響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝孢子粉多糖提取工藝的研究

馮嫣，馬文婷

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000）

響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝孢子粉多糖提取工藝的研究

馮嫣，馬文婷

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000）

以靈芝孢子粉多糖為研究對象，通過單因素試驗(yàn)考察液料比、提取溫度、提取時(shí)間3個因素對提取率的影響，確定提取靈芝孢子粉多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)，并運(yùn)用響應(yīng)面法對3個因素進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的提取工藝，并確定該工藝條件的可靠性和高效性。結(jié)果表明：單因素試驗(yàn)確定提取靈芝孢子粉多糖的最優(yōu)工藝為液料比20∶1（mL/g）、提取溫度80℃、提取時(shí)間2 h，在此條件下靈芝孢子粉多糖提取率為4.78%；運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，確定最佳工藝條件為：液料比21.27∶1（mL/g）、提取溫度80.10℃、提取時(shí)間2.10h，在此條件下預(yù)測多糖提取率為4.84%；對模型進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)測結(jié)果為4.81%，與擬合方程預(yù)測值符合良好。

靈芝孢子；多糖；響應(yīng)面

近年來，隨著生活水平的日益提高，人們對于健康的關(guān)注也越來越高。靈芝屬于一種大型擔(dān)子真菌，被我國歷代民族醫(yī)藥視為股本扶正的瑞草，而靈芝孢子作為靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，它富含蛋白質(zhì)（18.53%）及多種氨基酸（總量為6.1%），還含有豐富的多糖、萜類、生物堿、維生素等成分，其藥理作用主要有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血脂以及對神經(jīng)、心血管和呼吸系統(tǒng)有調(diào)節(jié)改善的作用。

隨著近年來對靈芝研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖是靈芝的主要活性物質(zhì)之一，其重要性不言而喻。靈芝孢子多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、降血糖作用、抗輻射作用、抗氧化作用以及促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成的作用，是一種對人體十分有用的生物活性物質(zhì)。靈芝多糖主要分布于靈芝孢子中，在比較栽培靈芝與靈芝孢子粉的有效成分含量結(jié)果表明，靈芝孢子粉的總多糖數(shù)是栽培靈芝總多糖的1.79倍。大量研究報(bào)告顯示：靈芝多糖已經(jīng)成為衡量靈芝產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。

本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法確定水提法提取靈芝孢子多糖的最優(yōu)工藝，為靈芝包子多糖的規(guī)?；崛√峁├碚撘罁?jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，為靈芝孢子多糖產(chǎn)品的市場化打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

靈芝孢子粉：市售。

1.1.2 試劑

苯酚、三氯乙酸、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸（以上試劑均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器和設(shè)備

L400-P3型抽濾器：上海領(lǐng)德儀器有限公司；HWS-26型恒溫水浴鍋：品相科儀（上海）有限公司；SHA-C型振蕩器：城西富威實(shí)驗(yàn)儀器廠；Eppendorf 5810型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；752-C型紫外分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器有限公司；FA分析天平：上海方瑞儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

樣品烘干→稱取→乙醇浸泡→抽濾→加水提取→抽濾→濃縮→醇沉→離心分離→沉淀物加水稀釋→丙酮乙醚清洗→樣品烘干→測定多糖含量

1.2.2 多糖提取方法

將靈芝孢子粉在50℃下烘干至恒重，待用。取已烘干的靈芝粉5 g，用95%乙醇浸泡24 h，脫去其中的脂類和低聚糖。將浸泡后的靈芝孢子粉進(jìn)行真空抽濾，得濾渣。按照液料比，向?yàn)V渣中加入適當(dāng)?shù)乃谠O(shè)定好溫度的恒溫水浴箱中放置一定時(shí)間，進(jìn)行提取。提取結(jié)束后，將其真空抽濾，得濾液，并濃縮至原體積的1/4。濃縮物用95%乙醇在4℃下醇沉12 h。用離心機(jī)在6 000 r/min狀態(tài)下離心15min，取沉淀物，加水50mL溶解稀釋，在將沉淀物用丙酮乙醚反復(fù)清洗，烘干，取1mL進(jìn)行多糖含量測定。

1.2.3 多糖含量測定方法

采用苯酚-硫酸法[24-26]。

配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照苯酚-硫酸法測定靈芝孢子多糖，計(jì)算靈芝孢子多糖提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 不同液料比對多糖提取率的影響

分別選取液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1.5 h，按照1.2.1工藝流程和1.2.2多糖提取方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同液料比對多糖提取率的影響。

1.2.4.2 不同提取溫度對多糖提取率的影響

分別選取提取溫度為60、70、80、90、100℃，固定前面試驗(yàn)得出的液料比，提取時(shí)間為1.5 h，按照1.2.1工藝流程和1.2.2多糖提取方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同提取溫度對多糖提取率的影響。

1.2.4.3 不同提取時(shí)間對多糖提取率的影響

分別選取提取時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3 h，固定前面試驗(yàn)得出的液料比和提取溫度，按照1.2.1工藝流程和1.2.2多糖提取方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同提取時(shí)間對多糖提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，確定液料比、提取溫度、提取時(shí)間3個因素的零水平，運(yùn)用Minitab 16數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，運(yùn)用三因素三水平響應(yīng)面分析法，對水解條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素與編碼見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平表Table1 Factor levelof orthogonal test

1.2.6 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用1.2.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所得結(jié)果重復(fù)試驗(yàn)，并將最后結(jié)果與預(yù)測值進(jìn)行比較。

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同液料比對多糖提取率的影響

分別選取液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），在提取溫度為80℃、提取時(shí)間為1.5 h的條件下進(jìn)行多糖提取，并計(jì)算提取率，考察不同液料比對多糖提取率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同液料比對多糖提取率的影響Fig.1 Effectof liqui-solidd ratio on polysaccharides extraction rate

由圖1可知，當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，靈芝孢子粉多糖提取率最高，達(dá)到4.3%。液料比為10∶1（mL/ g）時(shí)，靈芝孢子粉提取率最低，隨著水比例的增大，提取率也隨之增加，并于20∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到峰值。之后繼續(xù)增加水的比例，提取率趨于平穩(wěn)，并略有下降。加水比例越大，靈芝孢子粉中的多糖越易溶出，因此提取率越高。但是加水比例過大時(shí)，會給后續(xù)的濃縮過程帶來不便，耗時(shí)耗能，因此不利于后續(xù)的醇沉。故選擇液料比為20∶1（mL/g）。

2.1.2 不同提取溫度對多糖提取率的影響

分別選取提取溫度為60、70、80、90、100℃，在液料比為20∶1（mL/g）、提取時(shí)間為1.5 h的條件下進(jìn)行多糖提取，并計(jì)算提取率，考察不同提取溫度對多糖提取率的影響。結(jié)果如圖2。

圖2 不同提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effectof temperatureon polysaccharidesextraction rate

由圖2可知，當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，靈芝孢子粉多糖提取率最高，達(dá)到4.3%。提取溫度為60℃時(shí)，靈芝孢子粉提取率最低，隨著提取溫度的增大，提取率明顯增加，于80℃時(shí)達(dá)到峰值。之后隨著提取溫度的增加，提取率趨于平穩(wěn)，并略有下降。提取溫度越高，多糖分子的活動越劇烈，多糖更易溶出，因此隨提取溫度的上升，提取率也隨之升高。80℃后，隨著提取溫度的增加，提取液的蒸發(fā)損耗增大，同時(shí)高溫可能會破壞糖分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和生物活性，因此提取率穩(wěn)中略降。綜上，本試驗(yàn)選擇提取溫度為80℃。

2.1.3 不同提取時(shí)間對多糖提取率的影響

分別選取提取時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3 h，在液料比為20∶1（mL/g）、提取溫度為80℃的條件下進(jìn)行多糖提取，并計(jì)算提取率，考察不同提取時(shí)間對多糖提取率的影響。結(jié)果如圖3。

圖3 不同提取時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.3 Effectof tim eon polysaccharidesextraction rate

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間2 h時(shí)，靈芝孢子粉多糖提取率最高，達(dá)到4.78%。提取時(shí)間為1 h時(shí)，靈芝孢子粉提取率最低，隨著提取時(shí)間的增加，提取率明顯增加，于2 h時(shí)達(dá)到峰值。之后隨著提取溫度的增加，提取率趨于平穩(wěn)，并略有下降。提取時(shí)間越長，多糖溶量越大，當(dāng)提取2 h后，多糖提取率不再增加，說明提取液中的多糖分子達(dá)到平衡。同時(shí)過長的浸泡時(shí)間可能會導(dǎo)致多糖分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致提取率降低。因此選擇提取時(shí)間為2 h。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

運(yùn)用Minitab 16數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，并進(jìn)行方差分析，響應(yīng)面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table2 Experim ent results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Continue table2 Experim ent results

通過回歸分析，得到靈芝孢子粉多糖提取率與液料比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型：

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表見表3。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table3 Tableof coefficientsof regression equation

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表（表3）可知，模型的二次項(xiàng)X1X2對響應(yīng)值具有顯著影響，其他項(xiàng)對響應(yīng)值具有極顯著影響，表明各因素對多糖提取率的影響具有線性關(guān)系。

回歸模型方差分析表見表4。

表4 回歸模型方差分析表Table4 Tableof varianceanalysisof regressionm odel

對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表4）顯示模型的P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.181 9＞0.01，不顯著；模型的調(diào)整R2=0.935 3，該模型能夠解釋93.53%的響應(yīng)值變化，說明該模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小，能夠用該模型來對靈芝孢子粉多糖的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)上述模型，每兩個因素對提取率畫出響應(yīng)面曲線和等高線，結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 液料比和提取溫度對提取率影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.4 Response surface curvesand contour linesof the influenceof liquidmaterial ratio and extraction tem peratureon extraction rate

響應(yīng)面和等高線圖等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱和大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示交互作用顯著。

分析比較3個圖可知，液料比（X1）對提取率影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而提取時(shí)間（X3）和提取溫度（X2）次之。三因素之間交互作用均顯著。

通過軟件分析，水提法提取靈芝孢子粉多糖的最佳工藝條件為：液料比21.27∶1（mL/g）、提取溫度80.10℃、提取時(shí)間2.10 h，在此條件下預(yù)測多糖提取率為4.84%，工藝參數(shù)基本接近本研究中單因素試驗(yàn)所選取的數(shù)值。

2.2.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件靈芝孢子多糖提取試驗(yàn)，在此條件下實(shí)際提取率為4.81%，與理論值比較誤差為0.62%，相對誤差較小。因此，基于單因素試驗(yàn)的響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，方法可行可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖5 液料比和提取時(shí)間對提取率影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.5 Response surface curvesand contour linesof the influenceof liquidmaterial ratio and extraction timeon extraction rate

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對提取率影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.6 Effectof temperatureand extraction tim eon theextraction rateof responsesurface curvesand contour lines

3 結(jié)論

國內(nèi)關(guān)于植物多糖提取的研究較為充分，但對于以靈芝孢子粉多糖為提取對象的研究還不夠系統(tǒng)。本試驗(yàn)運(yùn)用水提法提取靈芝孢子粉多糖，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化確定水提醇沉法提取靈芝孢子粉多糖的最優(yōu)工藝條件，顯著提高靈芝孢子粉多糖的提取率，并確定該方法的高效性。具體結(jié)論如下：

1）通過單因素試驗(yàn)確定水提法提取靈芝孢子粉多糖的最佳提取條件為：液料比20∶1（mL/g）、提取溫度80℃、提取時(shí)間2 h。在此條件下，靈芝孢子粉多糖提取率為4.78%。

2）運(yùn)用響應(yīng)面法試驗(yàn)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到靈芝孢子粉多糖提取率與液料比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=－45.66+1.03X1+0.85X2+4.88X3－7.00×10-4X1X2+0.03X1X3－0.02X2X3－0.03X12－4.89×10-3X22－0.87X32。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明該模型擬合度較好。

3）通過響應(yīng)面曲面及等高線分析可知，液料比（X1）對提取率影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而提取時(shí)間（X3）和提取溫度（X2）次之。三因素之間交互作用均顯著。

4）運(yùn)用此模型進(jìn)行對試驗(yàn)進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，最佳工藝條件為：液料比21.27∶1（mL/g）、提取溫度80.10℃、提取時(shí)間2.10 h，在此條件下預(yù)測多糖提取率為4.84%。

5）采用響應(yīng)面優(yōu)化條件靈芝孢子粉多糖提取試驗(yàn)，在此條件下實(shí)際提取率為4.81%，與理論值比較誤差為0.62%，相對誤差較小。因此應(yīng)用此模型得出的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

[1]張偉,曾園山.靈芝孢子的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2004,2 (6)：463-465

[2]趙東旭,楊新林,朱鶴孫,等．靈芝孢子研究進(jìn)展[J]．中草藥,1999,30 (4)：305-307

[3]黃智璇,歐陽蒲月．靈芝多糖降血糖作用的研究[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2008,4(8)：24-25

[4]吳鋒,孟國梁,楊麗云,等.靈芝多糖預(yù)防大鼠動脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,28(4)：251-252

[5]陳偉強(qiáng),黃際薇,羅利瓊,等.靈芝多糖調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖、血脂的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國老年學(xué)雜志,2005,25(8)：957-958

[6]曹琦珍,林樹錢,王賽貞,等.靈芝多糖肽對人肺癌細(xì)胞侵襲的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,39(6)：653-656

[7]周桂琴,趙宏艷,呂誠,等.靈芝多糖對H22肝癌小鼠腸道黏膜免疫功能的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,29(4)：335-339[8]任瑋,左麗,鐘志強(qiáng).赤靈芝孢子粉對老年小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009,25(8)：754-756

[9]奚瀕鏘,陳穎恒,潘艷宜.采用超高壓破碎靈芝孢子的研究[J].廣東化工,2007,34(7)：31-32

[10]吳映明,陳愛葵,彭錦紅,等.超聲波—超低溫凍融處理對靈芝孢子多糖提取的影響[J].中國食用菌,2008,27(3)：34-35

[11]夏志蘭,王春暉,姜性堅(jiān),等.靈芝孢子粉生物酶破壁技術(shù)的研究[J].食用菌學(xué)報(bào),2005,12(1)：14-18

[12]馬晶晶.高速離心剪切粉碎對靈芝孢子粉破壁及特性的影響[D].武漢：武漢理工大學(xué),2006

[14]羅立新,姚汝華.靈芝多糖生產(chǎn)工藝的研究[J].食品工業(yè)科技, 1996(6)：60-63

[15]于淑娟,高大維,李國基.超聲波酶法提取靈芝多糖的機(jī)理研究[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,26(2)：123-127

[16]胡斌杰,陳金鋒,王宮南.超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2007,28(2)：190-192

[17]HILLWJ,HUNTERWG.A revieWof response Surface Methodology：A LiteratureReview[J].Technometrics,1966(8)：571-590

[18]楊文雄,高彥祥.響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑,2005(2)：68-71

[19]張海容.沙棘化學(xué)成分與醫(yī)療應(yīng)用[M].太原：山西科學(xué)技術(shù)出版社,2009：46-48

[20]黃璞,謝明勇,聶少平,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研[J].食品科學(xué),2007,28(10)：200-203

[21]HOU X J,CHEN W.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible Bachu mushroom by response surfacemethodology[J].Carbohydrate Polymers,2008,72(1)：67-74

[22]王明艷,張小杰,王濤,等.響應(yīng)面法優(yōu)化香椿葉多糖的提取條件[J].食品科學(xué),2011,31(4)：106-110

[23]朱建飛,吳謀成,馮睿,等.菜籽粕中水溶性多糖提取工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2006,22(12)：251-254

[24]李艷,趙海燕,呂建寧.靈芝多糖提取工藝研究[J].中成藥,2006,28 (7)：1052-1054

[25]張志軍,劉建華,李淑芳,等.靈芝多糖含量的苯酚硫酸法檢測研究[J].食品工業(yè)科技,2006,27(2)：193-195

[26]李堅(jiān),劉東波,夏志蘭,等.分光光度法快速測定靈芝中多糖含量[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(2)：34-38

Optim ization of Extraction Process of Polysaccharide from Lucidum Spores Using Response Surface Analysis

FENGYan，MAWen-ting
（Departmentof Life Sciences，Luliang University，Luliang033000，Shanxi，China）

This paper concentrate on GLSPs，the optimum process parameters of extracting GLSPswere determined through single factor experiment，in which the three factors that influence the extraction yield ofGLSPs（including the ratioofwater tomaterial，theextraction temperatureand theextraction time）were controlled and tracked.At the same time，the response surfacemethod was used to optimize the three factors and lead to the optimized extraction processaswellas to determine the reliability and efficiency of thisoptimized process conditions.The single factor experiments showed that the optimized processofextracting GLSPswas as follows：the ratioofwater tomaterialwas20∶1（mL/g），theextraction temperaturewas80℃and theextraction timewas2 hours.Under such condition，the extraction yield of GLSPswas 4.78%；By using the response surfacemethod to optimize the processparameters，the optimized processofextracting GLSPswasas follows：the ratio ofwater tomaterialwas 21.27∶1（mL/g），the extraction temperature was 80.10℃and the extraction time was 2.10 hours.Undersuch condition，theextraction yield ofGLSPswas4.84%；To verify thismodel，themeasured resultwas4.81%，and the developed regressionmodel could experimentaldatawelland wasqualified.

lucidum spores；polysaccharide；responsesurfacemethodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.011

馮嫣（1986—），女（漢），助教，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。