黃精多糖的提取及其免疫活性研究

卜紅南

藥學(xué)

黃精多糖的提取及其免疫活性研究

卜紅南

目的研究黃精多糖的提取工藝及其免疫活性。方法以料液比、粉碎粒度、提取時間為考察因素，以多糖的得率作為指標，響應(yīng)面優(yōu)化黃精多糖的提取工藝；并通過建立免疫抑制小鼠模型，對該組分多糖的免疫調(diào)節(jié)作用進行研究。結(jié)果影響黃精多糖提取的主要因素為粉碎粒度，最佳提取工藝為：料液比1∶20，提取時間2 h，粒度為0.6 cm2，黃精多糖得率為11.142%。免疫結(jié)果顯示，黃精多糖能顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)、巨噬細胞吞噬指數(shù)。結(jié)論該工藝切實可行，可為黃精多糖的利用提供參考。

黃精多糖；響應(yīng)面優(yōu)化法；免疫活性

黃精為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygouatum）植物多花黃精、滇黃精、卷葉黃精等的干燥根莖。歸脾、肺、腎經(jīng)。具有補氣養(yǎng)陰、健脾潤肺、益腎等功效［1，2］，對于抗炎癥，抗腫瘤等的發(fā)生有很好的作用［3-5］?！度杖A子本草》中提到黃精“補五勞七傷，助筋骨，生肌，耐寒暑，益脾胃，潤心肺?！?/p>

目前國內(nèi)外研究黃精多糖的提取分離方法包括熱水提取、醇析分離、微波輔助提取、超聲波提取等［6-8］，但耗能高、提取率較低。本研究采用水提醇沉法，以黃精多糖的得率為考察指標，通過響應(yīng)面優(yōu)化黃精多糖的提取工藝，并通過免疫抑制小鼠模型，對該組分多糖的免疫調(diào)節(jié)作用進行研究，結(jié)果提取工藝的優(yōu)化能夠提高黃精多糖的得率，且黃精多糖能提高小鼠的免疫功能，對黃精臨床用藥起到指導(dǎo)性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料及儀器黃精（河北省安國市華仁藥材有限公司，由山東中醫(yī)藥大學(xué)韓春超教授鑒定為黃精屬植物卷葉黃精的干燥根莖）；無水葡萄糖對照品（HPLC≥98%）（中國食品藥品檢定研究院）；濃硫酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；瑞氏染色液（青島海博生物技術(shù)有限公司）；生理鹽水；試劑均為分析純；水為蒸餾水。紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；分析天平（千分之一，上海天平儀器廠）；分析天平（萬分之一，上海菁海儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；高速離心機（上海醫(yī)療器械集團有限公司手術(shù)器械廠）。

1.1.2 實驗動物及細胞小鼠，5~10周齡，每只（25±5）g，雌雄各半，由山東中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。雞紅細胞懸液；由山東中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 黃精多糖提取工藝的研究（1）黃精多糖的提取及供試品溶液的制備。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化黃精多糖的提取工藝，按照最佳提取工藝：稱取黃精藥材，粉碎，篩取粒度為0.5 cm2的藥材粉末，加入15倍量水，回流提取3次，1.5 h/次，濾液濃縮至相當(dāng)于原藥材的1 g，用乙醇使含醇量達到50%進行醇沉，冷藏過夜，取上清液，3000 r/ min離心10min棄去沉淀，減壓濃縮后加入3倍體積的無水乙醇，沉淀即為黃精多糖，40℃烘干保存，稱取一定量的黃精多糖蒸餾水定容至0.572 g/m l，作為黃精多糖供試液。（2）苯酚-硫酸法測定黃精多糖含量。稱取10mg的無水葡萄糖，蒸餾水定容至100m l，分別精密移取100μg/m l的葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml置于10m l具塞刻度試管中，加蒸餾水至2.0 ml，加入1.0m l 5%的苯酚溶液混勻，再加入5.0ml 98%的濃硫酸，混合均勻，室溫下顯色20min，以蒸餾水為空白，在490 nm波長處測定吸光度（A）。以吸光度A（Y）為縱坐標，葡萄糖的濃度（X）為橫坐標進行回歸處理得標準曲線。（3）單因素試驗方法。稱取等量的黃精原材料100g，分別研究不同的料液比、提取時間、粒度對黃精多糖提取率的影響，從這4個方面設(shè)計單因素試驗。料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h；粉碎粒度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 cm2。用苯酚-硫酸比色法測定黃精多糖的含量。（4）黃精多糖提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。在單因素試驗的基礎(chǔ)上選用料液比、提取時間、粉碎粒度4個因素，采用響應(yīng)面優(yōu)化黃精多糖提取的工藝條件。實驗因素水平選擇如表1所示。

表1 實驗因素水平及編碼

1.2.2 黃精多糖免疫活性的研究（1）雞紅細胞懸液制備。抽取新鮮的雞血于燒杯中，慢慢倒入離心管中，加入生理鹽水搖勻，以1000 rpm，離心20min，反復(fù)洗滌3次，配制成3%的雞紅細胞懸液制備，4℃下保存?zhèn)溆?。?）黃精多糖供試品溶液對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響。取小鼠24只，隨機分成4組，每組6只，雌雄各半，以步驟1.2.1中配制的黃精多糖供試液為藥物，隨機分為對照組、低劑量中藥組（5 g/kg·d）、中劑量中藥組（10 g/kg·d）和高劑量中藥組（15 g/kg·d），各劑量組小鼠通過灌胃的方式給藥，早晚各一次，持續(xù)20 d，對照組灌以同劑量的蒸餾水。各小鼠正常進食，第19天分別腹腔注射新鮮淀粉牛肉湯1ml/只，輕柔腹部48 h后，腹腔注射3%雞紅細胞生理鹽水懸浮液1m l/只，30min后處死，取腹腔炎性滲出液抹片，瑞氏染色，鏡檢。計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)［6］。吞噬百分率=具有吞噬活性的吞噬細胞/100個吞噬細胞。吞噬指數(shù)=具有吞噬活性的吞噬細胞吞噬雞紅細胞數(shù)/100個吞噬細胞中具有吞噬活性的吞噬細胞。（3）黃精多糖供試品溶液對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響。另取小鼠24只，隨機分成4組，每組6只，雌雄各半，隨機分為對照組、低劑量中藥組（5 g/kg·d）、中劑量中藥組（10 g/kg·d）和高劑量中藥組（15 g/kg·d），各劑量組小鼠通過灌胃的方式給藥，早晚各一次，給藥20 d，給藥結(jié)束后，脫臼處死，稱重法［7］測定小鼠的脾臟指數(shù)，使用電子天平稱量小鼠體質(zhì)量及脾臟（剔除器官的結(jié)蹄組織與脂肪組織）的重量，計算得出結(jié)果（胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)所述方法繪制標準曲線以吸光度Y為縱坐標，葡萄糖的濃度X為橫坐標進行回歸處理，得回歸方程為Y=7.1405X+0.1959，R2=0.9993結(jié)果表明葡萄糖在5.0~50μg/m l范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 黃精多糖的提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 料液比對黃精多糖提取率的影響分別選用料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，粉碎粒度為0.6 cm2，提取時間1 h，提取2次的條件下對黃精多糖進行提取。結(jié)果表明，隨著料液比的增加黃精多糖提取率也逐漸升高，當(dāng)料液比為1∶15時提取率最高，隨后提取率有所下降，見圖1。

圖1 料液比對黃精多糖提取影響

2.2.2 提取時間對黃精多糖提取率的影響分別選用提取時間0.5、1、1.5、2、2.5，料液比為1∶15，粉碎粒度為0.6 cm2，提取次數(shù)為2次的條件下對黃精多糖進行提取。結(jié)果表明提取時間為1.5 h時提取率最高，隨后有所下降，見圖2。

圖2 提取時間對黃精多糖提取率的影響

2.2.3 粉碎粒度對黃精多糖提取率的影響分別選用粉碎粒度為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 cm2，料液比為1∶15，提取時間1.5 h，提取2次的條件下對黃精多糖進行提取。結(jié)果表明粉碎粒度為0.5 cm2時黃精多糖的提取率最高，根據(jù)單因素工藝考察得到黃精多糖的最佳提取工藝是黃精粉碎粒度為0.5 cm2，料液比為1∶15，提取時間為1.5 h。見圖3。

圖3 粉碎粒度對黃精多糖提取率的影響

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化黃精多糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化法將復(fù)雜的未知的函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的一次或二次多項式模型來擬合［6-12］，本文采用Design-Expert（version8.0.5）對表2試驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，建立了各因素與黃精多糖提取率之間的二次響應(yīng)面回歸模型Y=-219.4100+ 123.88750X1-0.17980X2-0.90550X3-0.05000X1X2+ 1.10000X1X3+0.19100X2X3－120.10000X12+1.66000E-003X22-0.38400X32，其各因素的方差分析結(jié)果見表3?；貧w方程中各因素與響應(yīng)值黃精多糖得率影響的顯著性，由F檢驗來進行判定，并且概率的值越小，則其相應(yīng)變量的顯著性就越高。

由表3可知，模型的P<0.0001，失擬項P>0.01，表明該模型二次方程擬合顯著。表明所建立的回歸二次模型成立，從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知：X1、X2、X3、X12對滴丸成型率影響極顯著。

響應(yīng)曲面的分析圖是特定的響應(yīng)值對相應(yīng)自變量所構(gòu)成的一個三維空間圖，由此可以直觀的反應(yīng)各因素變量對響應(yīng)值的影響。在實驗考察中，各因素變量對黃精多糖提取率影響的、二維等高線和三維響應(yīng)曲面圖見圖4～圖6。圖4為粉碎粒度和料液比對多糖提取率影響的二維等高線、三維響應(yīng)曲面，由此圖可見，隨著料液比的變大多糖提取率升高，但粉碎粒度比例增大，出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，考慮是粉碎過細導(dǎo)致藥材過濾出現(xiàn)不同程度損失。圖5為提取時間和粉碎粒度對多糖得率影響的二維等高線、三維響應(yīng)曲面，由此圖可見隨著提取時間增長多糖增大。圖6料液比和提取時間對多糖得率影響的二維等高線、三維響應(yīng)曲面，由圖可見，料液比和提取時間對多糖得率都呈現(xiàn)正相關(guān)。

表2 響應(yīng)面分析法Box-Behnken組合設(shè)計試驗及結(jié)果

表3 黃精多糖提取率的方差分析結(jié)果

圖4 粉碎粒度和料液比對多糖提取率影響的二維等高線、三維響應(yīng)曲面

圖5 提取時間和粉碎粒度對多糖得率影響的二維等高線、三維響應(yīng)曲面

圖6 料液比和提取時間對多糖得率影響的二維等高線、三維響應(yīng)曲面

2.2.5 模型驗證優(yōu)化后黃精多糖的提取工藝為：料液比1∶20，提取時間2 h，粒度為0.6 cm2，在該條件下黃精多糖提取率為11.142%，為了驗證模型的真實性，稱取150 g黃精藥材3份，粉碎，過篩，按照優(yōu)化后的提取工藝料液比1∶20，提取時間2 h，粒度為0.6 cm2進行實驗，黃精多糖得率分別為11.09%、11.30%、11.28%。優(yōu)化工藝模型成立。

2.2.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結(jié)果

根據(jù)實驗方法和計算公式，得出各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能。結(jié)果如表4所示，黃精多糖供試品各劑量均可顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，說明黃精多糖能顯著增強免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。

表4 各組小鼠巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)（n=6）

2.2.7 黃精供試品對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響結(jié)果根據(jù)實驗方法和計算結(jié)果得出，小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)隨著黃精供試品的劑量增大而增大，并呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系。見表5。

表5 小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

目前水提法已經(jīng)成為提取黃精多糖的主要方法，根據(jù)中藥成分在水和乙醇中的溶解性不同，去除蛋白質(zhì)、糊化淀粉、脂溶性色素等雜質(zhì)［14，15］，本文使用50%醇進行醇沉，即保證不會由于醇濃度過高導(dǎo)致有效成分被包裹而造成損失，又可以充分去除淀粉等雜質(zhì)，起到純化多糖的作用，其工藝成本低，損耗小，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

相較于陳鋼等［16］關(guān)于響應(yīng)面優(yōu)化黃精多糖提取工藝，本文考察因素更為具體，分析各因素結(jié)果及其之間的交互作用，并確定了影響黃精多糖提取的最大影響因素是粒度；相較于傅圣斌［17］關(guān)于黃精多糖的研究，本文的提取工藝耗能低，操作簡單，適合于工業(yè)大生產(chǎn)，且提取的黃精多糖免疫活性較強。本實驗采用Design-Expert（version8.0.5）優(yōu)化黃精多糖得率的考察，在單因素實驗基礎(chǔ)上確定了3個因素對黃精多糖提取的優(yōu)化條件為：料液比1∶20，提取時間2 h，粒度為0.5 cm2，在該條件下黃精多糖提取率為11.142%，但是目前考察因素較少，仍需進一步考察，比如提取溫度、提取次數(shù)等因素，本文研究僅僅是在微沸的狀態(tài)下提取3次進行其他因素的考察，后續(xù)研究仍在繼續(xù)。

多糖是黃精最主要的有效成分，免疫活性是多糖最主要和最重要的生物活性。本文通過雞紅細胞試驗和小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)試驗綜合考察黃精多糖免疫活性，結(jié)果表明黃精多糖具有明顯的免疫增強作用，且藥效與劑量存在相關(guān)性。為黃精進一步開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］雷震，楊光義，葉方，等.黃精多糖藥理作用及臨床應(yīng)用研究概述［J］.中國藥師，2012，1（1）：114-116.

［2］劉洋洋，安瑩瑩，秦文娟，等.黃精多糖藥理作用研究進展［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，9（8）：967-970.

［3］傅圣斌，錢建鴻，陳樂意，等.黃精多糖的提取及其對小鼠免疫活性的影響［J］.中國食品學(xué)報，2013，1（1）：68-72.

［4］姜曉昆，魏尊喜.多花黃精中多糖的免疫活性研究［J］.中國社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學(xué)專業(yè)，2011，18（11）：5，7.

［5］沈建利，劉利萍，錢建鴻.黃精多糖對免疫抑制小鼠的免疫功能的影響［J］.藥物評價研究，2012，5（4）：328-331.

［6］王冬梅，宋旭輝，李娟麗，等.卷葉黃精多糖提取分離工藝研究［J］.西北農(nóng)林學(xué)院學(xué)報，2006，21（6）：158-161.

［7］高紅莉，曲曉蘭，蘇延友.泰山黃精多糖的超聲提取及含量測定［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)，2006，27（2）：151-152.

［8］曲曉蘭，高紅莉，蘇延友.微波輔助提取黃精多糖的研究［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，27（2）：165-166.

［9］林建原，季麗紅.響應(yīng)面優(yōu)化銀杏葉中黃酮的提取工藝［J］.中國食品學(xué)報，2013，2（1）：83-90.

［10］侯學(xué)敏，李林霞，張直峰，等.響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2013，6（1）：124-128.

［11］李珍，哈益明，李安，等.響應(yīng)面優(yōu)化蘋果皮渣多酚超聲提取工藝研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，21（11）：4569-4577.

［12］胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等.響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖提取條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，7（5）：124-126，130.

［13］王永菲，王成國.響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用［J］.中央民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，3（2）：236-240.

［14］張黎明，朱麗，李雪，等.玉屏風(fēng)總多糖水提醇沉工藝條件優(yōu)化［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，1（1）：24-26.

［15］韓桂茹，徐韌柳，馮麗，等.水提醇沉對中藥各類有效成分的影響［J］.中國中藥雜志，1993，5（3）：286-287.

［16］陳鋼，陳紅蘭，蘇偉，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化黃精多糖提取工藝參數(shù)［J］.食品科學(xué)，2007，7（5）：198-201.

［17］傅圣斌，錢建鴻，陳樂意，等.黃精多糖的提取及其對小鼠免疫活性的影響［J］.中國食品學(xué)報，2013，1（1）：68-72.

［2016－07－16收稿，2016－08－14修回］［本文編輯：劉一洋］

Study on the extraction process and immune activity of polygonatum polysaccharide

BU Hong-nan.
Department of Gynecology and Obstetrics，No.89 Hospital of PLA，Weifang，Shandong 261021，China

Objective To study the process of extracting polygonatum polysaccharides（PSP）and its immune activity.M ethods On the basis of prelim inary experiment，independent variables included solid-liquid ratio，grinding particle size，extraction time，the yield of polysaccharide from polygonatum was dependent variable；extraction process of polygonatum polysaccharide was optimized by Response surface methodology.By using immune suppressed mouse model the immunomodulatory effects of polysaccharide component were investigated. Resu lts The extracting time had the most significant effect on the extracting rate of PSP，and the optimum extraction process was as following：adding 20 times amount of water into crude medical material，extracting 2 h each time，then 0.6 cm2particle size.The extracting rate of PSP was 11.22%.Immunization results showed sibiricum can significantly improve the thymus index of mice，spleen index，phagocytic index.Conclusion Above-mentioned process is practical，which can provide reference for the utilization of Rhizoma Polygonati polysaccharide.

Polygonatum polysaccharide；Response surface methodology；Immune activity

R931.71

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.019

261021山東濰坊，解放軍89醫(yī)院婦產(chǎn)科（卜紅南）