對MSCs細(xì)胞的Gata-4基因上游甲基化水平和DNMT1表達(dá)水平的影響。我們驗(yàn)證miR-148a可抑制Gata-4基因上游DNA調(diào)控序列的CpG甲基化水平，miR-148也可抑制DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，我們猜想在人體中，miR-148可通過DNMT1抑制MSCs細(xì)胞的向心肌分化過程。隨后我們檢測了轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒質(zhì)粒的不同時(shí)間，心肌特異轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和Gata-4，心肌標(biāo)志分子MHC和cTnT，MSCs分化特征分子CD90和CD29的表達(dá)。結(jié)果證明miR-148的確可以通過抑制DNMT1的表達(dá)，進(jìn)而影響心肌特異轉(zhuǎn)錄因子、心肌標(biāo)志分子和MSCs分化特征分子的表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控MSCs向心肌分化的作用。

綜上所述，本課題以miR-148a為研究對象，驗(yàn)證其對DNMT1的調(diào)控作用并探索其在MSCs向心肌分化過程中發(fā)揮的作用以及作用機(jī)制。揭示了miRNAs在MSCs向心肌分化過程中的調(diào)控作用。將miRNAs用以調(diào)控MSCs的向心肌分化，提升MSCs向心肌分化效率[27]，有助于推進(jìn)實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞替代治療的臨床應(yīng)用，為心血管疾病的治療提供新的思路。

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[收稿2016-11-01 修回2016-11-17]

(編輯 倪 鵬)

Study on miR-148a regulation function of cardiac differentiation on MSCs by targeting DNMT1

LAIZhuo-Li,JIANGChang-Ke.

DepartmentofPediatrics,YongchuanHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160，China

Objective:To verify DNA methyltransferase 1(DNMT1) is the direct target of miR-148a and explore the internal mechanism by which miR-148a regulates the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells(MSCs)by directly targeting DNMT1.Methods：miRNA microarray was used to screen out the abnormally expressed miRNAs in MSCs before and after 5′-azacytidine(5′-aza) treatment.Target scan was uesd to predict the target of miR-148a.miR-148a mimics and DNMT1-wt,scramble and DNMT1-wt,miR-148a and DNMT1-mut,scramble and DNMT1-mut were co-transfected in MSCs cells and luciferase activity were detected by single photon.MSCs cells were transfected with miR-148a lentivirus plasmid.Respectively extract DNA,RNA and protein 1,7,14 and 28 days after transfection.The CpG methylation level on DNA regulatory sequences of Gata-4 upstream gene was detected by methylation detection,the mRNA and protein expressions of myosin heavy chain(MHC),cardiac troponin T(cTnT),CD90,CD29,Nkx2.5 and Gata-4 were detected by qRT-PCR and Western blot.Results：miRNA Microarray screened out the abnormally expressed miRNAs in MSCs before and after 5′-aza-induced,including miR-146a-5p,miR-148a,miR-539,etc.Among which miR-148a was remarkably upregulated.Targetscan,Luciferase Reporter Gene and qRT-PCR verified that DNMT1 was the direct target of miR-148a.By infected MSCs cells with miR-148a lentivirus plasmid,we confirmed that the methylation level of Gata-4 gene upstream was changed,and with prolong of transfection,the methylation level of Gata-4 was decreased,the expression of MHC and cTnT were increased,while CD90 and CD2 were continually decreased,the mRNA expression of Nkx2.5 and Gata-4 were increased MSCs cells started myocardial differentiation.Conclusion：miR-148a can regulate the cardiac differentiation of MSCs by directly targeting DNMT1.

miR-148a;DNMT1;Mesenchymal stem cells;Cardiac differentiation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.009

賴卓莉(1983年-)，女，住院醫(yī)師，主要從事干細(xì)胞分化方面的研究,E-mail:yyy567845@126.com。

及指導(dǎo)教師：蔣昌科(1979年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事干細(xì)胞分化方面的研究。

R329.2

A

1000-484X(2017)04-0520-08

①本文為2015年重慶市第八批應(yīng)用技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.cstc2015jcyjA10042)和2015年重慶市永川區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.Ycstc,2015nc5003)。