IFN-α通過IFI16抑制人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡①

黃 晶 宋 方 龍向淑 田茂波 吳 強(qiáng)

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽550002)

IFN-α通過IFI16抑制人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡①

黃 晶 宋 方 龍向淑 田茂波 吳 強(qiáng)

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽550002)

目的：探討干擾素-α(IFN-α)是否通過誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)表達(dá)抑制人腦血管外膜成纖維細(xì)胞(HBVAFs)增殖與促進(jìn)細(xì)胞凋亡。方法：應(yīng)用轉(zhuǎn)染針對IFI16基因的小干擾RNA(siRNA)和/或IFN-α瞬時(shí)干預(yù)體外培養(yǎng)的HBVAFs。通過蛋白免疫印跡(Western blot)法和Real-time PCR法測定細(xì)胞中IFI16、P53、P21蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化。用MTT法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期及凋亡。結(jié)果：與未干預(yù)組比較，IFN-α(2 000～5 000 kU/L)干預(yù)HBVAFs后，IFI16蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，但不同濃度IFN-α組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用2 000 kU/L IFN-α可誘導(dǎo)HBVAFs中P53及P21蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)抑制細(xì)胞增殖與促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但在轉(zhuǎn)染了IFI16 siRNA的HBVAFs中IFN-α的上述作用受到了抑制。結(jié)論：IFN-α抑制HBVAFs增殖與促進(jìn)其凋亡的作用可能部分與其誘導(dǎo)IFI16表達(dá)有關(guān)。

干擾素誘導(dǎo)蛋白；干擾素-α；血管外膜成纖維細(xì)胞；增殖；凋亡

作為動(dòng)脈管壁外膜最重要的細(xì)胞成分血管外膜成纖維細(xì)胞(Vascular adventital fibroblasts，VAFs)，其增殖、參與血管內(nèi)膜和中膜的形成、分泌胞外基質(zhì)及遷移等作用，參與了血管增殖性疾病(如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后及支架植入術(shù)后再狹窄等)主要的病理生理過程[1-3]。干擾素(Interferon，IFN)通過表達(dá)多種IFN誘導(dǎo)蛋白發(fā)揮抑制增殖、促進(jìn)凋亡、干預(yù)細(xì)胞分化等作用[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)IFN-α能抑制VAFs及血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)VAFs凋亡[5-7]；IFN-β不但能抑制細(xì)胞增殖還能抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[8]。干擾素誘導(dǎo)蛋白16(Interferon-inducible protein 16，IFI16)是IFN誘導(dǎo)蛋白p200家族的人源蛋白成員之一，研究發(fā)現(xiàn)IFI16參與了細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)IFN-α可通過誘導(dǎo)該蛋白家族成員p204(該蛋白結(jié)構(gòu)與IFI16相似)表達(dá)抑制大鼠主動(dòng)脈外膜VAFs增殖，促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡[10，11]。但I(xiàn)FN-α對VAFs增殖與凋亡的影響是否與其誘導(dǎo)IFI16表達(dá)有關(guān)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬觀察IFN-α對VAFs增殖與凋亡的影響及IFI16表達(dá)變化，為研究IFN及其誘導(dǎo)蛋白運(yùn)用于防治血管增殖性疾病提供更多理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦血管外膜成纖維細(xì)胞(Human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)細(xì)胞株(ScienCell公司)。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone公司)。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)。噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒(碧云天公司)。Real-time PCR熒光染料試劑(TaKaRa公司)。人β-actin引物上游：TGGCACCACACCTTCTACAATG，下游：TCATCTTCTCGCGGTT-GGC；人IFI16引物上游：GAAGTGCCAGCGTAAC-TCCTA，下游：TACCTCAAACACCCCATTCAC;人p53引物上游：CTCCTCAGCATCTTATCCGAG，下游：GCTGTTCCGTCCCAGTAGATTA，人p21引物上游ATGTGGACCTGTCACTGTCTTG，下游ATTAGGGCT-CCTCTTGGAGAA(上海生工生物公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑(Fermentas公司)。P53抗體、P21抗體(EPITOMICS公司)。IFI16 siRNA(h)、Control siRN-A-A、siRNA transfection medium、siRNA transfection reagent、IFI16抗體、β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 HBVAFs的培養(yǎng) 從液氮罐中取出HBVAFs細(xì)胞凍存管經(jīng)37℃水浴，再經(jīng)10倍體積DEME培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)漂洗。1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入1 ml上述培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞，加培養(yǎng)液至4 ml后，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后更換新培養(yǎng)液。采用復(fù)蘇后第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組 實(shí)驗(yàn)分為7組，正常培養(yǎng)為Negative組；用終濃度2 000～5 000 kU/L IFN-α分別干預(yù)24 h 后，即獲2 000、3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α組。在Negative組中轉(zhuǎn)染質(zhì)控siRNA和針對IFI16基因的siRNA 48 h后，用2 000 kU/L IFN-α處理24 h 后分別為Control siRNA組和IFI16 siRNA組。每實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA表達(dá) 按Trizol法提取總RNA后，42℃ 60 min，70℃ 5 min合成cDNA。Real-time PCR采用95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，重復(fù)循環(huán)40次。95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線。計(jì)算各組IFI16、P53、P21 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá) 通過細(xì)胞裂解液(RIPA)提取細(xì)胞蛋白。蛋白定量后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水5 min變性。濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶至NC膜。常溫下5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST洗膜；加入一抗工作液4℃過夜孵育(IFI16抗體稀釋度1∶500；P53、P21抗體稀釋度1∶1 000；β-actin抗體稀釋度1∶5 000)；TBST洗膜；37℃孵育二抗1 h；TBST洗膜；ECL化學(xué)發(fā)光；X光膠片顯影、定影后對膠片進(jìn)行掃描。BandScan 4.3軟件計(jì)算IFI16、P53、P21與β-actin吸光度比值。

1.2.5 MTT 檢測細(xì)胞增殖活力 收集對數(shù)增殖期細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)4×103個(gè)/孔接種于96孔板，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞增殖活性。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 按細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書測定DNA含量分析與凋亡。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)后對IFI16、P53和P21表達(dá)的影響 與Negative組比較，2 000、3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α組中IFI16蛋白及mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與2 000 kU/L，3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α組間IFI16蛋白及mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與2 000 kU/L IFN-α組比較，IFI16 siRNA組中IFI16、P53、P21蛋白及mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)。2 000 kU/L IFN-α組與Control siRNA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、2)。

圖1 干預(yù)后IFI16蛋白和mRNA水平在HBVAFs中的表達(dá)情況Fig.1 Effect of intervention factors on expression of IFI16 protein and mRNA in HBVAFsNote：1.Negative；2.2 000 kU/L IFN-α;3.3 000 kU/L IFN-α;4.4 000 kU/L IFN-α;5.5 000 kU/L IFN-α.*.P<0.05 vs negative.

圖2 干預(yù)后IFI16、P53、P21蛋白和mRNA水平在HBVAFs中的表達(dá)情況Fig.2 Effect of intervention factors on the expression of IFI16，P53,P21 protein and mRNA in HBVAFsNote：*.P<0.05 vs negative；#.P<0.05 vs 2 000 kU/L IFN-α.

圖3 干預(yù)后對HBVAFs細(xì)胞增殖與凋亡影響Fig.3 Effect of intervention factors on cell proliferation and apoptosis of HBVAFsNote：*.P<0.05 vs negative，#.P<0.05 vs 2 000 kU/L IFN-α.

2.2 IFN-α對細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與Negative組比較，2 000 kU/L IFN-α組MTT吸光度A值減低(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞與凋亡細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少 (P<0.05)。與2 000 kU/L IFN-α組比較，IFI16 siRNA組MTT吸光度A值增加(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞與凋亡細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)增多 (P<0.05)。2 000 kU/L IFN-α組與Control siRNA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

3 討論

血管壁內(nèi)、中、外膜主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞與VAFs組成。長期以來均將前兩者視為血管增殖性疾病病理改變的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，VAFs僅作為“旁觀者”起著營養(yǎng)與支持的作用[1]。然而隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在血管損傷后血管重構(gòu)過程中，VAFs增殖活性、合成細(xì)胞外基質(zhì)以及轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞能力明顯增強(qiáng)[12,13]。因此VAFs在血管增殖性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程并非旁觀者而是像“哨兵”一樣起著關(guān)鍵的作用[3]，故促進(jìn)VAFs增殖及其凋亡是防治上述疾病的措施之一。

IFN分為Ⅰ型(IFN-α、β、τ等)、Ⅱ型(IFN-γ)與Ⅲ型(IFN-λ)，是一組具有多種生物學(xué)效應(yīng)(如抗增殖、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗病毒等)的活性細(xì)胞因子家族。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)IFN-α能抑制血管壁細(xì)胞增殖[5-7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈球囊損傷后通過在損傷局部轉(zhuǎn)染過表達(dá)IFN-β或腸外給予IFN-γ能抑制新生內(nèi)膜的形成與血管平滑肌細(xì)胞增殖[14,15]，提示在血管增殖性疾病的治療過程中運(yùn)用IFN是可行的。本研究結(jié)果也同樣顯示IFN-α能抑制HBVAFs增殖與促進(jìn)其凋亡。

IFI16蛋白作為IFN誘導(dǎo)蛋白p200家族成員在上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、部分腫瘤細(xì)胞等胞核與胞質(zhì)中存在表達(dá)[16,17]，并能被IFN-α、β、γ等誘導(dǎo)表達(dá)[17]。IFI16蛋白氨基端有參與蛋白與蛋白相互作用的PYD構(gòu)域與核定位序列(Nuclear localization sequences，NLS)，二者通過與凋亡、炎性反應(yīng)信號通路相關(guān)蛋白之間的相互結(jié)合參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化及炎癥反應(yīng)調(diào)控等過程[16]。本研究通過Westem blot表明，IFI16蛋白在HBVAFs中存在基礎(chǔ)表達(dá)，并且IFN-α干預(yù)HBVAFs 24h后能誘導(dǎo)IFI16蛋白表達(dá)，但在2 000～5 000 kU/L濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)IFI16表達(dá)未呈現(xiàn)劑量依賴性。因此推測在HBVAFs中IFI16可能是發(fā)揮IFN-α多種生物學(xué)功能的重要下游蛋白之一。抑癌基因p53能夠通過下游基因p21抑制細(xì)胞周期進(jìn)程促進(jìn)細(xì)胞凋亡與老化[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，IFI16蛋白通過p53、p21通路抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖,但在感染人乳頭狀瘤病毒而永生化的HUVEC 中，由于致癌基因E6和E7抑制p53的活性，導(dǎo)致IFI16抑制增殖的作用受到明顯限制[19]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，在人胚胎腎細(xì)胞293中轉(zhuǎn)染IFI16基因后，IFI16蛋白200A結(jié)構(gòu)域中的MFHATVATIF基序與p53羥基端結(jié)合，增加p53的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖[20]。而在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)IFI16蛋白表達(dá)能通過活化p53的bax啟動(dòng)子激活p53的表達(dá)，并增加其下游目的基因p21表達(dá)，從而激活p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與增殖抑制[21]。大量的研究說明IFI16在調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡過程中與p53/p21等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白存在密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，在2 000 kU/L IFN-α干預(yù)HBVAFs后更多的細(xì)胞停滯在G0/G1期，凋亡細(xì)胞數(shù)亦有所增加。IFN-α在誘導(dǎo)IFI16表達(dá)增加的同時(shí)P53與P21的表達(dá)也上調(diào)了。然后沉默IFI16基因后IFN-α誘導(dǎo)的上述作用受到了限制。無論誘導(dǎo)IFI16過表達(dá)還是抑制IFI16表達(dá)，P53與P21蛋白及mRNA表達(dá)水平均與其呈一致性變化趨勢，這表明IFI16在抑制VAFs增殖與促進(jìn)凋亡過程中可能與誘導(dǎo)P53和P21表達(dá)有關(guān)。提示IFN-α抑制HBVAFs增殖，促進(jìn)其凋亡過程中，P53/P21可能作為IFI16的下游蛋白而發(fā)揮其作用。

綜上所述，IFN-α能促進(jìn)IFI16、P53、P21表達(dá)，抑制VAFs增殖，誘導(dǎo)其凋亡，推測IFI16可能參與了IFN-α對VAFs增殖、凋亡的調(diào)控，P53/P21途徑可能參與該生物學(xué)效應(yīng)的下游調(diào)控。從而為IFN及其誘導(dǎo)蛋白應(yīng)用于血管增殖性疾病提供更多的理論依據(jù)。

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[收稿2016-05-16 修回2016-06-24]

(編輯 許四平)

Interferon alpha suppresses proliferation and induces apoptosis of human brain vascular adventitial fibroblasts via IFI16

HUANGJing，SONGFang,LONGXiang-Shu,TIANMao-Bo,WUQiang.

DepartmentofCardiology,GuiyangProvincePeople′sHospital,Guiyang550002，China

Objective:To study interferon alpha (IFN-α) inhibition of proliferation and apoptosis induction of human brain vascular adventitial fibroblasts(HBVAFs)via IFI16.Methods：Cultured HBVAFs were treated with transfection IFI16 siRNA and/or IFN-α in vitro instantaneously.The protein and mRNA levels of IFI16，P53，P21 were measured by Western blot and Real-time PCR.MTT was used to detect the cell proliferation of the HBVAFs.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.Results：IFN-α with terminal concentration of 2 000-5 000 kU/L induce significantly expression of IFI16 in HBVAFs,without any significant difference.Stimulated with 2 000 kU/L IFN-α up-regulated the expression of P53,P21 at protein and mRNA levels，and inhibited the cell proliferation and promote cells apoptosis in HBVAFs.Such effect was restrained by transfection with IFI16 siRNA into HBVAFs.Conclusion：IFN-α inhibits HBVAFs proliferation and induces apoptosis may partly relate to the increased IFI16 expression.

Interferon-inducible protein；IFN-α；Vascular adventitial fibroblasts；Proliferation；Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.003

①本文為國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 81260030)。

黃 晶(1988年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病基礎(chǔ)與臨床方面的研究，E-mail：herenwushui@sohu.com。

及指導(dǎo)教師：吳 強(qiáng)(1969年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事冠心病基礎(chǔ)與臨床方面的研究，E-mail：gzgywq@126.com。

R363

A

1000-484X(2017)04-0494-04