非小細(xì)胞肺癌化療藥物耐藥性及其與ERCC1、RRM1表達(dá)的相關(guān)性＊

張強(qiáng)，翟西菊，魏麗，王新立，李新霞，姚迎迎

臨床醫(yī)學(xué)

非小細(xì)胞肺癌化療藥物耐藥性及其與ERCC1、RRM1表達(dá)的相關(guān)性＊

張強(qiáng)，翟西菊，魏麗，王新立，李新霞，姚迎迎

目的探討原代培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，及其與非小細(xì)胞肺癌組織中ERCC1、RRM1基因表達(dá)的關(guān)系。方法取手術(shù)切除的新鮮非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本，制備成活細(xì)胞濃度為（2～3）×105/ m l的單細(xì)胞懸液，分別加入10倍血漿峰值藥物濃度順鉑（CDDP）、吉西他濱（GEM）、培美曲塞、依托泊苷（VP-16）。用MTT法檢測(cè)經(jīng)上述藥物作用后腫瘤細(xì)胞活力及代謝活性的變化；同時(shí)取非小細(xì)胞肺癌組織制成石蠟切片，用免疫組化檢測(cè)ERCC1、RRM1蛋白的表達(dá)。結(jié)果（1）ERCC1和RRM1在80例NSCLC組織中的表達(dá)均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.05）。（2）ERCC1的陽(yáng)性表達(dá)與順鉑的耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；RRM1的陽(yáng)性表達(dá)與吉西他濱的耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論ERCC1、RRM 1蛋白可能成為NSCLC患者化療耐藥的預(yù)測(cè)因子，二者聯(lián)合檢測(cè)有助于NSCLC患者個(gè)體化治療方案的選擇。

非小細(xì)胞肺癌；ERCC1；RRM 1；化療耐藥性；基因表達(dá)

肺癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的重要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在我國(guó)約占肺癌總數(shù)的85%。手術(shù)切除及術(shù)后輔以放化療是NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但治療效果卻欠佳，NSCLC患者的化療有效率僅為30%～40%，生存時(shí)間提高有限［1-3］，患者中位生存期約為1年［4，5］。其最主要原因是腫瘤耐藥及經(jīng)驗(yàn)用藥，所以基于化療藥物敏感性試驗(yàn)的個(gè)體化化療成為治療趨勢(shì)。通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)，在化療實(shí)施前篩選出有效的化療藥物，可以避免腫瘤耐藥及經(jīng)驗(yàn)用藥等問(wèn)題，對(duì)于實(shí)現(xiàn)腫瘤化療的合理化、個(gè)體化有實(shí)用價(jià)值。

人切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross-complementing gene 1，ERCC1）定位于染色體19q13.2～19q13.3，是NER系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因。ERCC1缺陷將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA修復(fù)障礙［6］。RRM1是核苷酸還原酶（RR）調(diào)節(jié)M1亞單位。它能使二磷酸核苷酸轉(zhuǎn)化為二磷酸脫氧核苷酸，后者是DNA合成和修復(fù)過(guò)程中必不可少的原料，因此，RR是DNA合成和修復(fù)的限速酶［7］。該文從臨床實(shí)際出發(fā)，采用MTT比色法檢測(cè)NSCLC一線化療方案中常用的4種藥物的敏感性，探討NSCLC原代細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性；用免疫組化法檢測(cè)ERCC1、RRM1在NSCLC組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其表達(dá)與化療藥物耐藥性的相關(guān)性，為NSCLC的臨床化療提供個(gè)體化用藥的實(shí)驗(yàn)資料和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月—2015年12月在泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)的80例NSCLC標(biāo)本。術(shù)前均未接受放化療。其中男42例，女38例；年齡39～76歲，中位年齡54歲。

1.2 方法

1.2.1 MTT藥物敏感試驗(yàn)［8］取外科手術(shù)切除的新鮮NSCLC組織80例。所取組織無(wú)壞死、變性，經(jīng)酸性離子水反復(fù)沖洗后置于添加有100 IU/m l青霉素和100μg/m l鏈霉素的Hank的平衡鹽溶液中。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌剪刀剪碎腫瘤組織，放入37℃含有鏈霉蛋白酶（XXV，Sigma Chemical，St. Louis，MO）、膠原酶（I，Sigma）和DNA裂解酶I（I，Sigma）的無(wú)菌液中輕輕攪拌消化20 min后，添加足夠有效量的培養(yǎng)液。細(xì)胞通過(guò)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，以1000 r/min離心10min，棄上清，用10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸。計(jì)數(shù)，調(diào)整活細(xì)胞濃度至（2～3）×105個(gè)/m l。試驗(yàn)組：取單細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，分別加入藥物終濃度為10倍血漿峰值濃度［9］的順鉑、吉西他濱、培美曲塞、VP-16，每組藥物設(shè)5個(gè)復(fù)孔；置于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入0.5%MTT（5mg/ ml）20μl，4 h后終止培養(yǎng)。每孔加入0.04N鹽酸異丙醇100μl，充分溶解所生成的結(jié)晶物，靜止10min，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)在570 nm波長(zhǎng)光密度值（OD值）。取5復(fù)孔OD值的平均值作為腫瘤細(xì)胞在此藥物組的平均OD值。）對(duì)照組每孔加入分離純化后的單細(xì)胞懸液100μl，不加藥物；空白組每孔加入100μl培養(yǎng)液；腫瘤細(xì)胞抑制率＝（對(duì)照組OD值－用藥組平均OD值）/（對(duì)照孔平均OD值-空白組OD值）× 100%。腫瘤細(xì)胞抑制率≥30%為敏感，<30%為耐藥。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)NSCLC組織及癌旁組織經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，常規(guī)石蠟包埋，免疫組化采用SP法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ERCC1主要在胞核和胞質(zhì)中表達(dá)，RRM1主要在胞質(zhì)中表達(dá)，陽(yáng)性呈棕黃色顆粒。結(jié)果判定采用雙盲法，運(yùn)用Lecia Qwin Plus軟件進(jìn)行分析，定位準(zhǔn)確的棕黃色顆粒面積>5%為陽(yáng)性，<5%為陰性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率計(jì)算法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果ERCC1主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，RRM1定位于細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。見(jiàn)圖1～4。ERCC1和RRM1在80例NSCLC組織中的表達(dá)均高于癌旁組織（42 vs 22，40 vs 21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均為0.000）。

圖1 ERCC1在NSCLC中細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)（SP法×200）

圖2 ERCC1在癌旁組織中細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)（SP法×200）

圖3 RRM 1在NSCLC中細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)（SP法×200）

圖4 RRM 1在癌旁組織中細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)（SP法×200）

2.2 NSCLC組織中ERCC1、RRM 1與表達(dá)結(jié)果與M TT藥敏的關(guān)系將MTT檢測(cè)結(jié)果中抑制率≥30%者判為敏感，而<30%者判為耐藥。ERCC1的陽(yáng)性表達(dá)與順鉑的體外耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.010，P<0.05）；與吉西他濱、培美曲塞及VP-16與的體外耐藥性無(wú)關(guān)（P>0.05）；RRM1的陽(yáng)性表達(dá)與吉西他濱的體外耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.010，P< 0.05；與順鉑、培美曲塞及VP-16與的體外耐藥性無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

在世界范圍內(nèi)，肺癌是死亡率最高的疾病之一。晚期非小細(xì)胞肺癌患者的一線化療方案是鉑類(lèi)聯(lián)合三代新藥如紫杉類(lèi)、吉西他濱、培美曲塞、長(zhǎng)春新堿、伊立替康等［10，11］。然而，晚期非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率仍低于15%。研究表明非小細(xì)胞肺癌患者治療效果不理想的原因之一是腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物的耐藥性。

表1 NSCLC組織中ERCC1、RRM 1與表達(dá)結(jié)果與MTT藥敏的關(guān)系

ERCC1定位于19號(hào)染色體上，是核苷酸剪切修復(fù)家族中的重要成員之一，是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)（NER）的關(guān)鍵酶，其與XPF形成異源二聚體，在受損DNA單鏈的5’端進(jìn)行剪切而發(fā)揮功能。鉑類(lèi)化療藥物的作用機(jī)制是：鉑類(lèi)作為一種重金屬?gòu)?fù)合物與腫瘤細(xì)胞的DNA雙鏈形成加合物導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞死亡，從而起到抗腫瘤作用。當(dāng)ERCC1在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)并激活NER通路后，使停滯在G2/M期細(xì)胞的損傷DNA得到迅速修復(fù)，從而導(dǎo)致腫瘤對(duì)鉑類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性［12，13］。筆者分析了80例非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤細(xì)胞和癌旁組織中ERCC1表達(dá)，研究表明ERCC1的陽(yáng)性表達(dá)與順鉑的耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），體外試驗(yàn)的結(jié)果顯示ERCC1的陽(yáng)性表達(dá)與順鉑的體外耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.010），與Cho等的研究是一致的［12］。

RRM1是核苷酸還原酶調(diào)節(jié)M1亞單位，是DNA合成與修復(fù)通路中的限速酶，也是核苷類(lèi)似物系化療藥物吉西他濱的結(jié)合位點(diǎn)，后者通過(guò)抑制核苷酸還原酶的活性起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。Rosell等［1］采用定量PCR方法檢測(cè)了75例NSCLC組織標(biāo)本中RRM1 mRNA表達(dá)，在接受了吉西他濱/順鉑聯(lián)合化療組發(fā)現(xiàn)RRM1 mRNA低表達(dá)的患者對(duì)化療的反應(yīng)較好，患者從治療開(kāi)始至腫瘤病灶出現(xiàn)進(jìn)展的時(shí)間與RRM1 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。Ceppi等［14，15］研究表明NSCLC組織中RRM1高表達(dá)的患者對(duì)吉西他濱耐藥。其作用機(jī)制可能是RRM1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)二磷酸核苷酸成為二磷酸脫氧核苷酸，促進(jìn)核苷類(lèi)似物系化療藥物引起的DNA損傷修復(fù)，從而產(chǎn)生耐藥。該研究顯示RRM1的陽(yáng)性表達(dá)與吉西他濱的體外耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.010）；與順鉑、培美曲塞及VP-16與的體外耐藥性無(wú)關(guān)（P>0.05），與上述結(jié)論一致。

最近國(guó)內(nèi)外許多研究表明，藥敏試驗(yàn)可以作為研究腫瘤化療療效的有效方法，腫瘤細(xì)胞的體外化療藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)化療療效的符合率達(dá)80%以上，且試驗(yàn)結(jié)果為陰性者，幾乎可以肯定為體內(nèi)臨床用藥的耐藥病例［9，16］。因此，通過(guò)體外MTT藥敏試驗(yàn)對(duì)NSCLC不同個(gè)體進(jìn)行化療藥物篩選是克服NSCLC耐藥性和提高患者生存率的有效途徑之一。

綜上所述，ERCC1、RRM1的表達(dá)水平可預(yù)測(cè)NSCLC患者的化療藥物耐藥性，在化療前聯(lián)合檢測(cè)ERCC1、RRM1可為NSCLC的臨床化療提供個(gè)體化用藥的方案和依據(jù)。

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［2016－07－08收稿，2016－08－06修回］［本文編輯：董冰媛］

Drug-resistance of NSCLC to chemotherapy，and its relativity w ith ERCC 1 and RRM 1 expression

ZHANG Qiang①，ZHAI Xi-jü，WEI Li，et al.
①The Affiliated Hospital to Taishan Medical College，Tai'an，Shandong 271000，China

Objective To evaluate the drug-resistance of NSCLC to chemotherapy and to explore the relationship between ERCC1 or RRM1 expression and the resistance.M ethods NSCLC fresh specimens from surgically resected tisssues were sampled.A single-cell suspension of tumor cells（2×105to 3×105cells/m l）were separately exposed to cisp latin（CDDP），gemcitabine（GEM），pemetrexed，Etoposide（VP-16）at ten times peak plasm concentration（PPC）.Inhibitory rate of cells was detected by MTT assay.Expression of ERCC1 and RRM1 in NSCLC tissues were detected by immunohistochemistry（IHC）.Results 1）The positivity of ERCC1 and RRM1 was significantly hyper-expressed in NSCLC compared with control adjacent tissue（P<0.05）.2）The positive expression of ERCC1 stained cells showed resistance to cisplatin（P<0.05）；The positive expression of RRM1 stained cells showed resistance to GEM（P<0.05）.Conclusion ERCC1，RRM1 protein may be taken as predictors of the NSCLC patients with drug-resistance to the chemotherapy，the joint detection helps NSCLC patients to choice individualized treatment plan.

NSCLC（non-small cell lung cancer）；ERCC1；RRM1；Drug-resistance to chemotherapy；Gene expression

R734.2

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.004

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013WS0322）

271000山東泰安，泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（張強(qiáng)，魏麗，王新立，李新霞，姚迎迎）；泰安市腫瘤醫(yī)院（翟西菊）