急性淋巴細(xì)胞白血病患者FGFR3表達對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響*

吳靜怡， 周劍峰， 裴仁治△， 張丕勝， 劉旭輝， 杜小紅

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院血液科， 浙江 寧波 315000； 2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院同濟醫(yī)院血液科， 湖北 武漢 430030)

急性淋巴細(xì)胞白血病患者FGFR3表達對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響*

吳靜怡1， 周劍峰2， 裴仁治1△， 張丕勝1， 劉旭輝1， 杜小紅1

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院血液科， 浙江 寧波 315000；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院同濟醫(yī)院血液科， 湖北 武漢 430030)

目的： 了解急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)表達對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)增殖的影響。方法: 通過RT-PCR法檢測44例ALL患者骨髓中FGFR3 mRNA表達，分成FGFR3+組及FGFR3-組進行Kaplan-Meier生存分析。利用免疫磁珠結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分離計數(shù)CECs，對比兩組CECs數(shù)量、表面抗原表達、生長曲線及集落生成數(shù)的差異。免疫熒光組化染色測定CECs表面FGFR3表達水平。結(jié)果: 44例核型正常ALL患者中FGFR3 mRNA表達陽性率為43.2%，T-ALL組的FGFR3表達高于B-ALL組(P<0.05)。19 d骨髓原始細(xì)胞比例≥5%的患者FGFR3表達升高(P<0.05)。FGFR3陽性組的總生存率明顯低于陰性組(P<0.05)。分離出的CECs高表達CD31、CD144、VEGFR-2和CD146，基本不表達CD45。與FGFR3陰性組相比，陽性組CECs數(shù)量、CD133的陽性率及集落生成數(shù)均增多(P<0.05)。體外培養(yǎng)中，F(xiàn)GFR3陽性組與陰性組相比，生長曲線3個時點上的細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。19例ALL-FGFR3+患者CECs表面均能檢測到FGFR3表達，陽性率為29.00%±15.71%。結(jié)論: 致癌基因FGFR3對ALL患者CECs的增殖有促進作用，可能具備了抗腫瘤及抗血管生成的雙重靶點身份，可以為今后的分子治療提供更多的選擇。

急性淋巴細(xì)胞白血?。?成纖維細(xì)胞生長因子受體3； 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞

成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFR)屬于酪氨酸激酶家族，參與細(xì)胞的生長、分化及遷移[1]。最新的研究顯示其抑制劑不僅作用腫瘤細(xì)胞，對于腫瘤微環(huán)境也同樣有效[2]。FGFR3是其成員之一，與腫瘤轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)浸潤關(guān)系密切[3]，在慢性粒細(xì)胞白血病、惡性漿細(xì)胞瘤和多發(fā)性骨髓瘤中都有過表達[4]。Chesi 等[5]發(fā)現(xiàn)約25%多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生t (4; 14) (p16.3; q32.3) 易位，導(dǎo)致FGFR3基因過度表達而致瘤。本研究旨在探討急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocy-tic leukemia，ALL)中FGFR3對循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，揭示其在疾病預(yù)后判斷中的意義及作為治療靶點的潛在價值。

材 料 和 方 法

1 研究對象

2008年12月至2016年3月期間我院初診的ALL患者44例，男性28例，女性16例，中位年齡32歲(14～78歲)。診斷均采用MICM分型確診。所有ALL患者均經(jīng)融合基因及染色體分析判斷為核型正常，采取CALLG2008方案進行治療，療效標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》評價[6]。對所有患者進行隨訪。

2 試劑和儀器

人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所；TRIzol試劑和Oligo(dT)16購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；PCR試劑盒購自Fermentas；PCR引物均由上海博亞公司合成。內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(EGM-2 MV Single Quots)和胰蛋白酶為Becton Dickinson產(chǎn)品； FGFR3鼠抗人單抗購自Santa Cruz；VEGFR-2鼠抗人單抗購自R&D； CD31鼠抗人單抗購自上海長島；羊抗鼠FITC標(biāo)記的 II 抗購自Sigma；PE標(biāo)記的CD144鼠抗人單抗購自Beckman Coulter； FITC標(biāo)記的CD133、FITC標(biāo)記CD45和PE標(biāo)記的CD146鼠抗人單抗均購自BD；CD146磁珠溶液購自Miltenyi Biotec。PCR儀為Biometra T3000型；FACSCantoTMII型流式細(xì)胞儀購自BD。

3 實驗方法

3.1 FGFR3 mRNA表達的檢測 取骨髓血5 mL用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，TRIzol一步法抽取總RNA，按Promega試劑盒說明書操作步驟合成cDNA鏈。利用Oligo 6.0軟件自行設(shè)計引物。FGFR3的上游引物為5’-GTGACGCACAGCCCCACATCC-3’，下游引物為5’-GGCCCGAGACAGCTCC CATTT-3’，擴增片段長度為549 bp；內(nèi)參照GAPDH的上游引物為5’-AGCGAGATCCCTCCAAA-3’，下游引物為5’-TTCCACGATACCAAAGTTGT-3’，擴增片段長度為281 bp。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取10 μL擴增產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后溴化乙啶染色，凝膠成像掃描系統(tǒng)分析照相，根據(jù)特異條帶的有無分別記為陽性和陰性。具體方法詳見文獻[7]。

3.2 CECs的分離及計數(shù) 靜脈血(EDTA抗凝)5 mL用PBS 1∶1稀釋，加入紅細(xì)胞裂解液靜置10 min，洗滌后棄去上清，與FCR阻斷劑置于4 ℃30 min，與CD146磁珠溶液室溫孵育25 min，洗滌后上柱分選CD146陽性的細(xì)胞，富集的細(xì)胞調(diào)整體積至300 μL，均分成樣品管(T2)及空白對照管(T1)，兩管中均加入FIFC標(biāo)記的CD45單克隆抗體20 μL，T2管中加入PE標(biāo)記的CD146單克隆抗體20 μL，T1管中加入20 μL同型對照，調(diào)整溶液體積至200 μL。4 ℃保存至上機檢測。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD146+CD45-PI+的有核細(xì)胞。具體方法詳見文獻[8]。

3.3 細(xì)胞表面抗原的免疫熒光檢測 得到的細(xì)胞懸液制成細(xì)胞滴片及爬片，PBS沖洗后，用4%多聚甲醛在室溫下固定30 min，用小牛血清封閉30 min去除非特異性標(biāo)記，加工作濃度的 I 抗及FITC標(biāo)記的 II 抗，嚴(yán)格按照說明步驟進行，結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)200個細(xì)胞。

3.4 細(xì)胞生長曲線的繪制 取生長良好CECs，增長至接近匯合時向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%的胰酶消化后，加入完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液計數(shù)。向24孔板的每孔中接種等量細(xì)胞， 于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。將細(xì)胞分成4組，每組3孔，培養(yǎng)7 d。從培養(yǎng)第3天開始計數(shù)，每24 h分別取3個孔計數(shù)，取平均值，以時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制FGFR3-組、FGFR3-+ 酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)組(在培養(yǎng)基中加入濃度為50 μg/L的aFGF)及FGFR3+組CECs的生長曲線。

3.5 細(xì)胞集落形成率測定 取接近融合細(xì)胞，洗滌消化后制成細(xì)胞懸液，按2×104/L的密度接種到6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌后加甲醛5 mL固定細(xì)胞15 min，加適量姬姆薩液染色30 min，計數(shù)孔中集落數(shù)，以含50個以上細(xì)胞團為1個集落。每次培養(yǎng)6個孔，取平均值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 16.0進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。FGFR3 mRNA表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系均采用卡方檢驗及精確檢驗法。生存分析采用Kaplan-Meier法，總生存率(overall survival，OS)時間定義為從患者自確診之日起至死亡或末次隨訪日期。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FGFR3表達水平與臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性

44例核型正常ALL患者中FGFR3 mRNA表達陽性為19例(43.2%)，2組患者臨床特征比較詳見表1，T-ALL組的FGFR3表達高于B-ALL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。19 d骨髓原始細(xì)胞比例≥5%的患者FGFR3表達升高(P<0.05)。FGFR3表達與患者的性別、年齡、外周血白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、肝脾腫大及有無髓外浸潤等無明顯相關(guān)性。

2組患者生存曲線如圖1所示，F(xiàn)GFR3+組的OS[(34.19±5.09)%]明顯低于FGFR3-組[(50.79±4.98)%](P<0.05)。

2 FGFR3表達陽性及陰性患者CECs數(shù)量及表面抗原的比較

FGFR3+組CECs數(shù)量中位數(shù)為1.18×105/L，F(xiàn)GFR3-組CECs數(shù)量中位數(shù)為6.2×104/L，兩者相比有顯著性差異(P<0.05)。

ALL患者的CECs均高表達血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD31、CD144、VEGFR-2和CD146，基本不表達白細(xì)胞共同抗原CD45，可被鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞。而CD133是內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)志物[9]。與FGFR3-組相比，F(xiàn)GFR3+組CECs表達CD133的陽性率明顯升高(P<0.05)；而CECs表面血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、CD144、VEGFR-2和CD146的表達在2組間并無明顯變化,見表2。

表1 FGFR3 mRNA表達與各臨床指標(biāo)的關(guān)系

Table 1.The relationship between FGFR3 expression and clinicopathologic features in the 44 ALL patients

ClinicalcharactersnFGFR3expressionPositiveNegativePvalueSex Male2811170.196 Female1688Age(year) ≥50209110.234 <50241014WBC(×109/L) ≥509540.207 <50351421PLT(×109/L) ≥403112190.172 <401376Blastsinbonemarrowon19day(%) ≥58620.046 <5361323FABclassification L116790.576 L219811 L3945Immunophenotyping B-ALL3713240.018 T-ALL761hepato-and/orsplenomegaly Yes3315180.243 No1147Extramedullaryinfiltration Yes211 No4218240.502

Figure 1.Comparison of the survival curves between FGFR3+group and FGFR3-group.

圖1 FGFR3+與FGFR3-患者生存曲線的比較

表2 FGFR3+與FGFR3-患者CECs表面標(biāo)志物的變化

*P<0.05vsFGFR3-group.

3 FGFR3+組和FGFR3-組生長曲線的比較

FGFR3+組的細(xì)胞數(shù)在生長曲線的3個時點上均較FGFR3-組增多(P<0.05)，增殖能力有明顯差異。FGFR3-+aFGF組與FGFR3+組相比無顯著差異,見圖2。

Figure 2.Comparison of the growth curves of CECs. Mean±SD.*P<0.05vsFGFR3-group.

圖2 CECs生長曲線的比較

4 FGFR表達水平與CECs集落形成能力的關(guān)系

FGFR3+組中，體外培養(yǎng)CECs進行集落形成實驗15例，集落形成數(shù)目為FGFR3-組的3倍，兩者相比有顯著差異(P<0.05),見圖3。

Figure 3.Comparison of the colony formation of CECs between FGFR3+group and FGFR3-group.*P<0.05vsFGFR3-group.

圖3 FGFR3陽性組與陰性組患者CECs集落形成能力的比較

5 FGFR3蛋白在ALL-FGFR3+患者CECs上的表達

19例ALL-FGFR3+患者的CECs表面均可以檢測到不同程度的FGFR3蛋白表達，其陽性率為29.00%±15.71%，范圍為18%～47%，見圖4。

Figure 4.CECs from ALL-FGFR3+patients expressed FGFR3invitro(×200).

圖4 ALL-FGFR3+患者體外培養(yǎng)的CECs表面FGFR3陽性表達

討 論

在核型正常44例ALL中，T-ALL、19 d骨髓原始細(xì)胞≥5%的患者FGFR3表達升高，而這些臨床指標(biāo)均提示預(yù)后不良，說明FGFR3的高表達與ALL的進展和侵襲有關(guān)。隨訪中發(fā)現(xiàn)FGFR3陽性組OS明顯下降，進一步提示FGFR3 是預(yù)后不良的一個指標(biāo)。這些結(jié)果與文獻報道一致，F(xiàn)GFR3作為致癌基因與血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如將高表達FGFR3的骨髓細(xì)胞植入經(jīng)致死性照射的小鼠體內(nèi)，所有移植后的小鼠都出現(xiàn)了惡性的血液表型包括淋巴細(xì)胞和髓系的惡性表型[10]。

為進一步研究FGFR3 對腫瘤血管增殖的影響，實驗中利用免疫磁珠富集CECs,巧妙銜接流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞，有效避免了紅細(xì)胞碎片、血小板及白細(xì)胞的污染。分離的細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣的典型血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)[11]，同時高表達CECs的表面抗原CD31、CD144和VEGFR-2[12]。

接下來對CECs生物學(xué)性狀分析顯示，F(xiàn)GFR3陽性組CECs數(shù)量明顯高于陰性組，CD133陽性的細(xì)胞比例升高，體外培養(yǎng)中，其CECs的倍增速度明顯高于FGFR3陰性組。這些特征提示了CECs組成的復(fù)雜性，其中有群細(xì)胞是骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，它們倍增時間短，增殖能力強，而FGFR3表達的升高伴隨著這群細(xì)胞數(shù)量的增多。集落形成實驗的結(jié)果也驗證了這一點，F(xiàn)GFR3+組CECs的集落能力顯著高于FGFR3-組。研究認(rèn)為僅僅干細(xì)胞有形成集落的能力，那么這種增殖能力的獲得很可能源于FGFR3的過表達。

FGFR3在FGFR3+患者的CECs上同樣表達陽性，進一步提示FGFR3促進腫瘤增殖的作用可能同樣表現(xiàn)在CECs上，對CECs增殖產(chǎn)生積極的影響。這在國內(nèi)外是首次發(fā)現(xiàn)，而最新的研究顯示FGFR3的過表達在肝細(xì)胞腫瘤中有促進腫瘤及腫瘤血管增殖的雙重作用[13]。

FGFR3 與配體結(jié)合后激活MAPK 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷徙和抑制細(xì)胞凋亡，類似Ras 途徑。但是目前關(guān)于FGFR3影響血管增殖的具體機制尚不清楚，有證據(jù)表明FGFR3 過度表達或突變能致腫瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，促進腫瘤血管的生成[14]，因此推測FGFR3作為一個腫瘤相關(guān)基因有促進ALL血管增殖的作用，其可能具備了抗腫瘤及抗血管生成的雙重靶點身份，可以為今后的分子治療提供更多的選擇。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression of FGFR3 in acute lymphoblastic leukemia patients and its contribution to proliferation of circulating endothelial cells

WU Jing-yi1, ZHOU Jian-feng2, PEI Ren-zhi1, ZHANG Pi-sheng1, LIU Xu-hui1, DU Xiao-hong1

(1DepartmentofHematology,YinzhouHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNingboUniversity,Ningbo315000,China;2DepartmentofHematology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:peirz@163.com)

AIM: To evaluate the expression of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) in acute lymphocytic leukemia (ALL) patients and its contribution to the proliferation of circulating endothelial cells (CECs). METHODS: The mRNA expression levels of FGFR3 in 44 patients with ALL were assayed by RT-PCR. Overall survival (OS) rates of the patients in FGFR3+group and FGFR3-group were estimated by Kaplan-Meier analysis. The CECs were sorted from peripheral blood by magnetic-activated cell sorting and then counted by 3-color flow cytometry. The cell counts, antigen expression, growth curve and colony forming rate of the CECs in the 2 groups were determined. The FGFR3 expression of CECs was identified by immunofluorescence staining. RESULTS: The positive rate of FGFR3 mRNA expression was 43.2% in 44 ALL patients with normal karyotype. T-ALL expressed higher level of FGFR3 than B-ALL (P<0.05). FGFR3 was over-expressed in ALL patients with bone marrow blast proportion ≥5% (P<0.05). The probability of OS was significantly lower in FGFR3+group than that in FGFR3-group (P<0.05). The sorted CECs highly expressed CD31, CD144, VEGFR-2 and CD146, and rarely expressed CD45. The counts of CECs and expression level of CD133 significantly increased in FGFR3+group compared with FGFR3-group. The same result of the amount of colony formation was observed (P<0.05). There was significant difference at 3 time points of cultured CECs countinvitrobetween FGFR3+group and FGFR3-group (P<0.05). The positive rate of FGFR3 expression of CECs from 19 ALL-FGFR3+patients was (29.00±15.71)%. CONCLUSION: The over-expression ofFGFR3 gene in ALL may be helpful to evaluate the prolife-ration of CECs, and become a double target with anti-tumor and anti-angiogenesis effects to offer more choice for molecular therapy in the future.

Acute lymphocytic leukemia; Fibroblast growth factor receptor 3; Circulating endothelial cells

1000- 4718(2017)04- 0694- 05

2016- 09- 12

2016- 12- 05

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No. LQ12H08001)； 浙江省衛(wèi)生廳一般研究項目資助(No. 201235256)； 寧波市自然科學(xué)基金資助項目(No. 2012A610236)； 寧波市醫(yī)學(xué)科技計劃資助項目(No.2011B23)

R730.23； R733.71

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.019

△通訊作者 Tel： 0574- 87016871； E-mail: peirz@163.com